一种基于基因工程烟草的1,2,3-三氯丙烷生物降解方法与流程

文档序号：16208050发布日期：2018-12-08 07:22阅读：468来源：国知局

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种包含卤代烷烃脱卤酶(dhaa31)、卤醇脱卤酶(hhec-w249p)、环氧化物水解酶(echa)的等的tcp降解酶表达单元、重组载体及其在生物降解1，2，3-三氯丙烷(tcp)中的应用。

背景技术

化学工业的进步给人们的生活带来了巨大的便利，许多有实用价值的加工产品纷纷被生产出来。但是，化学工业进步为人们带来便利的同时，无形中也让人们付出了巨大的代价。大量的化学污染物通过各种途径被排放出来大规模污染环境。有机氯化物在这些污染物中占有很大一部分的比例，其中就包括1,2,3-三氯丙烷(tcp)这种新兴的有机污染物。在工业上tcp经常单独用作工业溶剂、脱脂剂、脱漆剂等，同时也作为生产二氯丙烯、环氧氯丙烷等化工厂产品的中间体或者副产物出现，全世界年产量已经接近5万吨。因为它化学性质稳定不易降解，肆意排放后会造成地下水污染及对土壤产生破坏。

自1960年以来科学家们就陆续开始在美国、日本等发达国家的饮用水中检测到了tcp的存在，但由于一直没有确定它的致病性和致癌性且含量不高所以一直没有受到重视。但近10年以来，全球各地饮用水中检测到tcp的次数越来越多，有关它的毒性和致癌性关注度开始提升，美国环保署和国防部已经将它视为了“新兴污染物”。中国地质大学钱永博士曾对tcp在地下水中的行为做过检测，发现一座仅在1976-1979年开行约2年时间的工厂所排出的化工废料直至2016年还能在重污染区上下游检出tcp，而且最高浓度甚至可以达到3890mg/l，这说明tcp可以在地下稳定存在40年都不降解。同时，由于tcp的密度比水大，这意味当它一旦被释放，便会不断在土壤中下渗并且很可能进入到地下水中。同时，tcp还有很高的迁移率，迁移速度接近地下水的迁移速度，这说明tcp非常容易扩散进入我们的生活区域和生活用水中。

虽然tcp是一种极具威胁的污染物，但对其重视还远远不够，在美国只有夏威夷、加州等地出台了相关的工厂加工生产安全排放标准且在年产tcp量占世界近20％的我们国家，tcp甚至没有被列入水质检测物质的名单中。因此，本项目尝试在tcp还没对社会造成更大危害之前，找到更加可行地解决tcp污染的方法，及时遏制他的发展。

传统1,2,3-三氯丙烷的处理方法主要有活性炭吸附法、氢释放化合物法、零价锌法三种。但是这三种方法都不值得提倡。活性炭吸附法目前吸收效率较低且作用缓慢，而氢释放化合物法、零价锌等方法面临的问题就是处理价格昂贵，所需条件繁琐，难以操作。所以在常规理化方法难以使用的情况下，生物修复处理tcp开始受到关注。近几年科学家们研究开始使用基因工程的方法向微生物中导入一系列关键酶以求能够降解tcp。可如要利用微生物降解1,2,3-三氯丙烷有非常严格的营养需求，需要持续不断供给营养，浪费资源且增加费用。另外，微生物降解1,2,3-三氯丙烷很大程度上依赖于某些特定的诱导条件，如阿拉伯糖诱导等，难以在自然界进行主动、高效的降解。

技术实现要素：

为了解决tcp大量累积对环境产生的巨大威胁，且不易进行tcp生物降解的问题。本发明解决技术问题的技术方案是构建了一种tcp降解酶表达单元，该表达单元是从5'端向3'端依次由dhaa31orf、hhec-w249porf和echaorf连接的融合蛋白表达框。

其中，上述tcp降解酶表达单元中，在5'端连接有启动子。优选的，所述的启动子为植物组成型表达启动子，优选组成型表达启动子为pcamv35s。进一步优选的，所述启动子pcamv35s核苷酸序列如seqidno.1所示。

其中，上述tcp降解酶表达单元中，所述的dhaa31orf的编码核苷酸序列seqidno.2所示。hhec-w249porf的编码核苷酸序列seqidno.4所示。echaorf的编码核苷酸序列seqidno.6所示。

其中，上述tcp降解酶表达单元中，所述的dhaa31来自rhodococcusrhodochrous菌株或dhaa31突变体；所述的hhec-w249p来自agrobacteriumradiobacterad1菌株或hhec-w249p突变体；所述的echa来自agrobacteriumradiobacterad1菌株或echa突变体。上述所述的突变体分别是指在原来的dhaa31、hhec-w249p和echa的氨基酸序列中，经取代、缺失或添加1-10个氨基酸且还具有dhaa31、hhec-w249p和echa酶活性的衍生蛋白质。

