本发明涉及肿瘤免疫治疗
技术领域：
，具体涉及一种敲减人trac或trbc基因的sirna、慢病毒载体、car-t细胞构建方法及应用。
背景技术：
当前，嵌合抗原受体t细胞免疫疗法(car-t)已经成为全球针对肿瘤治疗最具前景的疗法。car-t技术是通过将识别肿瘤相关抗原(tumor-associatedantigen，taa，是指一些肿瘤细胞表面糖蛋白或糖脂成分，它们在正常细胞上有微量表达，但在肿瘤细胞表达明显增高)的scfv(单链抗体可变区片段)、跨膜区片段(cd8、cd28)、胞内信号分子(cd3ξ)，共刺激因子(cd28、4-1bb、ox40)在体外进行基因重组，生成重组载体，再在体外通过转染技术转染到患者的t细胞，使患者t细胞表达嵌合抗原受体。转染后经过纯化和大规模扩增后的t细胞，也即car-t细胞，这些嵌合抗原受体修饰后的t细胞具备特异杀伤患者体内肿瘤细胞的能力。t细胞对肿瘤细胞具有很强的杀伤作用，在肿瘤免疫应答中起主要作用，但是肿瘤细胞表面的mhc(主要组织相容性复合物)在免疫编辑的过程中会出现表达下降的情况，这样长期形成的免疫逃逸机制能使肿瘤细胞成功躲避t细胞攻击，肿瘤快速增殖。car的修饰可使t细胞在获得靶向杀伤能力的同时获得更强的增殖及抗凋亡的能力，这种靶向杀伤的特异性来自于识别肿瘤相关抗原的单链抗体与其抗原的特异性结合，而不需要通过传统的抗原呈递免疫激活途径，从而克服肿瘤细胞通过下调mhc分子表达以及降低抗原递呈等免疫逃逸，打破宿主的免疫耐受。所以，它是针对肿瘤治疗的一种优势明显的精准医疗策略。以嵌合抗原受体t淋巴细胞(car-t)治疗手段在血液肿瘤的治疗上取得了重大突破，以cd19为靶点的免疫治疗，在治疗急性淋巴细胞白血病和复发和难治性大b细胞淋巴瘤适应症上，美国fda已批准诺华的kymriah和凯特的yescarta细胞治疗产品上市。tcr受体是t细胞表面特征性标志，它与cd3分子以非共价键结合，形成tcr-cd3复合物。tcr的主要功能是识别细胞表面抗原，它是由两条肽链构成异二聚体，α和β两条链组成tcrαβ受体分子，γ和δ两条链组成tcrγδ受体分子，每条链都包含v区(variable，可变区)、j区(joining，连接区)和c区(constant，恒定区)，此外β肽还包含d区(diversity，变异区)。tcr基因的多样性是由多个不连续的的v、d、j、c基因片段重排和核苷酸的随机插入、剪接、二次重排等获得。90％-95％的外周血t细胞仅表达tcrαβ受体分子。t细胞对异源抗原的识别，主要涉及mhc-抗原肽-tcr三类分子间的相互作用，直接制约了免疫系统的特性，包括应答特异性、mhc等位基因特异性、tcr受体库选择的特异性等。自体的car-t细胞治疗，主要是通过非mhc限制的方式，scfv单链抗体结合靶细胞表面的抗原分子后，信号传递至胞内，激活信号共刺激因子并激活t细胞的扩增，导致细胞因子或杀伤因子的释放，并募集多种免疫细胞和免疫分子共同杀伤肿瘤细胞。但是，由于异体t细胞上的tcr与受体患者mhc-抗原肽分子不匹配，在利用异体car-t治疗肿瘤患者时，极易出现移植物抗宿主病(graft-versus-hostdisease，gvhd)，对患者本身有很大的潜在风险。作为一种个体化的治疗手段，需利用病人自身的淋巴细胞在体外进行基因工程的改造，经过体外的扩增培养，使其具有靶向性的攻击肿瘤细胞的能力，再将一定数量的car-t细胞回输至患者体内，激活患者的免疫系统，进而杀死、限制肿瘤细胞的生长，最终战胜肿瘤。而进行基因工程改造的t淋巴细胞表面也表达有tcr受体，当表面有car和tcr两种受体的t细胞回输到人体中，一方面，依赖tcr识别某种抗原的t细胞会大量增殖并可能引起炎症等不良反应，另一方面，这些car-t细胞不能专一的进行肿瘤细胞的杀伤，影响整体的疗效。因此，敲除了t细胞受体trac或trbc基因的car-t细胞即可解决这两个问题，从理论设计原则上，保证car-t细胞能够特异性且专一地发挥肿瘤杀伤能力。cd19是参与b细胞活化与增殖的重要膜抗原之一，是所有b细胞共有的表面标志，b细胞活化后不消失，是最重要的b细胞标记因子，同时cd19也是b细胞表面的传达信号复合体的构成部分，cd19的细胞外部分同其他膜抗原结合进行信号传导。cd19阳性细胞升高见于b淋巴细胞系统的恶性肿瘤，如cd19在95％急性前b淋巴细胞白血病细胞和94％急性成熟b淋巴细胞白血病细胞表达，也见于慢性淋巴细胞性白血病和burkitt淋巴瘤等；cd19阳性细胞降低见于体液免疫缺陷病，如无丙种球蛋白血症、长期使用免疫抑制剂者等。故cd19检测可对上述疾病进行明确的病因诊断，并为鉴别诊断提供依据。此外由于cd19广泛存在于b淋巴细胞系统恶性肿瘤细胞表面，故可在白血病及淋巴瘤的免疫疗法中作为细胞表面的靶点。epcam属于单词跨膜i型糖蛋白，epcam基因位于人染色体2p21，基因长度14kbp，相对分子量40kda，其分子结构由胞外结构域、单次跨膜结构域和胞内结构3部分构成，其主要编码一种肿瘤相关抗原，多数表达与正常上皮细胞和上皮源性恶性肿瘤细胞。epcam参与调节细胞间粘附、迁移、增殖及信号传导。epcam的过表达导致wnt-β-连环蛋白信号通路这一经典的肿瘤信号通路的激活，通过wnt级联反应激活原癌基因e-myc和cyclina/e的表达，诱导细胞的增殖。