本发明属于细胞工程和基因工程技术领域，特别涉及一种zeb1在人心脏成纤维细胞中的应用。
背景技术
心肌梗死状动脉的血液流动不畅，心肌长时间缺氧、缺血而导致的局部心肌坏死。在心肌梗死发生的早期，细胞外基质合成和沉积能加强心脏的收缩力，形成瘫痕防止心脏破裂，在一定程度上改善心脏功能；但是在疾病的后期，由于细胞外基质的合成过多，在心脏组织中大量积累，导致心肌纤维化的发生。心脏成纤维细胞在心肌纤维化过程中大量增殖，同时分化为肌成纤维细胞，肌成纤维细胞合成大量胶原等成分堆积于心肌间，致使心肌组织中胶原纤维降解异常、各种胶原比例失衡和间质与血管周围的蛋白积累过度。因此，心脏成纤维细胞是心肌纤维化过程的重要效应细胞，它的功能改变能影响心肌纤维化进程。
锌指e盒结合的同源盒蛋白1(zincfingere-boxbindinghomeobox1，zeb1)位于人染色体10p11.2上，是非常重要的一种细胞核转录因子。tgf-β是重要的致纤维化因子，zeb1的基因结构上含有一个能与smad蛋白结合的区域，可与磷酸化的smad蛋白结合，从而促进tgf-β的活化转录。此结果说明，zeb1可能参与调控器官的纤维化过程。研究发现在肝纤维化的大鼠模型中静脉注射重组zeb1蛋白，he和masson染色结果显示，炎症与肝纤维化程度有所加重，纤维间距变宽，并且tgf-β表达水平上调，这些结果说明了zeb1也许可以通过激活化某些途径促进tgf-β的转录进而促进大鼠肝纤维化进程。
微小核糖核酸(microrna，mirna)是一类内源性非编码单链小分子rna，长度约为22个核苷酸，可通过与信使核糖核酸(messengerribonucleicacid，mrna)的3′非翻译区(untranslatedregion，utr)不同程度的互补配对，诱导靶基因mrna降解或抑制翻译，从而在转录后水平调控靶基因的表达。
技术实现要素：
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种zeb1在人心脏成纤维细胞中的应用。以确定zeb1对人心脏成纤维细胞功能的调节作用。
通过基因工程技术改变zeb1基因在成纤维细胞的表达量，进而影响成纤维细胞增殖、迁移、胶原合成与分化；通过生物信息学软件预测该基因靶向的mirna，研究该mirna的功能，来达到zeb1在人心脏成纤维细胞中应用的目的。
本发明的另一目的在于提供抑制zeb1基因的小干扰rna片段(sirna)。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明提供一种zeb1在人心脏成纤维细胞中的应用。
本发明提供抑制zeb1基因的sirna，序列如下：
si-zeb1-1：5'-ggcaaguguuggagaauaa-3'；
si-zeb1-2：5'-ccagaaauacacaggguua-3'；
si-zeb1-3：5'-ggacagcacaguaaaucua-3'；
本发明提供靶向zeb1基因的mirna，序列如下：
mir-590-3p：5'-uaauuuuauguauaagcuagu-3'；
在心脏成纤维细胞中补充抑制zeb1基因的小干扰rna片段后，能回复由mir-590-3p引起的细胞功能表型。
验证结果如下：
1、合成3对干扰zeb1基因的小片段/对照(si-zeb1/si-zeb1-nc)，转染干扰小片段到成纤维细胞中(转染浓度为50nm)，qrt-pcr检测其干扰效率，最终确定干扰效果较好的si-zeb1-2小片段进行后续实验。
si-zeb1-1：5'-ggcaaguguuggagaauaa-3'；
si-zeb1-2：5'-ccagaaauacacaggguua-3'；
si-zeb1-3：5'-ggacagcacaguaaaucua-3'；
2、干扰zeb1基因小片段(si-zeb1-2)转染心脏成纤维细胞，研究其对人心脏成纤维细胞增殖、迁移、分化与胶原合成的应用。通过edu法、transwell、qrt-pcr与westernblotting分别检测zeb1受到si-zeb1-2小片段干扰后心脏成纤维细胞增殖、迁移、分化与胶原合成情况，发现zeb1促进纤维细胞增殖与迁移，促进心脏成纤维细胞分化为肌成纤维细胞与合成ⅰ型与ⅲ型胶原。