进一步的，上述tcp降解酶表达单元中，在dhaa31orf、hhec-w249porf和echaorf的3'端分别连接有2a短肽。所述的2a信号肽为串联蛋白表达信号肽。所述的串联蛋白表达信号肽依次为p2a、t2a、f2a。优选的，所述p2a、t2a、f2a的核苷酸序列分别为seqidno.3、seqidno.5、seqidno.7所示。

进一步的，上述tcp降解酶表达单元中，在3'端连接终止子。优选为植物组成型表达终止子。更优选的为植物组成型表达终止子pcamv35st。所述终止子pcamv35st核苷酸序列如seqidno.9所示。

进一步的，上述tcp降解酶表达单元中，在表达终止子的5'端连接有标记基因。所述的标记基因为新霉素磷酸转移酶基因、氨基糖苷-3’-腺苷酸转移酶基因或甜菜碱醛脱氢酶基因中的一种。优选为新霉素磷酸转移酶基因nptii。

进一步的，上述tcp降解酶表达单元中，所述的融合蛋白表达单元的核苷酸序列如seqidno.10所示。

本发明还提供了一种含有上述tcp降解酶表达单元的载体。所述载体为植物表达载体。优选为质粒载体或者病毒载体。更优选的，所述质粒载体为pbi121、pcambia系列等骨架载体中的至少一种。

本发明还提供了一种包含上述载体的宿主细胞。所述的宿主细胞为真核细胞。优选的，所述真核细胞为双子叶植物的细胞。可使用烟草、矮牵牛等双子叶植物当中的至少一种。

本发明还提供了一种上述宿主细胞在制备tcp降解酶中的用途。以及上述宿主细胞在降解1，2，3-三氯丙烷中的用途。

本发明还提供了一种tcp降解剂以及制备上述tcp降解剂的方法。

本发明还提供了一种降解tcp的方法，包括以下步骤：取上述任一种宿主细胞或含有上述宿主细胞的组织，提取细胞或组织研磨上清液加入1，2，3-三氯丙烷，以实现1，2，3-三氯丙烷的降解。

本发明的有益效果为：本发明选择了植物降解的方式，克服了种种不利因素，构建能有效表达高活性的dhaa31，hhec-w249p，echa三种酶的组成型表达单元。利用该单元制备了植物表达载体，能有效实现dhaa31，hhec-w249p，echa三种酶在烟草中的稳定和同时活性有活性的表达，通过气相色谱法验证了dhaa31，hhec-w249p，echa具备1，2，3-三氯丙烷降解活性，并在进一步的检测中观测到无害降解产物甘油的稳定持续生成。本发明为1，2，3-三氯丙烷降解提供了一条植物基因工程的途径，拓展了1，2，3-三氯丙烷污染物无害化处理的策略，通过烟草等双子叶植物降解1，2，3-三氯丙烷，提升了降解效率，降低了处理成本，缓解了环境压力。

附图说明

图1、本发明中具体构建的plb310载体示意图(a)及酶切验证结果(b)m-分子量标准；1-ecori+bamhi双酶切检测；2-psti+bamhi双酶切检测)。

图2、烟草农杆菌侵染转化流程示意图。

图3、导入dhaa31、hhec-w249p、echa基因转基因烟草的验证结果。(a)pcr阳性验证结果；(b)反转录pcr验证结果。

图4基于气相色谱方法，基因工程烟草降解1，2，3-三氯丙烷的降解结果。(a)转基因烟草研磨上清液降解1,2,3-三氯丙烷的产物与时间进程曲线；(b)气相色谱-质谱联用分析研磨上清液降解1,2,3-三氯丙烷的效果。

具体实施方式

针对现有技术的不足，发明人思考是否可考虑使用植物修复来处理1,2,3-三氯丙烷污染。植物修复相比微生物修复，其优点是作为拥有一套光合自养系统的植物只需要少量的营养输入就可以持久有效的处理污染物，应用起来方便简单且廉价，并且植物在清理污染的土壤及地下水的同时还可以起到稳定土壤、提供美观环境和野生动物栖息地的作用。再者，用于植物修复的植物材料可以再加工成木片，纸浆，甚至还可以同时用来处理重金属污染等等，一举多得。一般来说“植物修复”主要是有四种方式：植物提取、植物挥发、植物固定和植物降解。