多项研究证据表明，epcam在多种肿瘤组织中呈高水平表达，在肿瘤细胞的增殖中扮演着重要角色，因此epcam成为前列腺癌免疫靶向治疗的重要靶点。glypican-3(gpc3)蛋白为硫酸肝素糖蛋白家族成员之一，cpc3相对分子质量约为66×103，它富含一段包括14个半胱氨酸残疾的独特序列，在n末端有一种分泌型信号蛋白，c端通过与糖基磷脂酰肌醇共价结合而锚定于细胞膜上，且硫酸乙酰肝素链插入点的位置均由c端最末50个氨基酸决定，是该链靠近细胞膜。cpc3在在调控细胞生长和分化方面起重要作用，与肝癌的发生、发展密切相关，有报道称，肝癌组织中gpc3阳性率达到74.5％。所以gpc3在肝癌组织中特异性高表达的特性，可作为肝癌治疗的新靶点。技术实现要素：本发明解决的技术问题在于依赖tcr识别某种抗原的t细胞会大量增殖并可能引起炎症等不良反应，这些car-t细胞不能专一的进行肿瘤细胞的杀伤，影响整体的疗效。本发明是采用以下技术方案解决上述技术问题的：一种敲减人trac/trbc基因的sirna，所述敲减人trac基因的sirna序列如seqidno.1所示；所述敲减人trbc基因的sirna序列如seqidno.6所示。本发明还提供一种敲减人trac/trbc基因的sirna的慢病毒表达载体，所述敲减人trac基因的sirna的慢病毒表达载体包含如seqidno.1所示的sirna，所述敲减人trbc基因的sirna的慢病毒表达载体包含如seqidno.6所示的sirna。优选的，所述表达载体为携带实体瘤特异性抗原靶点的慢病毒表达载体。优选的，所述实体瘤特异性抗原靶点具体为：表皮生长因子受体3型突变体egfrvⅲ、epcam上皮细胞粘附分子、人表皮生长因子受体2her2、白介素13受体α2il13ra、癌胚抗原cea、间皮素msln、成纤维细胞激活蛋白fap、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3gpc3、卵泡刺激素受体fshr、人前列腺特异性膜抗原psma、神经节苷脂gd2。本发明还提供一种敲减人trac/trbc基因的sirna的慢病毒表达载体的构建方法，包括以下步骤：(1)携带实体瘤特异性抗原靶点的car基因的慢病毒表达载体的构建；(2)将敲减人trac/trbc基因的sirna序列克隆进入携带实体瘤特异性抗原靶点的慢病毒表达载体中；(3)敲减人trac/trbc基因的慢病毒表达载体的包装。优选的，所述实体瘤特异性抗原靶点具体为：表皮生长因子受体3型突变体egfrvⅲ、epcam上皮细胞粘附分子、人表皮生长因子受体2her2、白介素13受体α2il13ra、癌胚抗原cea、间皮素msln、成纤维细胞激活蛋白fap、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3gpc3、卵泡刺激素受体fshr、人前列腺特异性膜抗原psma、神经节苷脂gd2。本发明还提供一种敲减人trac/trbc基因的car-t细胞，所述car-t细胞是由如seqidno.1所示的sirna修饰的t淋巴细胞，由如seqidno.6所示的sirna修饰的t淋巴细胞。优选的，所述car-t细胞为携带实体瘤特异性抗原靶点的car-t细胞。优选的，所述实体瘤特异性抗原靶点具体为：表皮生长因子受体3型突变体egfrvⅲ、epcam上皮细胞粘附分子、人表皮生长因子受体2her2、白介素13受体α2il13ra、癌胚抗原cea、间皮素msln、成纤维细胞激活蛋白fap、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3gpc3、卵泡刺激素受体fshr、人前列腺特异性膜抗原psma、神经节苷脂gd2。本发明还提供所述car-t细胞在杀伤肿瘤细胞药物中的应用。本发明的有益效果在于：本发明通过设计一种敲减靶向嵌合抗原受体t细胞中trac或trbc基因的sirna，解决依赖tcr识别某种抗原的t细胞会大量增殖，并可能引起炎症等的不良反应，以及car-t细胞不能专一的进行肿瘤细胞的杀伤的难题，保证car-t细胞能够特异性且专一地发挥肿瘤杀伤能力。附图说明图1为pcdh载体图；图2为pcdh-u6-shrna-polya载体图谱；图3为cd19car基因设计图；图4为pcdh-cd19car-u6-shrna-polya载体图；图5为kdtrac/trbc-cd19.car-t细胞中trac/trbc蛋白表达的检测；图6为car-t细胞对cd19-k562细胞的杀伤活性；图7为epcam.car的基因设计图；图8为kdtrac/trbc-epcam.car-t细胞中trac/trbc蛋白表达的检测；图9为car-t细胞对ls174-t细胞的杀伤活性；图10为gpc3.car的基因设计图；图11为kdtrac/trbc-epcam.car-t细胞中trac/trbc蛋白表达的检测；图12为car-t细胞对hepg2细胞的杀伤活性。具体实施方式为使对本发明的结构特征及所达成的功效有更进一步的了解与认识，用以较佳的实施例对本发明进行详细的说明。