本发明提供一种采用crispr-cas系统针对表皮干细胞进行card3基因编辑，特别是涉及一种构建card3基因敲除的表皮干细胞细胞系的建立。
背景技术
表皮干细胞(epidermalstemcells，episcs)是具有自我增殖和多向分化潜能的干细胞，它的正常增殖和分化是维持皮肤及其附属器(汗腺毛发、皮脂腺)结构和功能完整性的基本要求。在生理条件下，表皮干细胞通过不对称分裂方式分化为一个干细胞和一个短暂扩充细胞(transitamplifyingcellsta细胞)，ta细胞再经过多次分裂后分化为有丝分裂后细胞(post-mitoticcells)及终末分化细胞(terminally-differentiatedcells)，以补充表皮细胞不断更新的需要。研究表明表皮干细胞不仅能在体外长期传代培养，并保持其增殖分化潜能(dunnwaldetal，expdermatol，2001，10：45-54.papinietal.stemcells，2003，21：481-494)，而且，在一定环境条件下还表现出与胚胎干细胞相似的分化潜能[liangetal，stemcells，2002：20：21-31]。因此，获得纯化的表皮干细胞不仅可为构建有生理功能的人工皮肤提供种子细胞，而且可用于基因治疗和转基因动物的生产。
人类多能干细胞(humanpluripotentstemcells,hpscs)和基因组编辑技术结合所建立的细胞模型，为疾病研究提供了一个独特的实验平台。利用这个平台体系，研究人员可以研究特定基因突变甚至染色体结构变异对人类多种细胞类型和组织器官功能的影响及其详细的分子机制，并可建立携带不同遗传突变的“个性化”疾病模型用于大规模药物筛选。该模型体系的建立得益于基因组编辑技术，尤其是crispr/cas9(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/crispr-associatedproteins9,crispr/cas9)技术的飞速发展。
card3(caspaseactivat1nandrecruitmentdomain3)也被称作rip2，受体相互作用蛋白2(receptor_interactingprotein2)，属于rip家族成员，在多种组织中均有分布，是一个丝/苏氨酸蛋白激酶，介于激酶域和card域之间的媒介领域，最初在1998年由3个独立的研究小组筛选rip和card同源蛋白时发现的，card3分布于胞质内，在组织表达广泛，其mrna高表达于脾、外周血白细胞、胎盘、睾丸和心脏等组织中。card3在固有免疫、适应性免疫和炎症反应中起重要作用，并参与多种疾病发生。许多研究发现当感染细菌及病毒时，card3可介导nf-κβ的激活并引起炎症反应，尤其在n0d/rip2信号途径中，card3作为其下游因子引起宿主适当的免疫反应。card3的一个显著特征是其表达在转录水平以细胞特异的、时间依赖的方式被调控。card3的表达增加反应于细胞特异的刺激，包括细菌的肽聚糖和脂多糖。
cn103877576a公开一种caspase激活及募集结合域3(card3)基因在冠状动脉粥样硬化性心脏病中的功能和应用。本发明以card3基因敲除小鼠和心脏特异性card3转基因小鼠为对象，通过阻断小鼠心脏左冠状动脉前降支造成心肌梗死模型进行研究，结果表明与wt小鼠对比，card3基因敲除小鼠心脏梗死比例、心肌肥厚和纤维化的程度明显被抑制，心功能明显好转；而card3转基因小鼠与card3基因敲除小鼠表型相反。表明card3基因能够促进并加重冠状动脉粥样硬化性心脏病的发生发展，card3可作为药物靶标筛选治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病的药物，card3的抑制剂可用于制备治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病的药物。
基于表皮干细胞的多能性，为了研究敲除card3基因的表皮干细胞在心脏病治疗方面的功能，建立敲除card3基因的表皮干细胞细胞系变得尤为重要。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种敲除card3基因的表皮干细胞，有效克服了现有技术使用sirna进行干扰不能稳定遗传的技术缺陷。
为实现上述目的，本发明提供一种crispr-cas系统的靶标，根据card3的基因序列，设计的具体的sgrna如下：
card3-sgrna1：5’to3’agtagcaaatctgcaccaga
card3-sgrna2：5’to3’ataatgtatagtgtgtcaca。
为实现上述目的，本发明提供一种提高crispr-cas系统在表皮干细胞中敲除card3基因的方法，包括向宿主细胞中引入增效蛋白，所述增效蛋白escs-higher是由seqidno:1所示的核苷酸序列编码的蛋白质。
进一步地，所述增效蛋白包含a)或b)：
a)seqidno:1所示的核苷酸序列编码的蛋白质的多核苷酸序列；
b)seqidno:2所示的氨基酸序列。
更进一步地，提供一种在表皮干细胞中采用crispr/cas9进行基因编辑的系统，其特征在于所述系统包括：(1)用于表达seqidno：1所述的escs-higher的质粒；(2)sgrna已经插入的表达px330的质粒(其可以表达sgrna和cas9)。
更进一步地，所述sgrna和cas9表达载体也可以是本领域常用的其他表达载体。
本发明提供了一种在表皮干细胞中采用crispr/cas9基因编辑card3的方法，本发明具有以下优点：
