一种AFP与HBsAg双抗原基因修饰的DC联合CIK免疫细胞及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种afp与hbsag双抗原基因修饰的dc联合cik免疫细胞及其制备方法和应用。
背景技术：
肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，hcc)是严重威胁人类健康的重大疾病，是癌症发病谱中最常见的癌症类型之一，在全球范围内肿瘤相关性死亡因素中排名第三，全球每年有超过60万新发病例。肝癌的发生与乙型肝炎病毒(hepatitisbvirus，hbv)感染密切相关，由于我国是乙肝病毒感染的高发国家，因而我国肝癌发病率远高于世界平均水平，我国每年约有11万人死于肝癌。目前全球乙肝病毒慢性感染者超过3.5亿，其中约1/4可发展为严重的肝脏疾病，包括慢性肝炎、肝纤维化、肝硬化和肝细胞肝癌。乙肝表面抗原(hepatitisbsurfaceantigen，hbsag)在hbv感染、病毒颗粒形成、免疫识别、影响宿主细胞正常生理功能等方面发挥重要作用。目前hbsag与宿主细胞关系的研究主要在于以下几个方面：(1)hbsagpre-s1区和s区与肝细胞表面受体的识别与鉴定；(2)hbsag与宿主免疫应答的关系；(3)hbsag在胞内信号通路中的作用；(4)hbsag及其变异体在细胞损伤中的作用，及与肝癌发生的相关性；(5)hbsag干扰宿主的物质代谢和氧化还原反应等正常生理过程，是可能的致病机制之一。在以上研究中，一方面为细胞外hbsag颗粒通过与细胞识别产生感染，诱导和干扰免疫应答；一方面为细胞内hbsag在翻译、加工、分泌或降解过程中，通过多种机制干扰宿主正常信号通路和生理过程，产生细胞损伤，导致肝脏疾病甚至肝癌。研究表明，hbsag不仅以游离形式存在于病人血液中，也存在于乙肝相关肝癌病人的癌细胞表面，提示hbsag是其重要相关抗原，可作为乙肝相关肝癌的治疗靶点。而甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，afp)是肝癌细胞合成的高特异性蛋白质，许多肝癌患者(70％～80％)在发病期间都有afp基因高表达的特征。afp是一种胚原蛋白，其基因在胎儿发育过程开放表达，而在人出生两年后基本处于关闭状态，但是在成年人肝细胞恶性转化的早期，肝细胞内的afp基因重新被激活而大量表达，所以在临床上，afp被用作诊断肝癌的经典肿瘤标记物和金标准。afp是肝癌细胞表达的高特异性蛋白质，肝炎病毒是诱发肝癌的关键生物因素，在活动性肝炎或肝硬化后期，血清中可检验出高含量的afp存在，这是肝细胞向肝癌转化的重要标志。研究表明，afp是肝癌细胞耐受凋亡诱导的一个关键的靶分子，afp在细胞外，不仅通过与其受体的作用，激活生长信号的传递，而且afp在细胞内也能通过抑制凋亡信号的转导和激活生长信号的传递，促使肝癌细胞耐受化学药物和生物药物诱导的凋亡。所以，afp的抗凋亡作用不仅通过促增殖而且也能通过抑制凋亡信号以及激活生长信号的作用对抗体内细胞因子、化学药物诱导凋亡。相关研究，逐步揭示了甲胎蛋白所隐藏的生物学功能及其作用机制，这是afp具有信息调节分子样作用和作为靶分子治疗肝癌的新发现，为肝癌的生物治疗提供新的策略，也将为肝癌的药物治疗带来新希望。由于afp基因在肝癌的演进过程并未发现与耐药相关的任何突变，而是基因表达发生改变，特别是在肝炎病毒的迫胁下其基因如何从关闭到开放的表观遗传修饰改变，不同于突变，表观遗传改变是细胞快速应对环境变化的重要机制。因此，研究afp基因以及其翻译后的表观遗传修饰改变是探索afp功能的关键问题，也是探索afp作为治疗肝癌新靶点的核心问题，对认识肝癌发生、转移、耐药和靶向生物治疗有非常重要的临床意义。肝癌的传统治疗方法包括手术、化疗和放疗，都有严重的副作用和局限性。肿瘤的免疫治疗是近年来发展起来的新的抗肿瘤方法，通过调节患者自身的免疫而达到排斥或者杀死肿瘤细胞的免疫治疗和预防方法。免疫治疗与手术、化疗或者放射等其他抗肿瘤疗法联合使用时，取得了内外联合的抗肿瘤效果。树突状细胞(dendriticcells，dcs)是目前发现的功能最强大的抗原递呈细胞(antigenpresentingcell，apc)，也是唯一能激活初始型t细胞的apc。