3、通过targetscan、miranda、rnahybrid3个生物信息学软件预测调控zeb1的mirna，发现zeb1的3'utr区含有mir-590-3p结合位点，分别扩增zeb1的野生型3'utr区及与mir-590-3p种子区结合位点突变的突变型3'utr区，并将其连接到pmirglo真核表达载体中，通过双荧光素酶报告基因系统检测，发现zeb1野生型(wt-zeb1)3'utr上游报告基因活性受到mir-590-3p调控而表达量下降，而zeb1突变型(mut-zeb1)3'utr上游报告基因活性不受mir-590-3p调控。通过qrt-pcr与westernblotting验证，zeb1在蛋白水平受mir-590-3p调控(mir-590-3pmimic的转染浓度为25nm)。
4、zeb1回复mir-590-3p的功能验证。在心脏成纤维细胞中共转染mir-590-3pinhibitor与si-zeb1-2后，检测能否回复由mir-590-3p引起的细胞迁移改变。通过transwell检测结果显示，mir-590-3pinhibitor的促细胞迁移功能可以被si-zeb1-2回复。
本发明以zeb1为研究对象，采用细胞生物学方法研究其在人心脏成纤维细胞中的应用。关键点和欲保护点：(1)zeb1在人心脏成纤维细胞增殖、迁移、分化与胶原合成中的应用；(2)通过靶基因回复验证，即在心脏成纤维细胞中补充抑制zeb1基因的小干扰rna片段(si-zeb1-2)后，验证能否回复由mir-590-3p引起的细胞功能表型。
成纤维细胞的增殖、迁移、分化与合成胶原的能力是影响心肌纤维化的重要机制，本发明第一次证实zeb1在人心脏成纤维细胞中的应用。本发明补充si-zeb1-2能够回复由mir-590-3p引起的细胞功能表型，进一步表明zeb1在成纤维细胞中是mir-590-3p的一个重要功能靶标，mir-590-3p可以通过zeb1来调节人心脏成纤维细胞的功能。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明以zeb1为研究对象，合成zeb1干扰小片段，转染心脏成纤维细胞，发现zeb1促进心脏成纤维细胞增殖、迁移、分化与胶原合成，还通过控制其表达的mir-590-3p在心脏成纤维细胞中的功能来进行研究；本发明干扰zeb1后，验证能够回复由mir-590-3p引起的细胞功能表型，表明zeb1在心脏成纤维细胞中是mir-590-3p的一个重要功能靶标，mir-590-3p可通过zeb1来调节成纤维细胞的功能。本发明通过zeb1和其靶向的mirna在心脏成纤维细胞的应用，对于研究心肌梗死后的纤维化机制具有很好的应用价值。
附图说明
图1是qrt-pcr检测3对zeb1干扰小片段的干扰效率结果图。
图2是zeb1干扰小片段(si-zeb1-2)调控心脏成纤维细胞增殖。
图3是zeb1干扰小片段(si-zeb1-2)调控心脏成纤维细胞迁移。
图4是zeb1干扰小片段(si-zeb1-2)调控心脏成纤维细胞分化标志基因α-sma在心脏成纤维细胞中的表达；其中图4a是qrt-pcr结果；图4b是westernblotting结果。
图5是zeb1干扰小片段(si-zeb1-2)调控心脏成纤维细胞胶原合成标志基因col1a1、col3a1在心脏成纤维细胞中的表达；其中图5a是qrt-pcr结果；图5b是westernblotting结果。
图6是验证mir-590-3p靶向zeb1；其中图6a、图6b、图6c分别表示双荧光报告基因验证、qrt-pcr和westernblotting验证。
图7是zeb1回复mir-590-3p抑制心脏成纤维细胞迁移的结果。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。实施例中除特殊说明外，均为本领域常规试剂和方法步骤。
实施例1人心脏成纤维细胞的培养
本实验所用的细胞模型人心脏成纤维细胞来自来自美国sciencellresearchlaboratories。所用培养基为美国sciencellresearchlaboratories提供的心脏成纤维细胞培养基(fibroblastmedium-2)。
(1)实验前准备：a.打开水浴锅，调节温度35.8～37℃；b.超净台开紫外灭菌30min。
(2)从液氮中取出冻存管，迅速浸入37℃水浴锅中，并不时摇动使其尽快融化。
