一种双水相萃取分离纯化铁皮石斛多糖的方法与流程

本发明属于植物活性成分提取技术领域，具体涉及一种双水相萃取分离纯化铁皮石斛多糖的方法。

背景技术

石斛是兰科（orchidaceae）石斛属dendrobium多年生草本植物，是一种名贵稀有的中药材，素有“人间仙草”之称。医学经典《道藏》中称铁皮石斛为中华九大仙草之首，民间将其称为救命仙草。铁皮石斛dendrobiumofficinale，俗称铁皮枫斗，为我国特有的名贵药材。《本草纲目》、《中药大词典》等多部中国古代医学著作中都有铁皮石斛入药的记载。现代生物技术分析表明，石斛多糖和生物碱是石斛兰中最重要的药用有效成分。

石斛多糖具有较好的保健功能，有抗氧化、缓解疲劳、提高免疫力等功效。孙静平等利用放射性射线照射小鼠造成小鼠放射性损伤，通过喂食铁皮石斛颗粒探究铁皮石斛颗粒修复急性放射性损伤的机制。结果表明石斛颗粒能够提高dna在骨髓中的含量和淋巴细胞的转化能力。促使受射线照射小鼠淋巴细胞生成il-2，调节cd4⁺、cd8⁺细胞亚型保护t淋巴细胞。从而提高小鼠的免疫力。李莉娜通过构建半乳糖诱导小鼠衰老模型，探究铁皮石斛多糖的抗衰老作用，通过对模型小鼠以灌胃的方式给药铁皮石斛多糖溶液，连续5周给药后，对模型小鼠的学习能力进行检测，连续6周给药后检测小鼠的生化指标。结果显示铁皮石斛多糖能够改善小鼠的记忆功能，肝脏组织、脑组织、血液中sod和gsh-px活性增高，从而说明铁皮石斛多糖具有抗衰老的作用。郭婕等利用不同浓度梯度的铁皮石斛茶制剂溶液给小鼠灌胃，给药30天后测定小鼠的各项生化指标，结果显示铁皮石斛茶具有缓解疲劳的功效。

目前铁皮石斛多糖的提取方法主要有：传统热水浸提法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法、酶辅助提取法、闪提法、湿法超微粉碎辅助提取法、超临界辅助提取法等。生产上常用的方法一是传统热水浸提法，二是超声波辅助热水浸提法。传统热水浸提法操作简单，对相关操作人员及设备仪器要求不高。李程程等通过正交实验优化传统热水浸提法提取提皮石斛多糖工艺，通过优化得到的最佳热水浸提工艺为：热水浸提温度为90℃、铁皮石斛质量与水的体积比为1:40，重复提取3次，铁皮石斛多糖的提取率为24.6%。超声波作为一种简便、有效的辅助提取方法在天然活性成分提取中得到广泛应用，借助超声波的空化作用和机械作用促进有效成分的溶出。叶余原通过运用超声波辅助提取的方法对铁皮石斛多糖的提取工艺进行优化，得到超声波辅助提取铁皮石斛多糖的最佳工艺：最佳超声波频率为45khz，最佳超声波水提提取温度为50℃，提取时间为1.5h，铁皮石斛质量与水的体积比为1:30，此条件下铁皮石斛多糖的提取率为15.3%。石斛多糖提取中，为了得到纯多糖，需要在制得粗多糖后用sevag法去除蛋白质杂质。

技术实现要素：

本发明为了解决现有石斛多糖提取中存在着使用有安全隐患的有机溶剂作为萃取剂纯化混杂在多糖中蛋白质的问题，提供了一种双水相萃取分离纯化铁皮石斛多糖的方法。

本发明由如下技术方案实现的：一种双水相萃取分离纯化铁皮石斛多糖的方法，铁皮石斛茎秆30-41℃烘干，粉碎至50-100目；铁皮石斛粉末按照料液比为1:50溶解于活化水中，控制超声波处理温度为35-41℃，250w超声波处理铁皮石斛溶液2次，每次20-30min；2次超声提取液合并，用乙醇沉淀，终浓度为80%；获得的沉淀用浓度为80%乙醇洗涤两次，并用活化水加热溶解，用peg/硫酸铵混合溶液去除混在粗多糖中的蛋白质；其中peg选用分子量为2000-6000，peg的加入量为3-5g/20ml，硫酸铵的加入量为3-7g/20ml。