本发明提供了通过近百次的grna设计与优化，获得了在表皮干细胞中能够特异性的针对card3基因进行敲除的2个特意性的grna，具有较强的敲除效果，而且本发明在表皮干细胞中，构建了card3基因敲除的细胞系，筛选并优化获得了最佳的sgrna，敲除效率高，传代稳定。
附图说明
图1western-blot检测card3蛋白表达结果图；4为表皮干细胞空白对照；3为未导入增效蛋白的grna1的效果；1为导入增效蛋白的grna1的效果；2为导入增效蛋白的grna2的效果。
下面通过实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步说明本发明提高基因组编辑效率的方法的技术方案。
实施例1、crispr表达载体的构建
grna的设计
根据靶基因的基因序列，通过申请人前期从几十个grna中优化设计具体筛选得到具体的sgrna的形式如下：
card3-sgrna1：5’to3’agtagcaaatctgcaccaga
card3-sgrna2：5’to3’ataatgtatagtgtgtcaca
根据上述的grna，在其5'端加上cacc得到正向寡核苷酸序列，在其互补链的5'端加上aaac得到反向寡核苷酸序列，分别合成正向和反向寡核苷酸序列，然后将合成的序列变性、退火，得到具有bbsi粘性末端的双链dna片段，如下：正向：5’-caccnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn反向：nnnnnnnnnnnnnnnnnnnncaaa-5’，变性、退火体系为：2μl正向寡核苷酸链(50μm)2μl反向寡核苷酸链(50μm)46μll*nebbuffer在pcr仪中按以下程序运行：90℃，4min；72℃，10min；37℃，22min；25℃，25min。
退火后的双链寡核苷酸链含有bbsi的粘性末端，直接与被bbsi酶切过的px330-u6-chimeric_bb-cbh-hspcas9(以下简称px330)载体进行连接，可以得px330-grna-cas9重组质粒。
酶切体系：水39.3μl，10*fdbuffer5μl，bbsi2μl，px3303.7μl(2μg)37℃水浴2h酶切后的质粒直接用胶回收试剂盒回收。
连接体系：退火产物0.5μl，线性化的px330质粒2μ1，5*ligationbuffer2μl，t4dnaligase(3units/μ1)，1μl，水4.5μl，16℃水浴2h将上述步骤得到的连接产物转化jm109感受态细胞，涂布于amp+的lb平板，挑取阳性克隆接菌，37℃摇床摇菌过夜，质粒抽提试剂盒提取质粒并进行测序鉴定，得到px330-grna质粒。
实施例2克隆增效蛋白escs-higher及构建载体
克隆增效蛋白escs-higher基因，通过全基因合成的方法，获得seqidno：1所述的基因序列，以该序列为模板，根据上下游引物序列分别为5'-atgatatactttattagaat-3'，5'-tcaagggatttccatttctc-3'，引物和全基因组由上海生工有限公司合成。pcr反应扩增escs-higher基因目的基因片段，扩增反应体系如下:95℃、40s，57℃、1min，72℃、1min，72℃、10min，循环35次，pcr产物由上海生工有限公司进行测序，通过测序，结合与seqidno：1完全匹配。随后，将pcr扩增的目的基因连接在空载体慢病毒载体phiv-cs-cdf-cg-pre上，通过pcr扩增、酶切、测序等方法鉴定重组慢病毒载体。结合证明重组慢病毒载体构建成功。随后将该重组慢病毒载体质粒同辅助质粒一起共感染表皮干细胞(escs)(按照cn1253558c中权利要求1的方法分离培养获得)，通过重组而包装成能表达escs-higher基因的表皮干细胞。通过pcr筛选鉴定，将稳定转染的干细胞用于后续基因编辑应用。
实施例3crispr/cas9在表皮干细胞中的应用分析
将实施例1制备的sgrna表达质粒，公知的cas9表达质粒共转染表皮干细胞。采用脂质体转染法将构建好的转染表皮干细胞转染体系及试剂使lipofectaminetm2000(invitrogen公司)，转染详细步骤参照转染说明书。以未转染实施例2的增效基因的干细胞作为阳性对照。
实施例4western-blot检测card3蛋白表达情况
1.总蛋白提取
培养细胞裂解
(1)将表皮干细胞贴壁细胞，去除培养液，用pbs洗一遍，悬浮细胞，离心收集，pbs洗一遍。
(2)通常每106个细胞可加0.1mlripabuffer，裂解液和细胞充分接触。
(3)冰上放置数分钟，用枪头轻轻吹打，使细胞充分裂解，再轻轻倾斜培养皿使裂解产物流向瓶皿的一边或一角，然后将之转移到1.5ml离心管，剧烈振荡30秒。
(4)12,000×g，4℃离心5分钟，取上清，即可进行后续的电泳、western或免疫沉淀操作。
组织块裂解
(1)组织剪切成细小的碎片。每100毫克组织加入1mlripa裂解液。用玻璃匀浆器匀浆上下手动匀浆20次。
(2)将匀浆物转移到1.5ml离心管。
(3)12,000×g，4℃离心5分钟，取上清，即可进行后续的电泳、western或免疫沉淀操作。
2.蛋白浓度测定(bca测蛋白浓度)
工作液的配制
(1)测定前，按照bcareagenta:bcareagentb＝100:1的比例混合后配制成工作液，例如配制30ml的工作液时，在30ml的bcareagenta中添加0.3ml的bcareagentb后，充分振荡混配制后的工作液可在4℃保存三天使用。
(2)所需工作液量的计算方法如下：
所需工作液总体积(ml)＝[(bsa标准溶液8份或7份+检测样品数)×平行样本数(n)+1]×1个样品所需的工作液体积
