一种液相芯片技术检测微生物的方法与流程

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种液相芯片技术检测微生物的方法。

背景技术

液相芯片技术(xmap)是二十一世纪初诞生的后基因组时代产品的杰出代表，液相芯片技术平台是既能保证信息质量，又能提供相对高通量的新一代分子诊断技术平台,整合了生物检测，乳胶微球荧光编码，微液体传送系统，激光实时记录，先进电脑软件和数据处理模式等多种先进技术。

该技术具有高通量、集成化、试剂和样品消耗少的优势，可以同时检测大量样品的多个指标，检测效率提高了若干倍，使得检测的人力成本直接下降，具有操作简单，花费较低，重复性好，杂交动力学快，微阵列应用灵活等优点，为高通量分子诊断提供了良好平台。现已开发出肿瘤标志物、过敏源筛查、自身免疫病、细胞因子等诊断微球，并且2001年被美国fda批准用于临床进行自身免疫病、人类白细胞抗原分型的诊断，这也是唯一被美国fda批准用于临床诊断的生物芯片，它的开发以及应用被认为是生物芯片领域发展的一个重要进展。目前，液相芯片以其高通量、检测灵敏度高、重复性好等优点，以及检测动态范围宽等优势已被广泛应用于各研究领域。国内研究应用主要有hla基因分型、病毒检测、肿瘤物标志物的检测，微生物的检测。

现有的检测的方法往往仅能对单一的微生物进行检测，无法同时对多种微生物进行检测。

技术实现要素：

为实现能同时快速有效检测多种微生物，本发明提供一种液相芯片技术检测微生物的方法。

根据本发明提供的一种液相芯片技术检测微生物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

s1，根据布鲁氏菌、沙门氏菌、狂犬病毒、弓形虫、巴氏通体和弯曲杆菌的基因序列分别设计合成对应的具有5’端修饰有氨基的seqidno.1所示的核苷酸序列的布鲁氏菌探针、具有5’端修饰有氨基的seqidno.2所示的核苷酸序列的沙门氏菌探针、具有5’端修饰有氨基的seqidno.3所示的核苷酸序列的狂犬病毒探针、具有5’端修饰有氨基的seqidno.4所示的核苷酸序列的弓形虫探针、具有5’端修饰有氨基的seqidno.5所示的核苷酸序列的巴氏通体探针和具有5’端修饰有氨基的seqidno.6所示的核苷酸序列的弯曲杆菌探针；s2，将布鲁氏菌探针、沙门氏菌探针、狂犬病毒探针、弓形虫探针、巴氏通体探针和弯曲杆菌探针分别与第一、第二、第三、第四、第五和第六荧光编码微球相连，分别获得第一、第二、第三、第四、第五和第六偶联微球的探针溶液；s3，将布鲁氏菌、沙门氏菌、狂犬病毒、弓形虫、巴氏通体和弯曲杆菌阴性样品，经dna抽提和pcr扩增获得阴性pcr产物，将第一、第二、第三、第四、第五和第六偶联微球的探针溶液混合形成混合偶联微球的探针溶液，然后将阴性pcr产物加入混合偶联微球的探针溶液，在luminex仪器中读取信号，根据该信号得阈值；s4，将待测物样品，经dna抽提和pcr扩增获得待测pcr产物，将待测pcr产物加入混合偶联微球的探针溶液，在luminex仪器中读取信号，与阈值比较，判断待测物样品为阴性或阳性。

优选的，该布鲁氏菌探针、沙门氏菌探针、狂犬病毒探针、弓形虫探针、巴氏通体探针和弯曲杆菌探针的tm值保持在56℃-58℃。

优选的，该获得待测pcr产物具体方法包括如下步骤：

p1，在布鲁氏菌探针、沙门氏菌探针、狂犬病毒探针、弓形虫探针、巴氏通体探针和弯曲杆菌探针的上下游分别设计上下游引物，获得布鲁氏菌引物、沙门氏菌引物、狂犬病毒引物、弓形虫引物、巴氏通体引物和弯曲杆菌引物；p2，利用布鲁氏菌引物、沙门氏菌引物、狂犬病毒引物、弓形虫引物、巴氏通体引物和弯曲杆菌引物扩增，分别获得布鲁氏菌目的基因bl、沙门氏菌目的基因sm、狂犬病毒目的基因wq、弓形虫目的基因gx、巴氏通体目的基因ba和弯曲杆菌目的基因kq及包含布鲁氏菌目的基因bl、沙门氏菌目的基因sm、狂犬病毒目的基因wq、弓形虫目的基因gx、巴氏通体目的基因ba和弯曲杆菌目的基因kq的多重pcr产物。

