本发明涉及一种酯化牛膝多糖的制备方法，属于医药领域。
背景技术
牛膝是我国传统常用中药材，其主要功能是“补肝肾，强筋骨，活血祛瘀，引血下行”等。现代研究表明牛膝多糖具有分子量小，免疫调节作用强，无残留、无毒副作用等优点，而牛膝多糖的酯化物则具有更强的免疫调节、抗病毒、抗肿瘤等活性，目前牛膝多糖的酯化研究多处于实验室合成，尚未有成熟的工艺来大规模生产。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种酯化牛膝多糖的制备方法，其得到的酯化牛膝多糖含量高，质量更好。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
一种酯化牛膝多糖的制备方法，包括以下步骤，
步骤a，取牛膝原料，提取粗多糖；
步骤b，采用比色法确定牛膝多糖的在所述粗多糖中的含量；
步骤c，用醋酸、氯磺酸和吡啶法对牛膝多糖进行酯化，最后得到酯化牛膝多糖。
本发明的进一步改进在于：在步骤a中提取粗多糖的方法包括以下步骤，
步骤a1，取干燥的川牛膝的根，并进行洗涤、切片、烘干和粗粉碎，得到牛膝药材粉末；
步骤a2，将牛膝药材粉末浸泡在乙醇溶液中2~4小时，去除色素和脂类；
步骤a3，通过蒸馏水回流提取牛膝多糖，并通过用三氯乙酸除蛋白2次；
步骤a4，加入无水乙醇至总体积的60%沉淀，将沉淀溶解后于50℃喷粉干燥得到粗多糖。
本发明的进一步改进在于：在步骤a1中牛膝药材粉末的粒度为24目，步骤a2中的乙醇溶液的浓度为60%~80%，所述牛膝药材粉末与乙醇溶液料液比为1:10。
本发明的进一步改进在于：步骤a3中提取温度为100℃，时间为8小时。
本发明的进一步改进在于：用醋酸、氯磺酸和吡啶法对牛膝多糖进行酯化的过程包括以下步骤，
c1，制备酯化试剂；
c2，对牛膝多糖酯化反应；
c3，对牛膝多糖酯化酯化后进行检验。
本发明的进一步改进在于：步骤c1中制备酯化试剂的方法包括以下步骤：
c11，取一定量的无水吡啶通过冰盐水预冷；
c12，逐滴加入氯磺酸和醋酸，其中氯磺酸和醋酸占总体积的10~20%，并在40min内加完；
c13，待溶液中出现大量的淡黄色固体时停止反应。
本发明的进一步改进在于：醋酸、氯磺酸与吡啶按比例为1：1∶2；反应时间为3小时，反应温度为45℃。
本发明的进一步改进在于：所述酯化反应的步骤包括：
c21，在酯化试剂中加入牛膝多糖粉末，通过95摄氏度沸水浴，恒温搅拌1小时，
c22，冷至室温；将反应液倾入一定量冰水中，并通过40%naoh调ph到7.5；
c23，加95%乙醇至醇含量为70%，静置24小时，离心并收集沉淀，将沉淀溶于水，装入透析袋中；
c24，用流动水透析72小时，蒸馏水透析12小时，冷冻干燥得完成。
由于采用上述技术方案，本发明所产生的有益效果在于：
本发明的的方法方法以提高多糖为有效成分的牛膝的利用率，探讨适用于畜禽养殖的牛膝多糖的质量要求，采用传统的水提醇沉的方法提取牛膝多糖中的可溶性多糖，喷雾干燥后进行酯化，试验结果表明，酯化牛膝多糖的制备工艺研究科学合理，此方法工艺简单可行，产品质量稳定。现有的方法中牛膝多糖的纯度只能达到55%，而此方法纯度可达90.8%。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细说明：
在一个实施例所述的一种酯化牛膝多糖的制备方法，包括以下步骤，
步骤a，取牛膝原料，提取粗多糖；
步骤b，采用比色法确定牛膝多糖的在所述粗多糖中的含量；
步骤c，用醋酸、氯磺酸和吡啶法对牛膝多糖进行酯化，最后得到酯化牛膝多糖。
在一个优选的实施例中，在步骤a中提取粗多糖的方法包括以下步骤，
步骤a1，取干燥的川牛膝的根，并进行洗涤、切片、烘干和粗粉碎，得到牛膝药材粉末；
步骤a2，将牛膝药材粉末浸泡在乙醇溶液中2~4小时，去除色素和脂类；
步骤a3，通过蒸馏水回流提取牛膝多糖，并通过用三氯乙酸除蛋白2次；
步骤a4，加入无水乙醇至总体积的60%沉淀，将沉淀溶解后于50℃喷粉干燥得到粗多糖。
在一个优选的实施例中，在步骤a1中牛膝药材粉末的粒度为24目，步骤a2中的乙醇溶液的浓度为60%~80%，所述牛膝药材粉末与乙醇溶液料液比为1:10。步骤a3中提取温度为100℃，时间为8小时。
在一个具体的实验中，具体步骤如下，选取川牛膝根洗涤、切片、烘干、粗粉碎，制成牛膝干粉。精密称取干粉500g，每份50g，按上述试验方法进行试验。牛膝药材粉末先浸泡于80%乙醇中2-4h，除去药材中的色素和脂类，然后按上述试验设计进行试验，用蒸馏水回流提取牛膝多糖，取滤液减压蒸馏，用三氯乙酸法除蛋白2次，加入无水乙醇至总体积的60%沉淀，将沉淀溶解后于50℃喷粉干燥得牛膝多糖粗品，计算多糖得率。得到如下表。