例)标准操作流程【1ml反应体系】检测样品数为12个、平行样(n＝2)时：
[(8+12)×2+1]×1ml＝41ml
例)标准操作流程【200μl反应体系】、检测样品数为20个、平行样(n＝2)时：
[(8+20)×2+1]×0.2ml＝11.4ml
例)低浓度蛋白质样品测定的操作流程【1ml反应体系】、检测样品数为12个、平行样(n＝2)时：[(7+12)×2+1]×0.5ml＝19.5ml
3.低浓度蛋白样品的标准操作流程(定量范围：0～200μg/ml)
【0.2ml反应体系.使用微孔板测定】
1)bsa标准品溶液的配制。
(1)0.2mg/mlbsa标准品溶液的制备：取120μlbsastandardsolution(2mg/ml)，加入1,080μl稀释液后充分混合。
(2)按照不同的浓度稀释bsa标准品溶液，bsa标准品溶液和检测样品的稀释可使用去离子水、0.9％nacl或pbs。
2)bsa标准曲线的制备
(1)分别取100μl稀释后的bsa标准品溶液加入到微孔板中，每个浓度取2个平行样。
(2)加入100ul工作液后，立即混匀。
(3)37℃水浴槽中反应60分钟后，冷却至室温。
(4)使用分光光度计测定562nm处的吸光度值。测定时，使用1ml比色皿，用水校零。尽可能在20分钟内检测完毕所有样品。
(5)各浓度bsa标准品溶液的吸光度值减去blank值的平均值，绘制bsa标准品溶液的标准曲线。
3)检测样品的测定
检测样品测定时，建议同bsa标准品溶液同时进行测定。
(1)分别取100μl检测样品加入到微孔板中，每个样品取2个平行样进行测定。
(如果必要，也可选择与bsa标准品溶液相同的稀释方法稀释检测样品后测定)
(2)加入100μl工作液后，立即混匀。
(3)37℃水浴中反应60分钟后，冷却至室温。
(4)酶标仪波长设定在562nm处进行测定。用水校零。尽可能在20分钟内检测完毕所有样品。
(5)各样品溶液的吸光度值减去blank值的平均值，根据标准曲线计算出检测样品的蛋白浓度。
4.sds－page电泳
(1)玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。
(2)配制10％分离胶，加入temed后立即摇匀即可灌胶。
(3)当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
(4)配制4％的浓缩胶，加入temed后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。
(5)用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。(小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。)
(6)取出上样样品与5×sds上样缓冲液按4：1比例混合，混匀后沸水中煮5min使蛋白变性。
(7)加足够的电泳液后按等量蛋白上样。
(8)电泳，80v跑过浓缩胶后转换电压至120v，待溴酚兰跑到胶板底部刚好没有跑出即可。
(9)将夹子打开使黑的一面保持水平，在上面依次垫海绵垫、滤纸、胶、pvdf膜(经甲醇活化)、滤纸、海绵垫；同时将电泳液换成转移液。
(10)将电流调整到恒流200ma，转移约1小时。
(11)取出膜，并做好正反面标记，在tbst中清洗1分钟，然后用封闭液封闭。
(12)用封闭液将对应的一抗稀释成一定的浓度(1:500)，内参一抗的稀释终浓度为1：3000,然后温育1.5小时或4℃孵育过夜。
(13)用tbst清洗3次，每次5分钟。
(14)用封闭液将二抗稀释成一定的浓度(1:3000)，然后温育1.5小时。
(15)用tbst清洗4次，每次5分钟。
5.化学发光，显影，定影
(1)将a和b两种试剂在试管内等体积混合，然后加在pvdf膜的正面，温育大概2分钟。
(2)进入暗室，pvdf膜上盖一层保鲜膜，擦去多余的发光剂。将胶片压在保鲜膜上，依照发光的强度选择不同的曝光时间。
(3)将胶片放入显影液中，出现条带后，立即放入定影液中,流水冲洗胶片后晾干。
(4)对胶片进行扫描，然后用uvp凝胶图象处理系统labworks4.6软件分析目的条带的灰度值。
(5)通过western-blot对转染后表皮干细胞中card3蛋白质表达进行检测，结果如图1所示，表皮干细胞空白对照，蛋白表达没有受到影响；未导入增效蛋白的grna1能够敲除目的基因，蛋白表达能够较好的受到抑制，抑制率达到82.6％；而导入增效蛋白的grna1具有显著的提高基因敲除效果蛋白抑制率达到99.2％；导入增效蛋白的grna2的蛋白表达抑制率达到99.0％，效果同样极其显著。具有极好的应用前景和应用价值。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
序列表
<110>洛阳轩智生物科技有限公司
<120>表皮干细胞中采用crispr-cas系统进行card3基因敲除
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>2280
<212>dna
<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)
<400>1
atgatatactttattagaataatcatgggccagactgggaagaaatctgagaagggacca60
gtttgttggcggaagcgtgtaaaatcagagtacatgcgactgagacagctcaagaggttc120
agacgagctgatgaagtaaagagtatgtttagttccaatcgtcagaaaattttggaaaga180