优选的，该布鲁氏菌引物包括具有5’端修饰有生物素的seqidno.7所示的核苷酸序列的布鲁氏菌上游引物和具有seqidno.8所示的核苷酸序列的布鲁氏菌下游引物；

优选的，该沙门氏菌引物，包括具有seqidno.9所示的核苷酸序列的沙门氏菌上游引物和具有5’端修饰有生物素的seqidno.10所示的核苷酸序列的沙门氏菌下游引物；

优选的，该狂犬病毒引物，包括具有5’端修饰有生物素的seqidno.11所示的核苷酸序列的狂犬病毒上游引物和具有seqidno.12所示的核苷酸序列的狂犬病毒下游引物；

优选的，该弓形虫引物，包括具有5’端修饰有生物素的seqidno.13所示的核苷酸序列的弓形虫上游引物和具有seqidno.14所示的核苷酸序列的弓形虫下游引物；

优选的，该巴氏通体引物，包括具有5’端修饰有生物素的seqidno.15所示的核苷酸序列的巴氏通体上游引物和具有seqidno.16所示的核苷酸序列的巴氏通体下游引物；

优选的，该弯曲杆菌引物，包括具有5’端修饰有生物素的seqidno.17所示的核苷酸序列的弯曲杆菌上游引物和具有seqidno.18所示的核苷酸序列的弯曲杆菌下游引物。

因此，在一个检测平台上同时检测多种微生物或者检测多种动物的同一微生物，以此缩短检测周期、减少检测成本。从而获得了一种能同时快速有效检测多种微生物的高通量检测技术。

附图说明

图1为布鲁氏菌引物、沙门氏菌引物、狂犬病毒引物、弓形虫引物、巴氏通体引物和弯曲杆菌引物分别及同时对目的基因进行扩增得到的单重pcr产物及多重pcr产物的电泳图。

具体实施方式

下面将结合本发明的具体实施方式，对本发明的技术方案进行详细的说明，但如下实施例仅是用以理解本发明，而不能限制本发明，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合，本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。

实验材料

链霉素-亲和素-藻红蛋白(sape)购自美国invitrogen公司；

表面羧基化的荧光编码微球购自美国bio-rad公司；

沙门氏菌、布鲁氏菌、弓形虫、狂犬病毒、巴尔通体、弯曲杆菌质粒由上海出入境检验检疫局动物检疫实验室委托上海生工生物工程有限公司进行全基因合成，并克隆在puc57载体上，制备的质粒采用双纯水配制成500拷贝/μl的浓度，保存于-20℃备用；

所有样品均为进出境实验动物拭子或全血样品。

实施例1

根据本发明提供的一种液相芯片技术检测微生物的方法，包括以下步骤：

s1，根据genabank的布鲁氏菌(bru)的基因序列，应用primer5.0序列分析软件进行基因序列分析，设计并合成得到具有5’端修饰有氨基的seqidno.1所示的核苷酸序列的布鲁氏菌探针，如表1所示；

根据genabank的沙门氏菌(sal)的基因序列，应用primer5.0序列分析软件进行基因序列分析，设计并合成得到具有5’端修饰有氨基的seqidno.2所示的核苷酸序列的沙门氏菌探针，如表1所示；

根据genabank的狂犬病毒(rab)的基因序列，应用primer5.0序列分析软件进行基因序列分析，设计并合成得到具有5’端修饰有氨基的seqidno.3所示的核苷酸序列的狂犬病毒探针，如表1所示；

根据genabank的弓形虫(tox)的基因序列，应用primer5.0序列分析软件进行基因序列分析，设计并合成得到具有5’端修饰有氨基的seqidno.4所示的核苷酸序列的弓形虫探针，如表1所示；