沉淀浸提液的乙醇终浓度为70%-90%；具体沉淀方法为：按比例在浸提液中加入浓度为95%的乙醇摇匀，4℃冷藏12h，取出后4000r/min离心20min，留沉淀，沉淀用80%乙醇洗涤2次。所述peg/硫酸铵混合溶液去除混在粗多糖中的蛋白质的温度为35-41℃，搅拌使固体溶解，后置旋涡振荡器混匀，静置40min，置高速离心机6000r/min离心6min。所述peg/硫酸铵混合溶液去除混在粗多糖中的蛋白质中，优选：peg分子量为6000，peg的添加量为3g/20ml，硫酸铵的添加量为5g/20ml。

所述活化水的制备方法为：将蒸馏水用日本株式会社フクロウ产“富士の水精”处理3h制成活化水。

与传统的水提法相比，本发明所述方法显著提高了多糖得率，并在整个提取过程中避免使用有毒性的有机溶剂。传统石斛多糖水提法（包括超声波提取法）提取方法中都使用sevage法去除混杂在多糖中的蛋白质。在sevage法中，以正丁醇、氯仿混合溶液，去除混杂在多糖溶液中的蛋白质杂质。氯仿是一种有中等毒性的化学试剂，其可经消化道、呼吸道、皮肤接触进入机体，主要急性毒性作用是对中枢神经系统有麻醉作用，对眼及皮肤有刺激作用，并能损害心脏、肝脏、肾脏等。氯仿被国际癌症研究中心列为人体可疑致癌物。因此，使用sevage法脱蛋白会给石斛多糖制备带来安全隐患。以peg/无机盐组成的双水相溶剂，去除混杂在石斛多糖中的蛋白质杂质。实现了石斛多糖的安全提取。

本发明所述方法分离纯化铁皮石斛多糖，避免了使用有毒的氯仿纯化粗多糖，不仅提取率、纯度大幅度提高，纯度可以达到90-95%。提取率是常规热水浸提法和超声波法提取率的177-187%。体外抗氧化功能实验证明，该方法提取得到的多糖，具有明显的清除dpph自由基能力、清除羟基自由基能力，具有显著的抗氧化能力。本发明不仅提供了一种高效、安全的石斛多糖制备方法，而且也可为其它植物多糖的制备方法提供借鉴。

附图说明

图1为不同浓度铁皮石斛多糖体外抗清除羟基自由基能力检测结果图。

具体实施方式

本发明实施例所用铁皮石斛鲜条购于温州昆富铁皮石斛有限公司。

实施例1：一种双水相萃取分离纯化铁皮石斛多糖的方法，铁皮石斛茎秆30-41℃烘干，粉碎至50-100目；准确称取铁皮石斛粉末0.3g，按照1:50料液比加入用“富士の水精”处理过的活化水15ml；溶液温度保持在35-41℃，250w超声波处理2次，每次20-30分钟；将2次提取液合并定容至100ml容量瓶中，摇匀，准确量取提取液2ml置于10ml离心管中，准确加入95%乙醇8ml，摇匀，4℃冷藏12h，取出后4000r/min离心20min，弃上清留沉淀，沉淀用80%乙醇洗涤2次，每次加8ml80%乙醇，将沉淀加热溶解于活化水中，定容至50ml容量瓶中，摇匀即得粗多糖溶液。对照按照1:50料液比加入蒸馏水，不加超声波处理，仅用35-41℃热水提取2次。其余步骤同实施例1所述步骤。

对照2：按照1:50料液比加入蒸馏水，直接用超声波法进行提取，超声条件同实施例1所述超声条件，然后提取液准确量取提取液2ml置于10ml离心管中，准确加入去离子水8ml，摇匀，4℃冷藏12h，取出后4000r/min离心20min，弃上清留沉淀，沉淀用80%乙醇洗涤2次，每次加8ml80%乙醇，将沉淀加热溶解，定容至50ml容量瓶中，摇匀即得粗多糖溶液。