本发明中所使用的试验材料，无特殊说明，均为常规生化试剂公司购买得到；本发明中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用主要材料的来源为：pcdh载体：购自addgene公司；notⅰ限制性内切酶：购自neb公司，产品货号为r0189；qiaquickpcrpurificationkit纯化试剂盒：购自qiagen公司，产品货号为28014；t4连接酶：购自neb公司，产品货号为m0202；混合质粒：购自sbi公司ppack-id，产品货号lv520a-1；ls174-t结肠腺癌细胞：购自中国科学院上海生科院细胞资源中心；hepg2细胞：购自中国科学院上海生科院细胞资源中心；琼脂糖：购自生工生物工程(上海)股份有限公司，产品货号为a600434；top10感受态细胞：购自中国食品药品检定研究院；293t细胞：购于美国菌种保藏中心atcc，产品目录号为crl-11268。实施例1(1)敲减人trac或trbc基因的以实体瘤特异性抗原为靶点的sirna的序列的设计利用设计网站https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/seq/search，分别获得五对针对trac基因特异性较好的序列，五对针对trbc基因特异性较好的序列。其中针对trac基因特异性较好的五对序列分别为：针对trbc基因特异性较好的五对序列分别为：其中选择如seqidno.1所述的核苷酸序列和如seqidno.6所述的核苷酸序列进行下述实验。(2)敲减人trac或trbc基因的sirna的序列的合成：①ecorⅰ-u6-shrna-polya-notⅰ基因片段的合成转录sirna的基因将使用u6启动子来启动，在u6启动子的前端加入ecorⅰ酶切位点，在polya序列末端后加入noti酶切位点，敲减人trac基因的转录sirna的基因如seqidno.11所示，敲减人trbc基因的转录sirna的基因或seqidno.12所示，该序列由南京金斯瑞公司进行合成。②pcdh-u6-shrna-polya载体的构建a.酶切将ecorⅰ-u6-shrna-polya-notⅰ基因片段和pcdh载体用ecorⅰ和notⅰ限制性内切酶进行酶切反应，37℃酶切30min后，酶切完成，所述反应条件如下表所示，所述pcdh载体图谱如图1所示：成分50μl反应体系pcdh载体1μg10×cutsmartbuffer缓冲液5μl(1×)ecori-hf1.0μlnoti-hf1.0μlnuclease-freewater定容至50μlb.对上述酶切产物进行纯化按照qiagen公司qiaquickpcrpurificationkit纯化试剂盒操作步骤对上述酶切产物进行纯化操作，得到带有酶切位点的pcdh-u6-shrna-polya的基因小片段和pcdh载体的大片段。c.pcdh-u6-shrna-polya基因小片段和pcdh载体的大片段的连接按照neb公司t4dnaligase操作步骤对上述片段进行连接，反应条件如下表所示，室温孵育10min后，65℃热灭活10min，取2-3μl连接产物转化top10感受态细胞。成分50μl反应体系t4dnaligasebuffer(10×)200ngpcdh-u6-shrna-polya基因小片段37.5ngpcdh载体的大片段50ngnuclease-freewater1μlt4dnaligase定容至20μld.pcdh-u6-shrna-polya载体的测序挑取克隆，使用u6通用引物测序，将正确插入了u6-shrna-polya片段的克隆摇菌并提取质粒，pcdh-u6-shrna-polya载体图谱如图2所示。(3)pbmc细胞的分离和培养①供者外周血的采集：肝素钠抗凝管采集健康供者100ml外周血后，4℃冷藏箱迅速将该外周血运送至gmp级别细胞生产车间。②pbmc细胞的分离：用100ml0.9％的生理盐水等比例稀释100ml外周血，20ml稀释后的外周血缓慢加入到盛有30ml淋巴细胞分离液(ficoll-paque)的50ml离心管中，400g室温离心30-40min。小心吸取分离液上方白膜层细胞，转移至新的50ml离心管中，并加入3倍体积的0.9％的生理盐水，移液管小心重悬管底部淋巴细胞，60-100g室温离心10min，去除上清液。再用8ml的0.9％的生理盐水，移液管小心重悬管底部淋巴细胞，60-100g室温离心10min，去除上清液。最后，用kbm581无血清培养基重悬底部细胞，转移至t175培养瓶中，在37℃5％co2条件下培养。③t细胞的激活和体外扩增a.t细胞的激活在37℃5％co2条件下培养的第二天加入biogems(货号：05121-25)克隆号为okt3的cd3单抗1μg/ml和biogems(货号：10311-25)克隆号为cd28.2的cd28单抗2μg/ml至t175细胞培养瓶中，继续放入37℃5％co2培养箱中培养。b.t细胞的体外扩增在培养第二天，加入200μg/ml的il-2，补加kbm581无血清培养基继续培养至第三天。