(3)从37℃水浴锅中取出冻存管，外部喷洒75％酒精后转移到超净台，小心打开盖子，用移液枪吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀。
(4)1000rpm，离心5min。
(5)弃上清，加入完全培养基重悬细胞，接种细胞培养瓶，37℃5％co2培养箱静置培养。
(6)24h后更换新的完全培养基，继续培养。
实施例2人心脏成纤维细胞的接种和转染
(1)镜下观察心脏成纤维细胞汇合度达到90％时，弃培养基，用预热的含1％双抗(双抗为青霉素和链霉素)的pbs清洗细胞两次；
(2)预热的0.25％胰酶加入培养瓶，放入培养箱中静置2min，显微镜下观察到细胞大部分细胞飘起时，加入终止液(10％fbs的dmem)终止消化。
(3)用枪头轻轻吹打细胞，制成细胞悬液，转移至15ml离心管，1000rpm离心5min。
(4)适量pbs清洗细胞两次。
(5)适量完全培养基重悬细胞沉淀，细胞计数后，均匀分布到每一个孔中，补足完全培养基至推荐的体积，放入培养箱中继续培养。
(6)24h左右观察细胞形态及汇合度，细胞形态良好且汇合度达到70％～90％时，可以用于转染。本发明取第3或第四代传代的心脏成纤维细胞进行转染，转染步骤参照invitrogen公司的
(7)转染后，细胞在37℃，5％co2培养箱中继续培养；
(8)根据实验目的，在转染后的2～4d收集细胞。
实施例3qrt-pcr
(1)冷pbs清洗贴壁细胞2～3次，倾斜细胞培养皿，吸净pbs，加入1ml的trizol，静置5min，直至镜下观察到细胞全部裂解后，用枪头吹打均匀并转移到1.5mlrnase-freeep管。
(2)每管加入200μl预冷氯仿(trizol组织液:氯仿为5：1)，剧烈震荡15～30s，冰上放置5min后，12000rpm，4℃，离心15min；液体分三层：上层为无色的rna，中层为含有酚-氯仿的白色水相，下层为浅红色。小心吸取上层无色液相(避免触及中间相)。将上层液相(约300μl)移入新的1.5mlep管中，加入等量异丙醇溶液(300μl)，轻轻上下颠倒摇匀10次，冰上静置10min。12000rpm，4℃，离心10min。
(3)弃上清、留沉淀，沿管壁加入预冷的1ml75％乙醇-depc以洗涤rna，12000rpm，4℃，离心5min后尽量去上清。
(4)将液体吸干，室温自然干燥5～10min，同时避免rna沉淀干燥过度。
(5)根据沉淀量，加入30～50μl的depc水以溶解rna沉淀。分光光度计测定rna浓度和纯度。
逆转录反应采用takara公司的primescripttmrtmastermix(perfectrealtime)kit。qrt-pcr分别采用thermo公司的sybrgreenqrt-pcrmastermix(2x)，roxsolutionprovidedmix。以2-△△ct法计算mrna与mirna的相对表达量。
本发明所用到的qrt-pcr引物为：
qrt-pcr-α-smaforward：5'-gacaatggctctgggctctgtaa-3'；
reverse：5'-ctgtgcttcgtcacccacgta-3'；
qrt-pcr-col1a1forward：5'-cccgggtttcagagacaacttc-3'；
reverse：5'-tccacatgctttattccagcaatc-3'；
qrt-pcr-col3a1forward：5'-aatcaggtagacccggacga-3'；
reverse：5'-tcgagcaccgtcattaccc-3'。
qrt-pcr-gapdhforward：5'-ggatttggtcgtattggg-3'；
reverse：5'-ggaagatggtgatgggatt-3'；
qrt-pcr-zeb1forward：5'-aacgcttttcccattctggc-3'；
reverse：5'-ttgccgtatctgtggtcgtg-3'；
实施例4westernblotting
(1)人心脏成纤维细胞总蛋白的提取
细胞转染后48h，用pbs清洗细胞3次，6孔板细胞每孔加入100～200μl蛋白裂解液进行蛋白质裂解，细胞裂解液转移到1.5mlep管中。12000rpm，4℃离心15min，取上清至新的1.5mlep管中，低温保存防止蛋白降解。
(2)sds-page电泳
bca法蛋白样品初步定量后，每组取20μg总蛋白和5×上样缓冲液按5：1混合，煮沸5min。sds-page电泳至溴酚蓝刚出胶底部止。