精密吸取对照品溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4ml，分别定容于25ml容量瓶中，摇匀。精密吸取上述各浓度对照品溶液2.0ml，分别加入5%苯酚溶液1ml，浓硫酸5ml，混匀，沸水浴15min，冷却至常温。另以蒸馏水2ml同上操作制得空白溶液，于485nm波长处测定吸收度。以吸收度(a)为纵坐标、葡萄糖浓度(c)为横坐标绘制标准曲线，得回归方程为y=51.476x+0.0256(r2=0.9951)。结果表明，葡萄糖检测浓度在0.002~0.016mg/ml范围内与吸收度呈良好的线性关系。
供试品溶液的制备：取牛膝多糖20mg，精密称定，置于50ml容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，即得5%苯酚溶液的制备：称取苯酚30mg，铝粉0.4g，碳酸氢钠2.0g，混合，油裕蒸馏，空气冷却，收集180~182℃的馏分。将此馏分配成80%苯酚溶液，置于冰箱中保存，临用前稀释成5%的溶液。
对照品溶液的制备：精密称定105℃干燥至恒重的葡萄糖30mg，置于50ml容量瓶中，以蒸馏水定容，即得对照品溶液(0.6mg/ml)。精密称取牛膝多糖粗品20mg，定容至50ml容量瓶，取2.4ml定容至25ml（重复3次），再精取2ml，加5%苯酚1ml，浓硫酸5ml，混匀显色（重复3次），注意做一溶剂空白对照。加热煮沸15min，冷却，于波长485nm处测定其吸光度值。根据回归方程计算多糖含量（校正因子为0.9）。多糖含量=(稀释倍数×稀释后多糖浓度)/0.9。
其中，4个因素对牛膝多糖得率的影响由大到小依次为：乙醇浓度＞提取温度＞提取时间＞料液比，料液比影响因素最小，为了节省水、电、乙醇等资源，降低生产成本等综合考虑，采用1:10的料液比，60%乙醇更为实际。故牛膝多糖的最优提取工艺为a3b3c2d2，即温度100℃，提取时间8h，料液比1:10，乙醇浓度60%
在一个实施例中，步骤c中，用醋酸、氯磺酸和吡啶法对牛膝多糖进行酯化的过程包括以下步骤，
c1，制备酯化试剂；
c2，对牛膝多糖酯化反应；
c3，对牛膝多糖酯化酯化后进行检验。
其中，步骤c1中制备酯化试剂的方法包括以下步骤：
c11，取一定量的无水吡啶通过冰盐水预冷；
c12，逐滴加入氯磺酸和醋酸，其中氯磺酸和醋酸占总体积的10~20%，并在40min内加完；
c13，待溶液中出现大量的淡黄色固体时停止反应。
在一个优选的实施例中，醋酸、氯磺酸与吡啶按比例为1：1∶2；反应时间为3小时，反应温度为45℃。
在一个优选的实施例中，所述酯化反应的步骤包括：
c21，在酯化试剂中加入牛膝多糖粉末，通过95摄氏度沸水浴，恒温搅拌1小时，
c22，冷至室温；将反应液倾入一定量冰水中，并通过40%naoh调ph到7.5；
c23，加95%乙醇至醇含量为70%，静置24小时，离心并收集沉淀，将沉淀溶于水，装入透析袋中；
c24，用流动水透析72小时，蒸馏水透析12小时，冷冻干燥得完成。
在一个优选的实施例中，离心的转速为2500r/min，时间为15分钟。
在一个具体的实验中，具体的步骤如下：
首先制备低温冰盐，碎冰用量每100g加nacl33g，浴温可达－21.3℃。因此尽量多加盐即可达到较低温度，保证实验需要。40%naoh，用于调节ph。
在一个实施例中，酯化的方法还可以是三氧化硫-吡啶法。具体如下：
准确称取三氧化硫-吡啶混合物1g，溶于20ml吡啶(使用前用3a分子筛脱水)中，搅拌溶解，制备酯化试剂。准确称取100.0mg多糖样品，溶于60ml二甲基甲酰胺中，搅拌均匀分散于溶液中。将其与酯化试剂充分混合后，60℃水浴反应10h，待反应完全后加入50ml去离子水，冰浴冷却至0℃。余下步骤同醋酸、氯磺酸、吡啶法。
在一个实施例中，酯化的方法还可以是氨基磺酸法，具体的步骤如下：
准确称取氨基磺酸0.5g，溶于20ml吡啶中。称取多糖样品100mg，溶于60mldmf中，搅拌均匀。余下步骤同氯磺酸-吡啶法。
虽然已经参考优选实施例对本发明进行了描述，但在不脱离本发明的范围的情况下，可以对其进行各种改进并且可以用等效物替换其中的部件。尤其是，只要不存在结构冲突，各个实施例中所提到的各项技术特征均可以任意方式组合起来。本发明并不局限于文中公开的特定实施例，而是包括落入权利要求的范围内的所有技术方案。