实施例2(1)敲减(knockdown，kd)人trac或trbc基因的cd19靶点的car-t细胞的构建①pcdh-cd19car-u6-shrna-polya载体的构建cd19car基因是采用三代car的组成方式，包括：cd8α信号肽序列，可识别cd19分子的scfv片段，cd8跨膜区，共刺激分子cd137和cd28片段，cd3ζ片段组成。具体构成如图3所示，其序列如seqidno.13所示。在cd19car序列的5’端添加xbaⅰ酶切位点，cd19car序列的3’端添加ecorⅰ酶切位点，将上述cd19car序列用xbaⅰ和ecorⅰ限制性内切酶酶切后连入相同酶切后的pcdh-u6-shrna-polya载体中，连接产物使用感受态细胞top10转化后，挑取克隆，使用ef1α通用引物测序，将正确插入了cd19car片段的克隆摇菌并提取质粒，pcdh-cd19car-u6-shrna-polya载体如图4所示。②kdtrac/trbc+cd19car慢病毒的包装培养293t细胞进行慢病毒的包装，慢病毒包装体系为商业化的pcdh的慢病毒载体系统，包含1个pcdh-cd19car-u6-shrna-polya表达质粒与1个混合质粒，将慢病毒包装细胞系293t接种于含有dmem+10％fbs培养皿中，37℃，5％co2条件下过夜培养，贴壁率为70％-80％后进行转染。将pcdh-cd19car-u6-shrna-polya质粒载体与慢病毒包装质粒采用磷酸钙转染法共转染293t细胞，轻轻混匀，置37℃，5％co2培养箱中培养12h，加入7ml含10％fbs的dmem液体于细胞培养瓶，继续培养，72h后，收集上清。采用超速离心机12000g，4℃离心30min，去除细胞碎片，收获病毒后使0.45μm滤器过滤，再进行浓缩，即获得浓缩过的敲减trac或trbc基因的cd19car重组病毒液，于-70℃低温箱中保存备用。③kdtrac/trbc+cd19car慢病毒感染t细胞制备car-t细胞将步骤②中t细胞用kbm581无血清培养基调整细胞密度至1.0×106cell/ml，按照moi值为10的比例加入kdtrac/trbc+cd19car慢病毒，12h后换液，培养基为kbm581无血清培养基+200ng/mlil-2继续培养18天，每2天换半液。(2)kdtrac/trbc-cd19.car-t细胞中trac/trbc蛋白表达的检测按照上述方式培养cd19.car-t细胞，trac-cd19.car-t细胞，trbc-cd19.car-t细胞，通过计数取1×108个细胞来提取总蛋白；离心收集细胞，每106细胞加250μlripa(在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂)，振荡。冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解；12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。再进行蛋白质印迹实验(westernblot)以检测trac与trbc的表达量，通过与对照car-t细胞中trac与trbc的表达来验证两种t细胞受体亚单位的敲减效果，如图5所示，从图中可以看出trackd的cd19.car-t中的trbc蛋白的表达量正常，而trac的表达量经过分析降低到cd19.car-t细胞的13.5％，trbckd的cd19.car-t中的trac蛋白的表达量正常，而trbc的表达量经过分析降低到cd19.car-t细胞的18.3％。trbc-cd19.car-t或trac-cd19.car-t细胞中的trbc或trac有少许残留可能来自于少量未被慢病毒感染的t细胞。(3)trac/trbckdcd19.car-t细胞有效性验证a.分别培养cd19+k562细胞和pbmc细胞；b.实验开始前4天，moi＝10的cd19.car、trackd-cd19.car、trackd-cd19.car的慢病毒感染pbmc细胞，培养72-96h后可安排开始实验；c.收集靶细胞(cd19+k562)5×105cells和效应细胞(cart细胞))3×106cells，800g，6min离心，弃上清；d.用1ml1×pbs溶液分别重悬靶细胞和效应细胞，800g，6min离心，弃上清；e.重复步骤3一次；f.用700μl培养基(1640培养基+10％fbs)重悬效应细胞，用2ml培养基(1640培养基+10％fbs)重悬靶细胞；g.设置效靶比为20:1，10:1，5:1的实验孔，并设置对照组，每组3个复孔；h.250×g，5min平板离心；i.37℃5％co2培养箱中培养4h；j.250×g，5min平板离心；k.取每个孔的50μl上清到新96孔板中，并且每孔加入50μl底物溶液(避光操作)；l.避光孵育25min；m.每孔加入50μl终止液；n.酶标仪检测490nm吸光度；o.将3个复孔取平均值；将所有实验孔、靶细胞孔和效应细胞孔的吸光值减去培养基背景吸光值的均值；将靶细胞最大值的吸光值减去体积校正对照吸光值的均值；p.将步骤15中获得的经过校正的值带入下面公式，计算每个效靶比所产生的细胞毒性百分比。