(3)转膜
甲醛浸泡聚偏二氟乙烯膜(pvdf膜)5min，清水冲洗后与吸附滤纸一起用转膜液浸泡。从正极开始依次按照吸附滤纸(4张)-凝胶-pvdf膜-吸附滤纸(4张)顺序叠放，合上负极。装入电泳槽中。转膜过程在冰上进行，恒流300ma，根据目的蛋白不同选择转膜时间。
(4)蛋白检测与结果分析
转膜完成后，将膜放入1×tbst中漂洗，用5％脱脂奶粉室温下封闭2h。1×tbst洗膜，用抗体稀释液稀释所需抗体，4℃孵育过夜。回收一抗(zeb1一抗；α-sma一抗；col1a1一抗；col3a1一抗；上述4个一抗均为常规市售产品)，1×tbst洗膜。室温孵育二抗(二抗：辣根过氧化物酶标记山羊抗兔igg-hrp，购置美国santacruz公司)2h。1×tbst洗膜。用ecl化学发光法进行检测，用bio-rad曝光系统曝光并采集图片。使用imagej进行电泳条带灰度值测定。
实验例5心脏成纤维细胞增殖实验
本发明中edu细胞增殖实验参照广州市锐博生物科技有限公司的cell-lighttmeduapollo567invitrokit进行。具体步骤如下(以96孔板为例)：
(1)用细胞培养基按1000：1的比例稀释edu溶液，制备适量浓度为50μm的edu培养基；
(2)每孔加入100μl浓度为50μm的edu培养基孵育2h，弃培养基；
(3)pbs清洗细胞1～2次，每次5min；
(4)每孔加入50μl细胞固定液(含4％多聚甲醛的pbs)室温孵育30min，弃固定液；
(5)每孔加入50μl浓度为2mg/ml甘氨酸，脱色摇床孵育5min后，弃甘氨酸溶液；
(6)每孔加入100μl的pbs，脱色摇床清洗5min，弃pbs；
(7)每孔加入100μl的1×apollo染色反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30min后，弃染色反应液；
(8)加入100μl渗透剂(0.5％tritonx的pbs)脱色摇床清洗2～3次，每次5min，弃渗透剂；
(9)用去离子水按100：1的比例稀释试剂f，制备适量1×hoechst3342反应液，避光保存；
(10)每孔加入100μl的1×hoechst3342反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30min后，弃染色反应液；
(11)每孔加入150μl的pbs清洗1～3次；
(12)每孔加入100μl的pbs保存待用；
(13)染色完成后，用荧光显微镜进行照片采集。
实验例6心脏成纤维细胞迁移实验
本发明使用试剂耗材：transwell细胞培养板(bd，ref353097)
(1)将细胞培养板放置于室温，pbs润洗培养板内细胞2次，去除培养板内pbs；
(2)加入不含edta的胰酶消化细胞，用100μl无血清细胞培养基重悬细胞，计数1×105个细胞，加入transwell细胞培养板的小室上室，下室加入600μl完全培养基；
(3)在37℃，5％co2孵育12～48h，取出小室，用棉签擦去上室的细胞，4％多聚甲醛固定细胞20min，pbs洗涤一次，结晶紫染色10min，pbs洗涤一次，显微镜下观察细胞是否穿过小孔，并拍照统计。
实验例7荧光素酶报告基因活性检测
按照promega公司的dual-
(1)5×plb室温解冻后，使用ddh2o按1：4的比例将其稀释成1×plb；
(2)移液枪吸出培养基。沿孔壁慢慢地加入200μl的pbs，轻轻晃动培养板，吸除pbs，此pbs清洗步骤重复两遍，全程注意动作轻柔，防止将细胞吸走；
(3)每孔加入100μl的1×plb；摇床上孵育10min，使细胞充分裂解；
(4)将裂解的细胞取75μl转移到96孔酶标板中，每孔加入75μl的larⅱ溶液，混匀后，摇床孵育10min；检测fireflyluciferase荧光强度；
(5)再加入75μl的stop&glo溶液，混匀后，摇床孵育10min；检测ranillaluciferase荧光强度；
(6)fireflyluciferase与ranillaluciferase的比值即为萤火虫荧光素酶相对活性。(每个组4个重复)。
结果分析：