本发明通过对tcp理化性质的研究，发现由于tcp不能在生物中大量富集，它的吸附力低且易于迁移，所以难以通过萃取和固定的方式进行处理。况且如果采用植物萃取和植物固定的方式，就要经常对植物进行处理和更换。这些都要建立一套完整的后续处理体系，耗时耗力。植物挥发则可能会将土壤污染变成大气污染而不适合处理tcp污染。而在植物中导入一系列微生物中的关键酶进行有效表达并各自配合发挥作用，也面临更大的挑战和难度。通过大量的前期眼研究，本发明最终开发出基于dhaa31、hhec-w249p、echa三种降解tcp关键酶的烟草表达载体构建、转基因烟草活性验证及其在tcp降解中的应用的一整套技术，能够很好的实现基于植物基因工程转基因植株进行tcp的生物降解。

本发明的主要技术手段是构建了一种可以在烟草中有效进行组成型表达dhaa31、hhec-w249p、echa三种关键酶从而进行1，2，3-三氯丙烷生物降解的表达骨架，进而构建了烟草表达载体。具体而言，所述组成型表达dhaa31、hhec-w249p、echa三种酶的烟草表达载体的核心表达单元从5’到3’方向构建顺序为：植物组成型表达启动子(pcamv35s)+dhaa31orf(进行了密码子优化)+2a短肽(t2a)+hhec-w249porf(进行了密码子优化)+2a短肽(p2a)+echaorf(进行了密码子优化)+2a短肽(f2a)+新霉素磷酸转移酶基因(nptii)+植物组成型表达终止子(pcamv35st)。

其中，所述pcamv35s核苷酸序列如seqidno.1所示；所述dhaa31核苷酸序列如seqidno.2所示；所述t2a核苷酸序列如seqidno.3所示；所述hhec-w249p核苷酸序列如seqidno.4所示；所述p2a核苷酸序列如seqidno.5所示；所述echa核苷酸序列如seqidno.6所示；所述f2a核苷酸序列如seqidno.7所示；所述nptii核苷酸序列如seqidno.8所示；所述pcamv35st核苷酸序列如seqidno.9所示。

上述所述组成型表达dhaa31、hhec-w249p、echa三种酶的烟草表达载体的核心表达单元的核苷酸序列如seqidno.10所示。

其中，上述新霉素磷酸转移酶基因作为标记基因，可以采用其他生物基因工程常用的标记基因替代，如氨基糖苷-3’-腺苷酸转移酶基因(aada)、甜菜碱醛脱氢酶基因(pat)等。

其中的一种构建方式是先通过基因合成方式，获得dhaa31，hhec-w249p，echa三种酶的表达单元(并分别在上游添加2a短肽，上下游添加bsai酶切位点)，利用goldengate技术将三种酶表达单元拼装至已装好pcamv35s和pcamv35st的骨架载体pzhy930中，获得重组烟草表达质粒：plb310(pcamv35s+dhaa31+t2a+hhec-w249p+p2a+echa+f2a+nptii+pcamv35st)。

将上述述重组植物表达质粒通过农杆菌转化导入烟草(nicotianatobacco)中，即得本发明所述的1，2，3-三氯丙烷生物降解基因工程烟草。

将上述所获得的具有组成型表达dhaa31、hhec-w249p、echa三种关键酶能力的基因工程重组烟草植株在植物ms基本培养基中培养约20天后，提取的叶片研磨液富含dhaa31，hhec-w249p，echa三种酶蛋白，可以降解1，2，3-三氯丙烷。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下结合具体实施例对本发明进行一步描述，以便更好理解本发明，但本发明的保护范围并不仅限定于以下描述。

实施例一1，2，3-三氯丙烷降解基因工程材料的获得

1、烟草组成型常表达dhaa31、hhec-w249p、echa的dna重组载体设计、构建、制备

通过人工合成方式，委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成dhaa31、hhec-w249p、echa三种酶的表达单元：dhaa31(seqidno.2)；hhec-w249p(seqidno.4)；echa(seqidno.6)。

提取pzhy930质粒(臧黎黎，基于migs的水稻高效基因沉默体系建立及应用，电子科技大学，2015年5月)利用goldengate克隆技术，按顺序将dhaa31、t2a+hhec-w249p、p2a+echa、t2a+nptii克隆入pzhy930载体，获得重组dna质粒plb310(图1)。

该质粒plb310含有7个功能单元，具体设计及各单元具体结构描述如下：

1)、pcamv35s：植物组成型表达常启动子，核苷酸序列如seqidno.1所示；

2)、dhaa31：卤代烷烃脱卤酶，经过表达密码子优化，核苷酸序列如seqidno.2所示；

3)、hhec-w249p：卤醇脱卤酶，经过表达密码子优化，核苷酸序列如seqidno.4所示；

4)、echa：环氧化物水解酶，经过表达密码子优化，核苷酸序列如seqidno.6所示；

5)、nptii：编码新霉素磷酸转移酶，使植物具有卡那霉素等抗性，核苷酸序列如seqidno.8所示；

6)、f2a；p2a；t2a：2a短肽，用于串联稳定表达dhaa31、hhec-w249p、echa、nptii编码蛋白质，核苷酸序列如seqidno.3、seqidno.5、seqidno.7所示；