杀伤效率＝(实验孔-效应细胞孔-靶细胞孔)/(靶细胞最大孔-靶细胞孔)×100％结果如图6所示，t细胞对k562靶细胞的杀伤效率在不同效靶比条件下都比较低，而cd19car-t，trac-cd19.car-t与trbc-cd19.car-t细胞对靶细胞的杀伤效果都随着效靶比的提高而增加，并且cd19car-t作为对照，trac-cd19.car-t与trbc-cd19.car-t细胞的杀伤能力与其没有显著差异，因此，trac/trbc的敲除并没有改变cd19.car-t细胞对靶细胞的杀伤能力。实施例3(1)敲减人trac或trbc基因epcam靶点的car-t细胞的构建敲减人trac或trbc基因的epcam.car-t细胞的构建方法和流程与实施例2相同。本实施例与上述实施例中构建方法的不同之处在于：epcam靶点的scfv片段序列基于四川大学的抗-epcam抗体的专利(专利号：cn107602703a)所公布的抗体，所述序列如seqidno.14所示，epcam.car的基因设计图如图7所示。(2)kdtrac/trbc-epcam.car-t细胞中trac/trbc蛋白表达的检测①培养epcam.car-t细胞，trac-gpc3.car-t细胞，trbc-epcam.car-t细胞，通过计数取1×108个细胞来提取总蛋白。②离心收集细胞，每106细胞加250μlripa(在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂)，振荡。冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。③12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。再进行蛋白质印迹实验(westernblot)以检测trac与trbc的表达量，通过与对照car-t细胞中trac与trbc的表达来验证两种t细胞受体亚单位的敲减效果，如图8所示，从图中可以看出trackd的epcam.car-t中的trbc蛋白的表达量正常，而trac的表达量经过分析减少到epcam.car-t细胞的14.5％，trbckd的epcam.car-t中的trac蛋白的表达量正常，而trbc的表达量经过分析降低到epcam.car-t细胞的11.5％。trbc-epcam.car-t或trac-epcam.car-t细胞中的trbc或trac有少许残留可能来自于少量未被慢病毒感染的t细胞。(3)trac/trbckd-gpc3.car-t细胞有效性验证a.分别培养ls174-t结肠腺癌细胞和pbmc细胞；b.实验开始前4天，moi＝10的epcam.car、trackd-epcam.car、trackd-epcam.car的慢病毒感染pbmc细胞，培养72-96h后可安排开始实验；c.收集靶细胞(els174-t结肠腺癌细胞)5×105cells和效应细胞(cart细胞)3×106cells，800g，6min离心，弃上清；d.用1ml1×pbs溶液分别重悬靶细胞和效应细胞，800g，6min离心，弃上清；e.重复步骤3一次；f.用700μl培养基(1640培养基+10％fbs)重悬效应细胞，用2ml培养基(1640培养基+10％fbs)重悬靶细胞；g.设置效靶比为20:1，10:1，5:1的实验孔，并设置对照组，每组3个复孔；h.250×g，5min平板离心；i.37℃5％co2培养箱中培养4h；j.250×g，5min平板离心；k.取每个孔的50μl上清到新96孔板中，并且每孔加入50μl底物溶液(避光操作)；l.避光孵育25min；m.每孔加入50μl终止液；n.酶标仪检测490nm吸光度；o.将3个复孔取平均值；将所有实验孔、靶细胞孔和效应细胞孔的吸光值减去培养基背景吸光值的均值；将靶细胞最大值的吸光值减去体积校正对照吸光值的均值；p.将步骤15中获得的经过校正的值带入下面公式，计算每个效靶比所产生的细胞毒性百分比。杀伤效率＝(实验孔-效应细胞孔-靶细胞孔)/(靶细胞最大孔-靶细胞孔)×100％。结果如图9所示，t细胞对ls174-t结肠腺癌细胞的杀伤效率在不同效靶比条件下都比较低，而epcamcar-t，trac-epcam.car-t与trbc-epcam.car-t细胞对靶细胞的杀伤效果都随着效靶比的提高而增加，并且epcamcar-t作为对照，trac-epcam.car-t与trbc-epcam.car-t细胞的杀伤能力与其没有显著差异。因此，trac/trbc的敲除并没有改变epcam.car-t细胞对靶细胞的杀伤能力。实施例4(1)敲减人trac或trbc基因gpc3靶点的car-t细胞的构建敲减人trac或trbc基因的gpc3.car-t细胞的构建方法和流程与实施例2相同。本实施例与上述实施例中构建方法的不同之处在于：gpc3靶点的scfv片段序列基于专利文献us7919086b2中对应的gpc3抗体序列，所述序列如seqidno.15所示，gpc3.car的基因设计图如图10所示。(2)kdtrac/trbc-epcam.car-t细胞中trac/trbc蛋白表达的检测①培养gpc3.car-t细胞，trac-gpc3.car-t细胞，trbc-gpc3.car-t细胞，通过计数取1x108个细胞来提取总蛋白。②离心收集细胞，每106细胞加250μlripa(在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂)，振荡。冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。③12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。再进行蛋白质印迹实验(westernblot)以检测trac与trbc的表达量，通过与对照car-t细胞中trac与trbc的表达来验证两种t细胞受体亚单位的敲减效果，如图11所示，从图中可以看出trackd的gpc3.car-t中的trbc蛋白的表达量正常，而trac的表达量经过分析减少到gpc3.car-t细胞的9.6％，trbckd的gpc3.car-t中的trac蛋白的表达量正常，而trbc的表达量经过分析降低到gpc3.car-t细胞的12.3％。trbc-gpc3.car-t或trac-gpc3.car-t细胞中的trbc或trac有少许残留可能来自于少量未被慢病毒感染的t细胞。(3)trac/trbckd-gpc3.car-t细胞有效性验证a.分别培养hepg2细胞和pbmc细胞；b.实验开始前4天，moi＝10的gpc3.car、trackd-gpc3.car、trackd-gpc3.car的慢病毒感染pbmc细胞，培养72-96h后可安排开始实验；c.收集靶细胞(els174-t结肠腺癌细胞)5×105cells和效应细胞(cart细胞)3×106cells，800g，6min离心，弃上清；d.用1ml1×pbs溶液分别重悬靶细胞和效应细胞，800g，6min离心，弃上清；e.重复步骤3一次；f.用700μl培养基(1640培养基+10％fbs)重悬效应细胞，用2ml培养基(1640培养基+10％fbs)重悬靶细胞；g.设置效靶比为20:1，10:1，5:1的实验孔，并设置对照组，每组3个复孔；h.250×g，5min平板离心；i.37℃5％co2培养箱中培养4h；j.250×g，5min平板离心；k.取每个孔的50μl上清到新96孔板中，并且每孔加入50μl底物溶液(避光操作)；l.避光孵育25min；m.每孔加入50μl终止液；n.酶标仪检测490nm吸光度；o.将3个复孔取平均值；将所有实验孔、靶细胞孔和效应细胞孔的吸光值减去培养基背景吸光值的均值；将靶细胞最大值的吸光值减去体积校正对照吸光值的均值；p.将步骤15中获得的经过校正的值带入下面公式，计算每个效靶比所产生的细胞毒性百分比。杀伤效率＝(实验孔-效应细胞孔-靶细胞孔)/(靶细胞最大孔-靶细胞孔)×100％。结果如图12所示，t细胞对hepg2细胞的杀伤效率在不同效靶比条件下都比较低，而gpc3car-t，trac-gpc3.car-t与trbc-gpc3.car-t细胞对靶细胞的杀伤效果都随着效靶比的提高而增加，并且gpc3car-t作为对照，trac-gpc3.car-t与trbc-gpc3.car-t细胞的杀伤能力与其没有显著差异。因此，trac/trbc的敲除并没有改变epcam.car-t细胞对靶细胞的杀伤能力。实施例5本发明以多种肿瘤相关抗原为靶点，包括并不仅限于以下靶点：cd19靶点、表皮生长因子受体3型突变体egfrvⅲ、人表皮生长因子受体2her2、白介素13受体α2il13ra、癌胚抗原cea、间皮素msln、成纤维细胞激活蛋白fap、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3gpc3、卵泡刺激素受体fshr、人前列腺特异性膜抗原psma、神经节苷脂gd2等。本方案以cd19、epcam、gpc3为靶点设计并构建以上述抗原靶点的嵌合抗原受体结构，包括cd8α信号肽序列、识别上述抗原的scfv单链抗体序列、铰链区、跨膜区、共刺激因子cd137和或cd28、胞内信号区cd3ζ、t2a间隔区。以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅限于上述实施例，与本发明构思无差异的各种工艺方案均在本发明的保护范围内。sequencelisting<110>安徽古一生物科技有限公司<120>敲减人trac/trbc基因的sirna、慢病毒载体、car-t细胞构建方法及应用<160>15<170>patentinversion3.3<210>1<211>58<212>dna<213>人工序列<400>1ccgggccttcaacaacagcattattctcgagaataatgctgttgttgaaggctttttg58<210>2<211>58<212>dna<213>人工序列<400>2ccggaccagctgagagactctaaatctcgagatttagagtctctcagctggttttttg58<210>3<211>58<212>dna<213>人工序列<400>3ccggccagctgagagactctaaatcctcgaggatttagagtctctcagctggtttttg58<210>4<211>58<212>dna<213>人工序列<400>4ccgggtaaggattctgatgtgtatactcgagtatacacatcagaatccttactttttg58<210>5<