根据巴氏通体(bar)的基因序列，应用primer5.0序列分析软件进行基因序列分析，设计并合成得到具有5’端修饰有氨基的seqidno.5所示的核苷酸序列的巴氏通体探针，如表1所示；

根据弯曲杆菌(camp)的基因序列，应用primer5.0序列分析软件进行基因序列分析，设计并合成得到具有5’端修饰有氨基的seqidno.6所示的核苷酸序列的弯曲杆菌探针，如表1所示；

上述布鲁氏菌探针、沙门氏菌探针、狂犬病毒探针、弓形虫探针、巴氏通体探针和弯曲杆菌探针tm值在56℃-58℃。

表1：各探针序列

s2，取第一荧光编码微球与布鲁氏菌探针形成第一偶联微球的探针溶液；取第二荧光编码微球与沙门氏菌探针形成第二偶联微球的探针溶液；取第三荧光编码微球与狂犬病毒探针形成第三偶联微球的探针溶液；取第四荧光编码微球与弓形虫探针形成第四偶联微球的探针溶液；取第五荧光编码微球与巴氏通体探针形成第五偶联微球的探针溶液；取第六荧光编码微球与弯曲杆菌探针形成第六偶联微球的探针溶液。将第一偶联微球的探针溶液、第二偶联微球的探针溶液、第三偶联微球的探针溶液、第四偶联微球的探针溶液、第五偶联微球的探针溶液、第六偶联微球的探针溶液混合得混合偶联微球的探针溶液。

具体地，分别取第一、第二、第三、第四、第五和第六荧光编码微球100μl；5000rpm离心10分钟后弃上清，并用双蒸水洗涤2次；用100μl10mmph6.0的ems重新悬浮后，分别加入20μm的相应探针3μl，充分混匀后，加入15％edc，37℃避光孵育30分钟；离心弃上清，用0.1％sds洗涤2次后，用50μlte缓冲液(ph8.0)重新悬浮后，得第一、第二、第三、第四、第五和第六偶联微球的探针溶液4℃避光保存备用。

s3，提供布鲁氏菌(bar)、沙门氏菌(sal)、狂犬病毒(rab)、弓形虫(tox)、巴氏通体(bar)和弯曲杆菌(camp)阴性样品与混合偶联微球的探针溶液进行孵育后加入luminex仪器中测得阈值。

具体的该步骤s3包括：

s31，提供布鲁氏菌(bar)、沙门氏菌(sal)、狂犬病毒(rab)、弓形虫(tox)、巴氏通体(bar)和弯曲杆菌(camp)阴性样品，经dna抽提和pcr扩增，得阴性pcr扩增产物，该阴性pcr扩增产物与混合偶联微球的探针溶液进行孵育，在luminex仪器中读取信号，根据该信号得阈值。

s4，将待测物样品经dna抽提和pcr扩增得pcr产物与混合偶联微球的探针溶液进行孵育后加入luminex仪器中测得信号值，根据信号值与阈值比较判断布鲁氏菌(bar)、沙门氏菌(sal)、狂犬病毒(rab)、弓形虫(tox)、巴氏通体(bar)和弯曲杆菌(camp)的有无。

具体的步骤s4包括：

s41，将待测物样品经dna抽提和pcr扩增得待测pcr产物，将待测pcr产物5μl，加入混合的偶联微球的探针溶液25μl(每种微球按照2000个/25μl)，充分混合均匀后先在94℃变性3min，然后在50℃孵育30min；接着加入sa-pe(浓度0.2μg/)70μl，继续孵育20min，将luminex200加热板加热到50℃，并调整至读数状态。孵育结束后直接上机读取信号，根据luminex仪器输出信号值与阈值比较以判定待测物样品中布鲁氏菌(bar)、沙门氏菌(sal)、狂犬病毒(rab)、弓形虫(tox)、巴氏通体(bar)和弯曲杆菌(camp)的有无。

实施例2

获得实施例1中待测pcr产物具体方法还包括：

ss1，在布鲁氏菌探针上下游设计得到布鲁氏菌引物，包括具有5’端修饰有生物素的seqidno.7所示的核苷酸序列的布鲁氏菌上游引物和具有seqidno.8所示的核苷酸序列的布鲁氏菌下游引物，如表2所示。