标准曲线的制定及粗多糖提取率的测定：精密量取1ml上述三种制备方法得到的多糖溶液，分别置15ml具塞试管中按照硫酸-苯酚法测定溶液吸光度值，计算铁皮石斛粗多糖的提取率，计算公式为：铁皮石斛粗多糖提取率%（g/g）=铁皮石斛多糖质量/铁皮石斛粉末质量×100%。

硫酸-苯酚法测定多糖的含量，将葡萄标准品置烘箱烘至恒重，准确称取0.09g，配制成0.9mg/ml葡萄糖溶液，然后稀释10倍得90µg/ml葡萄糖标准溶液。准确量取葡萄糖标准液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，分别置10ml具塞试管中，将各具塞试管补水至1.0ml，向各具塞试管中加入5%苯酚溶液（现配现用），摇匀，再加入5ml浓硫酸，摇匀，90℃水浴20min，然后取出后冰浴冷却5min，在488nm波长处测定吸光度值，以葡萄糖溶液浓度为纵坐标，吸光度值为横坐标，绘制标准曲线。对照组用蒸馏水进行上述操作处理。

用同样的方法测定铁皮石斛粗多糖在488nm波长处的吸光度值，根据绘制的标准曲线确定铁皮石斛多糖质量，并计算多糖提取率。

按照上述铁皮石斛粗多糖提取方法，提取得到铁皮石斛粗多糖，结果见表1。从表1可以看出，本发明方法与传统水提法和超声波提取法相比，可以显著提高多糖提取率。

表1不同提取方法得到的铁皮石斛提取率%

双水相萃取纯化铁皮石斛多糖：取过筛石斛粉5g，按料液比1：50加入活化水，搅拌使粉末均匀分散，35-41℃下250w超声波处理30min，离心取上清液并重复以上操作一次。合并两次获得的上清液并将其定容至500ml容量瓶中备用。使用双水相萃取方法去除蛋白质、色素等杂质。取20ml多糖溶液，按照表2的设计，分别称取不同质量的peg和硫酸铵，搅拌使固体溶解，后置旋涡振荡器混匀，静置40min，置高速离心机6000r/min离心6min，分相后精确量取上下相体积，分别吸取上下相各1ml，稀释十倍，经苯酚-硫酸反应后于490nm下测定吸光值。其中peg分子量、peg的质量、硫酸铵的质量和萃取率见表2。

表2双水相组成和萃取率

用不同质量的peg/硫酸铵组成的双水相纯化铁皮石斛粗多糖，结果见表2。从表2可以看出，不同质量分数的peg/硫酸铵组成的双水相，萃取率不同。本实验中萃取率在80.08到93.3之间。当每20ml体系中加入peg60003g；硫酸铵5g时，萃取率最高为93.30%。

本发明所述方法获得的铁片石斛多糖清除羟基自由基的能力检测：用fenton反应体系产生•oh，用水杨酸显色法测定清除羟基自由基能力。分别精确量取0.2mg/ml,0.4mg/ml,0.6mg/ml,0.8mg/ml,1.0mg/ml铁皮石斛多糖待测夜1.0ml，然后分别依次加入1.0ml2mmol/mlfeso4溶液，1.0ml2mmol/mlh2o2溶液，混匀，室温反应10min，然后加入1.0ml2mmol/ml水杨酸溶液，混匀，37℃恒温反应30min。空白组用蒸馏水代替铁皮石斛多糖溶液，对照组用蒸馏水代替水杨酸溶液，510nm处测量吸光度值。清除率计算公式为：清除率（%）={[a0-(a样品-a对照)]/a0}×100%。

本发明所述方法获得的铁皮石斛多糖，采用不同浓度铁皮石斛多糖清除羟基自由基能力的测定，结果见图1。从图1可以看出铁皮石斛多糖具有较强的清除羟基自由基的能力，且具有剂量效应。