211>58<212>dna<213>人工序列<400>5ccggtaaggattctgatgtgtatatctcgagatatacacatcagaatccttatttttg58<210>6<211>58<212>dna<213>人工序列<400>6ccggctaagtgactaaaccaataaactcgagtttattggtttagtcacttagtttttg58<210>7<211>58<212>dna<213>人工序列<400>7ccgggtcactcaaactccaagatatctcgagatatcttggagtttgagtgactttttg58<210>8<211>58<212>dna<213>人工序列<400>8ccggccttcagttcctctttgaatactcgagtattcaaagaggaactgaaggtttttg58<210>9<211>58<212>dna<213>人工序列<400>9ccggtaacccgtcatggtttcaatactcgagtattgaaaccatgacgggttatttttg58<210>10<211>58<212>dna<213>人工序列<400>10ccggtctctgcatcccaatagatatctcgagatatctattgggatgcagagatttttg58<210>11<211>0<212>dna<213>人工序列<400>11<210>12<211>367<212>dna<213>人工序列<400>12ccggaattcgagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggct60gttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacg120tgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatg180gactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttg240tggaaaggacccggctaagtgactaaaccaataaactcgagtttattggtttagtcactt300agtttttgcacacaaaaaaccaacacacagatgtaatgaaaataaagatattttattgcg360gccgcaa367<210>13<211>1540<212>dna<213>人工序列<400>13atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccagg60ccggacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtc120accatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaa180ccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtccca240tcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggag300caagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcgga360ggggggaccaagctggagatcacaggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggc420ggcggatctgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagc480ctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggatt540cgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccaca600tactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaa660gttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaa720cattattactacggtggtagctatgctatggactactggggccaaggaacctcagtcacc780gtctcctcaaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcg840cagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacg900agggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggg960gtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgttctgggtcctggtggtggtggggg1020gcgtgctggcctgctacagcctgctggtgacagtggccttcatcatcttctgggtccaaa1080cggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaact1140actcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaa1200ctgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccag1260ctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgt1320ggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtac1380aatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgag1440cgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggac1500acctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgct1540<210>14<211>744<212>dna<213>人工序列<400>14gagctcgtgatgacacagtctccatcctccctgactgtgacagcaggagagaaggtcact60atgagctgcaagtccagtcagagtctgttaaacagtggaaatcaaaagaactacttgacc120tggtaccagcagaaaccagggcagcctcctaaactgttgatctactgggcatccactagg180gaatctggggtccctgatcgcttcacaggcagtggatctggaacagatttcactctcacc240atcagcagtgtgcaggctgaagacctggcagtttattactgtcagaatgattatagttat300ccgctcacgttcggtgctgggaccaagcttgagatcaaaggtggtggtggttctggcggc360ggcggctccggtggtggtggttctgaggtgcagctgctcgagcagtctggagctgagctg420gtaaggcctaggacttcagtgaagatatcctgcaaggcttctggatacgccttcactaac480tactggctaggttgggtaaagcagaggcctggacatggacttggatggattggagatatt540ttccctggaagtggtaatatccactacaatgagaagttcaagggcaaagccacactgact600gcagacaaatcttcgagcacagcctatatgcagctcagtagcctgacatttgaggactct660gctgtctatttctgtgcaagactgaggaactgggacgagcctatggactactggggccaa720gggaccacggtcaccgtctcctcc744<210>15<211>726<212>dna<213>人工序列<400>15gatgttgtgatgactcagtctccactctccctgcccgtcacccctggagagccggcctcc60atctcctgcagatctagtcagagccttgtacacagtaatggaaacacctatttacattgg120tacctgcagaagccagggcagtctccacagctcctgatctataaagtttccaaccgattt180tctggggtccctgacaggttcagtggcagtggatcaggcacagattttacactgaaaatc240agcagagtggaggctgaggatgttggggtttattactgctctcaaaatacacatgttcct300cctacgtttggccaggggaccaagctggagatcaaaggcgggggggggagcggcgggggc360ggcagcgggggcggggggtcccaggtgcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaag420cctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggatacaccttcaccgactatgaa480atgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggagctcttgatcct540aaaactggtgatactgcctacagtcagaagttcaagggcagagtcacgctgaccgcggac600gaatccacgagcacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtg660tattactgtacaagattctactcctatacttactggggccagggaaccctggtcaccgtc720tcctca726当前第1页12