在沙门氏菌探针上下游设计得到沙门氏菌引物，包括具有seqidno.9所示的核苷酸序列的沙门氏菌上游引物和具有5’端修饰有生物素的seqidno.10所示的核苷酸序列的沙门氏菌下游引物，如表2所示。

在狂犬病毒探针上下游设计得到狂犬病毒引物，包括具有5’端修饰有生物素的seqidno.11所示的核苷酸序列的狂犬病毒上游引物和具有seqidno.12所示的核苷酸序列的狂犬病毒下游引物，如表2所示。

在弓形虫探针上下游设计得到弓形虫引物，包括具有5’端修饰有生物素的seqidno.13所示的核苷酸序列的弓形虫上游引物和具有seqidno.14所示的核苷酸序列的弓形虫下游引物，如表2所示。

在巴氏通体探针上下游设计得到巴氏通体引物，包括具有5’端修饰有生物素的seqidno.15所示的核苷酸序列的巴氏通体上游引物和具有seqidno.16所示的核苷酸序列的巴氏通体下游引物，如表2所示。

在弯曲杆菌探针上下游设计得到弯曲杆菌引物，包括具有5’端修饰有生物素的seqidno.17所示的核苷酸序列的弯曲杆菌上游引物和具有seqidno.18所示的核苷酸序列的弯曲杆菌下游引物，如表2所示。

表2各微生物引物

ss2，利用上述布鲁氏菌引物、沙门氏菌引物、狂犬病毒引物、弓形虫引物、巴氏通体引物和弯曲杆菌引物进行扩增得单重pcr产物和多重pcr产物；

具体的，单重pcr扩增体系为：10×buffer(mg²⁺)2.5μl、dntp(2.5mm)1.0μl、引物1.0μl、模板2.0μl、hotstartaq0.5u、ddh2o18.5μl、总pcr体系为25μl。其中引物分别为布鲁氏菌引物、沙门氏菌引物、狂犬病毒引物、弓形虫引物、巴氏通体引物和弯曲杆菌引物。从而分别得到布鲁氏菌目的基因bl、沙门氏菌目的基因sm、狂犬病毒目的基因wq、弓形虫目的基因gx、巴氏通体目的基因ba和弯曲杆菌目的基因kq。其中布鲁氏菌目的基因bl片段的大小为298bp，沙门氏菌目的基因sm的大小为262bp狂犬病毒目的基因wq的大小为224bp、弓形虫目的基因gx的大小为98bp、巴氏通体目的基因ba的大小为372bp和弯曲杆菌目的基因kq的大小为136bp。

具体的，加入布鲁氏菌引物2.5pmol、沙门氏菌引物2.0pmol、狂犬病毒引物2.5pmol、弓形虫引物1.0pmol、巴氏通体引物2.0pmol和弯曲杆菌引物1.0pmol。pcr扩增程序95℃3min，95℃30s，55℃30s，72℃20s，35个循环，72℃延伸1min，得到具有多重pcr产物包括布鲁氏菌目的基因bl、沙门氏菌目的基因sm、狂犬病毒目的基因wq、弓形虫目的基因gx、巴氏通体目的基因ba和弯曲杆菌目的基因kq，其中布鲁氏菌目的基因bl片段的大小为298bp、沙门氏菌目的基因sm的大小为262bp、狂犬病毒目的基因wq的大小为224bp、弓形虫目的基因gx的大小为98bp、巴氏通体目的基因ba的大小为372bp、弯曲杆菌目的基因kq为136bp。

实施例3

分别对实施例2中利用布鲁氏菌引物、沙门氏菌引物、狂犬病毒引物、弓形虫引物、巴氏通体引物和弯曲杆菌引物分别进行扩增获得的pcr产物和同时进行扩增的获得的多重pcr产物的进行电泳检测其特异性。