7)pcamv35st：植物蛋白表达终止子，核苷酸序列如seqidno.9所示。

8)根据goldengate克隆技术，将上述功能单元克隆进载体之后，得到了组成型表达dhaa31、hhec-w249p、echa三种酶的烟草表达载体的核心表达单元，核苷酸序列如seqidno.10所示。当然，本领域技术人员也可以采用其他克隆方法或者直接合成该表达框架，利用常规的克隆技术，将核心表达单元连入植物常用的骨架载体，构建表达载体。

2、1，2，3-三氯丙烷降解基因工程烟草植株的获得

将上一步骤中获得的重组质粒plb310转入大肠杆菌dh5α内，经测序验证获得了正确的重组质粒。进一步，将所获得的重组质粒转化进入本领域常用的侵染用材料根癌农杆菌eha105中，经菌落pcr验证获得正确单克隆。再通过农杆菌侵染将包含重组dna质粒plb310的t-dna段整合到烟草(nicotianatobacco)的染色体组，得到可稳定表达目标基因的植株。农杆菌侵染按常规侵染方法进行，分为预培养、侵染、筛选、生根等四个阶段，整个周期约8周。最后得到了一系列可稳定表达dhaa31、hhec-w249p和echa的t0代转基因阳性植株。

3、烟草转基因植株阳性检测及rt-pcr检测实验

对上一步骤中多株t0代转基因烟草植株进行后继培养。提取了存活下来且长势良好的t0代烟草植株的基因组dna，并设计了针对dhaa31、hhec-w249p、echa基因设计相应引物进行目的基因pcr扩增。

其中三株转基因植株(plb310-1、plb310-2、plb310-3)的pcr结果参见图3(a)。从该图可见，与野生型相比，在t0代转基因烟草中成功扩增出了与目的基因相适应的目的条带，说明获得了转基因阳性植株。

同时还提取了存活下来且长势良好的t0代烟草植株的rna，对其应用常规方法将rna反转录成为dna，并设计了针对dhaa31、hhec-w249p、echa反转录出来的dna引物，进行rt-pcr扩增。

其中三株转基因植株(plb310-1、plb310-2、plb310-3)rt-pcr结果参见图3(b)。同野生型相比，在t0代转基因烟草中成功扩增出了与dhaa31、hhec-w249p、echa反转录出的dna相适应的目的条带，说明dhaa31、hhec-w249p、echa可以在烟草植株内进行转录。

实施例二plb310基因工程烟草植株表达dhaa31、hhec-w249p、echa三种关键酶进行1，2，3-三氯丙烷离体生物降解实验

参照实施例1中的plb310基因工程烟草植株繁育及样品制备方案，获得足量的plb310基因工程烟草。取烟草的叶片研磨，取上清液，以1，2，3-三氯丙烷为底物，参照文献：“dvorakp,bidmanovas,damborskyj,prokopz.2014.immobilizedsyntheticpathwayforbiodegradationoftoxicrecalcitrantpollutant1,2,3-trichloropropane.environ.sci.technol.48:6859–6866.”中公开的气相色谱实验方法，测试所得上清液中dhaa31、hhec-w249p、echa三种关键酶能否降解1，2，3-三氯丙烷。

检测方法为：称取植物叶片2g(鲜重fw)，液氮研磨后加入6ml提取液(200mmtris-so4,ph8.5),充分研磨后转移至离心管中离心30min(12000×g，4℃)，将等量上清(6.5ml)转移至10ml反应容器中，加入对应底物(终浓度为5mm)，37℃水浴下反应，隔一定时间取反应溶液制样，进行气相检测。

结果参见图4(a)，气相色谱实验结果表明，plb310基因工程烟草植株的研磨上清液具有显著酶生物活性，其对1，2，3-三氯丙烷可以进行有效降解，并生成甘油，且至少在处理1,2,3-三氯丙烷后5小时都还有较强降解能力。同时图4(b)的气相色谱-质谱联用分析也表明获得的基因工程烟草植株的研磨上清液，可以对1，2，3-三氯丙烷可以进行有效降解，并生成甘油，而野生型烟草植株(wt)在反应20小时后都没有甘油的生成。

上述实施例仅用于解释说明本发明的发明构思，而非对本发明权利保护的限定，凡利用此构思对本发明相关细节进行非实质性各种修改和替换，均应落入本发明的保护范围之内。

序列表

<110>电子科技大学

<120>一种基于基因工程烟草的1,2,3-三氯丙烷生物降解方法

<130>a180528k（序）

<150>201711021287.6

<151>2017-10-27

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