1、合成3对干扰zeb1基因小片段/对照(si-zeb1/si-zeb1-nc)，利用qrt-pcr手段，检测上述片段转染到心脏成纤维细胞之后在细胞中的表达情况(转染浓度为50nm)。结果如图1所示，选择干扰效率最好的si-zeb1-2进行后续实验。后续统一将si-zeb1-2与si-zeb1-nc书写成sizeb1与nc。
si-zeb1-1：5'-ggcaaguguuggagaauaa-3'；
si-zeb1-2：5'-ccagaaauacacaggguua-3'；
si-zeb1-3：5'-ggacagcacaguaaaucua-3'；
上述干扰小片段由广州市锐博生物科技有限公司合成。
2、sizeb1转染到心脏成纤维细胞后，研究靶基因zeb1对心脏成纤维细胞功能的应用。edu结果如图2所示，sizeb1抑制心脏成纤维细胞增殖，即zeb1能够促进心脏成纤维细胞增殖。transwell结果如图3所示，sizeb1抑制心脏成纤维细胞迁移，即zeb1能够促进心脏成纤维细胞迁移。
3、sizeb1转染到心脏成纤维细胞后，qrt-pcr与westernblotting验证靶基因zeb1对心脏成纤维细胞分化标志基因α-sma的作用，结果如图4所示，与对照相比，sizeb1显著抑制α-sma在mrna与蛋白的表达，即zeb1能够促进心脏成纤维细胞中α-sma的mrna与蛋白的表达。
4、qrt-pcr与westernblotting验证靶基因zeb1对心脏成纤维细胞胶原合成标志基因col1a1与col3a1的作用，结果如图5所示，与对照相比，sizeb1显著抑制col1a1与col3a1在mrna与蛋白的表达，即zeb1能够促进心脏成纤维细胞中col1a1与col3a1的mrna与蛋白的表达。
5、利用生物信息学软件预测调控zeb1的mirna，发现zeb1的3'utr中含有mir-590-3p结合位点，将zeb1野生型3'utr和含有种子序列突变的3'utr构建到真核表达载体pmirglo中，通过双荧光素酶报告系统分析，发现zeb1野生型(wt-zeb1)3'utr上游报告基因活性受到mir-590-3p调控而表达量下降，而突变型(mut-zeb1)载体上报告基因活性则不受mir-590-3p调控(mir-590-3pmimic转染浓度为25nm)。通过qrt-pcr与westernblotting验证，zeb1在翻译水平受mir-590-3p的调控(mir-590-3pmimic转染浓度为25nm，mir-590-3pinhibitor转染浓度为50nm)，结果如图6所示。
6、zeb1回复mir-590-3p的功能验证。在心脏成纤维细胞同时共转染mir-590-3pinhibitor和sizeb1后，检测能否回复由mir-590-3p引起的细胞功能表型变化。通过transwell检测心脏成纤维细胞迁移情况，发现mir-590-3pinhibitor引起的促迁移功能可以被sizeb1回复，结果如图7所示。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>华南农业大学
广东省实验动物监测所
<120>zeb1在人心脏成纤维细胞中的应用
<160>14
<170>siposequencelisting1.0
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<211>19
<212>rna
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<220>
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ggcaaguguuggagaauaa19
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<212>rna
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<400>2
ccagaaauacacaggguua19
<210>3
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ggacagcacaguaaaucua19
<210>4
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<400>4
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