电泳检测结果如图1所示，其中第1-6泳道为利用布鲁氏菌引物、沙门氏菌引物、狂犬病毒引物、弓形虫引物、巴氏通体引物和弯曲杆菌引物对巴氏通体目的基因ba进行扩增的电泳图；第7泳道为利用布鲁氏菌引物、沙门氏菌引物、狂犬病毒引物、弓形虫引物、巴氏通体引物和弯曲杆菌引物同时对巴氏通体目的基因ba进行扩增的电泳图；说明布鲁氏菌引物及包含布鲁氏菌引物、沙门氏菌引物、狂犬病毒引物、弓形虫引物、巴氏通体引物和弯曲杆菌引物的多重引物均能特异性扩增巴氏通体目的基因ba。

同样，沙门氏菌引物、狂犬病毒引物、弓形虫引物、巴氏通体引物和弯曲杆菌引物及包含布鲁氏菌引物、沙门氏菌引物、狂犬病毒引物、弓形虫引物、巴氏通体引物和弯曲杆菌引物分别能特异性扩增巴氏通体目的基因ba、沙门氏菌目的基因sm、布鲁氏菌目的基因bl、弓形虫目的基因gx、弯曲杆菌目的基因kq和狂犬病毒目的基因wq。

实施例4

探针特异性检测包括以下步骤：

sss1，提供布鲁氏菌目的基因bl、沙门氏菌目的基因sm、狂犬病毒目的基因wq、弓形虫目的基因gx、巴氏通体目的基因ba和弯曲杆菌目的基因kq，分别与混合的偶联微球的探针溶液进行孵育，将孵育后的溶液加入luminex仪器中，检测结果如表3所示。结果表明，混合的偶联微球的探针溶液中每种偶联微球的探针针对目的基因片段能有效进行识别捕获，且每种偶联微球的探针对其余目的基因没有明显的非特异性杂交信号，其平均荧光强度(medianfluorenscentintensity，mfi)均低于100。因此，设计的6种探针序列针对六种单重pcr产物具有较好的特异性。

表3探针特异性检测结果

实施例5

液相芯片检测体系阈值建立

提供布鲁氏菌(bru)、沙门氏菌(sal)、狂犬病毒(rab)、弓形虫(tox)、巴氏通体(bar)和弯曲杆菌(camp)阴性样品，经dna抽提、pcr扩增。所得到的pcr产物用于液相芯片的检测，用液相芯片法测得mfi的均数和标准差，计算阈值，为85.4+3×12.56＝123.08(表4)。

表4液相芯片检测体系阈值的确定

实施例6

液相芯片体系特异性试验结果

提取其他方法确定的阳性质粒：提取沙门氏菌(sal)、布鲁氏菌(bru)、弓形虫(tox)、狂犬病病毒(rab)、巴氏通体(bar)、弯曲杆菌(camp)、小鼠肝炎(mhv)、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(lcmv)、仙台病毒(sev)、小鼠肺炎(mpv)的基因组dna，经pcr扩增后采用实施例1提供的利用液相芯片技术检测微生物的方法，进行检测，结果如表5，该方法能特异性检测出目的基因沙门氏菌(sal)、布鲁氏菌(bru)、弓形虫(tox)、狂犬病病毒(rab)、巴氏通体(bar)、弯曲杆菌(camp)，对其他相近基因小鼠肝炎(mhv)、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(lcmv)、仙台病毒(sev)、小鼠肺炎(mpv)无特异性反应，表明该方法具有良好的特异性。

表5：特异性检测结果

实施例7

验证实施例1提供利用液相芯片技术检测微生物的方法的灵敏度实验。

将沙门氏菌(sal)、布鲁氏菌(bru)、弓形虫(tox)、狂犬病病毒(rab)、巴氏通体(bar)、弯曲杆菌(camp)质粒dna作5倍、10倍、50倍稀释，并分别作为pcr扩增模板，采用实施例1提供的利用液相芯片技术检测微生物的方法进行检测，结果如表6-表9所示多重扩增-杂交体系对目的片段(参考品质粒)的检测的灵敏度为50拷贝/反应。

表6实施例7中浓度为10拷贝/反应的待测pcr产物检测信号值

表7实施例7中浓度为50拷贝/反应的待测pcr产物检测信号值

表8实施例7中浓度为100拷贝/反应的待测pcr产物检测信号值

表9实施例7中浓度为500拷贝/反应的待测pcr产物检测信号值

序列表

<110>上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心

<120>一种液相芯片技术检测微生物的方法

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