acggaaatcttaaaccaagaatggaaacagcgaaggatacagcctgtgcacatcctgact240
tctgtgagctcattgcgcgggactagggagtgttcggtgaccagtgacttggattttcca300
acacaagtcatcccattaaagactctgaatgcagttgcttcagtacccataatgtattct360
tggtctcccctacagcagaattttatggtggaagatgaaactgttttacataacattcct420
tatatgggagatgaagttttagatcaggatggtactttcattgaagaactaataaaaaat480
tatgatgggaaagtacacggggatagagaatgtgggtttataaatgatgaaatttttgtg540
gagttggtgaatgcccttggtcaatataatgatgatgacgatgatgatgatggagacgat600
cctgaagaaagagaagaaaagcagaaagatctggaggatcaccgagatgataaagaaagc660
cgcccacctcggaaatttccttctgataaaatttttgaagccatttcctcaatgtttcca720
gataagggcacagcagaagaactaaaggaaaaatataaagaactcaccgaacagcagctc780
ccaggcgcacttcctcctgaatgtacccccaacatagatggaccaaatgctaaatctgtt840
cagagagagcaaagcttacactcctttcatacgcttttctgtaggcgatgttttaaatat900
gactgcttcctacatcgtaagtgcaattattcttttcatgcaacacccaacacttataag960
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tctgaagcaaattctcggtgtcaaacaccaataaagatgaagccaaatattgaacctcct1320
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tatgacaatttctgtgccattgctaggttaattgggaccaaaacatgtagacaggtgtat1440
gagtttagagtcaaagaatctagcatcatagctccagctcccgctgaggatgtggatact1500
cctccaaggaaaaagaagaggaaacaccggttgtgggctgcacactgcagaaagatacag1560
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cagccttgtgacagttcgtgcccttgtgtgatagcacaaaatttttgtgaaaagttttgt1680
caatgtagttcagagtgtcaaaaccgctttccgggatgccgctgcaaagcacagtgcaac1740
accaagcagtgcccgtgctacctggctgtccgagagtgtgaccctgacctctgtcttact1800
tgtggagccgctgaccattgggacagtaaaaatgtgtcctgcaagaactgcagtattcag1860
cggggctccaaaaagcatctattgctggcaccatctgacgtggcaggctgggggattttt1920
atcaaagatcctgtgcagaaaaatgaattcatctcagaatactgtggagagattatttct1980
caagatgaagctgacagaagagggaaagtgtatgataaatacatgtgcagctttctgttc2040
aacttgaacaatgattttgtggtggatgcaacccgcaagggtaacaaaattcgttttgca2100
aatcattcggtaaatccaaactgctatgcaaaagttatgatggttaacggtgatcacagg2160
ataggtatttttgccaagagagccatccagactggcgaagagctgttttttgattacaga2220
tacagccaggctgatgccctgaagtatgtcggcatcgaaagagaaatggaaatcccttga2280
<210>2
<211>759
<212>prt
<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)
<400>2
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151015
glulysglyprovalcystrparglysargvallysserglutyrmet
202530
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210215220
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<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)
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