dc通过摄取肿瘤抗原，发育成熟后在膜上高表达mhci、ⅱ类分子，并递呈大量的肿瘤抗原给t细胞受体(tcellreceptor，tcr)以激活t细胞。近年来，随着dc疫苗抗肿瘤应用研究的开展，dc疫苗已经成为当今肿瘤生物治疗领域备受关注的焦点之一。目前dc疫苗的类型主要有肿瘤全细胞抗原致敏的dc疫苗、肿瘤抗原多肽致敏的dc疫苗和基因修饰的dc疫苗等。上世纪九十年代，schmidt-wolf报道了细胞因子诱导的杀伤性细胞(cytokine-inducedkillercell，cik)，它是一种来源于人体外周血pbmc(peripheralbloodmonoclonalcells)的细胞，在体外用多种细胞因子与cd3单克隆抗体共同培养后所获得的以cd3、cd56t细胞为主的异质细胞群，其主要效应细胞表面既有t细胞表面标志(cd3)，也有自然杀伤细胞表面标志(cd56)，因而兼有t淋巴细胞抗瘤活性和自然杀伤细胞非mhc限制性的特点。在随后数年的研究中发现，上述两种细胞，即dc与cik细胞共培养后，cik细胞的增殖能力及对肿瘤细胞杀伤能力均大大增强，这种杀伤能力主要依赖同时表达cd3、cd56的t淋巴细胞。二者具有一定的互补作用，联合应用将取得“1+1>2”的疗效，从而发挥协同抗肿瘤作用。传统治疗hbv相关肝癌的dc主要有三种：空负载的dc、病人肿瘤组织裂解物负载的dc。这两种dc都有明显的不足之处：空负载的dc只能表达基础的共刺激因子与粘附因子且不具备特异性；肿瘤组织裂解物负载的dc往往由于抗原负载率低，导致递呈效果不佳，特异性低，疗效不显著。目前在临床上使用的dc-cik技术常通过电转染、病毒转染、穿膜肽等技术来负载肿瘤抗原，促使dc细胞成熟并有效递呈肿瘤抗原肽，活化cik，发挥杀伤肿瘤细胞作用。综上所述，对于乙肝病毒相关肝癌的细胞治疗，临床上迫切需要一种既能有效识别乙肝病毒抗原又能敏锐捕捉肝癌细胞信号的apc，将信号传递给高效杀伤细胞，最终将乙肝病毒以及肝癌细胞一网打尽。技术实现要素：本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种afp与hbsag双抗原基因修饰的dc联合cik免疫细胞及其制备方法和应用。为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：一种afp与hbsag双抗原基因修饰的dc联合cik免疫细胞，其特征在于，首先构建phage-afp-hbsag重组质粒，然后将重组质粒phage-afp-hbsag、辅助质粒pspax2和pmd2g用磷酸钙转染试剂共转染293t细胞，获得afp-hbsag重组慢病毒；随后用afp-hbsag重组慢病毒感染dc细胞获得afp-hbsag修饰的dc细胞，最后将afp-hbsag修饰的dc细胞与cik细胞的联合培养，得到dc联合cik免疫细胞。上述afp与hbsag双抗原基因修饰的dc联合cik免疫细胞的制备方法，包括如下步骤：(1)phage-afp-hbsag重组质粒的构建：以表达afp和hbsag的乙肝阳性肝癌患者癌组织样本为模板，设计引物、对afp基因片段进行pcr扩增，将afp基因pcr产物双酶切后与慢病毒表达载体连接，然后转化至宿主细胞，再经抗性筛选获得重组质粒phage-afp；将hbsag基因pcr产物双酶切后与重组质粒phage-afp连接，然后转化至宿主细胞，再经抗性筛选获得重组质粒phage-afp-hbsag；(2)afp-hbsag重组慢病毒的纯化浓缩：提取慢病毒重组质粒phage-afp-hbsag、辅助质粒pspax2和pmd2g，将三种质粒用磷酸钙转染试剂共转染293t细胞，转染48～72h后，收集病毒上清液，经离心、过滤、超速离心后，弃上清，取沉淀用无血清培养基溶解过夜，即得afp-hbsag重组慢病毒浓缩液；(3)afp-hbsag重组慢病毒感染dc细胞：a.采集外周血，离心，弃上清，取沉淀细胞，加生理盐水是沉淀细胞充分悬浮；b.采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化，获得纯度在90％以上的单个核细胞(pbmc)；c.用aim-v无血清培养液调整pbmc细胞浓度至2x106/ml，置于培养瓶内，37℃，5％co2培养箱中孵育2h，以使单核细胞贴壁；收集贴壁细胞(主要是cd14+的单核细胞)，加入含细胞因子的aim-v无血清培养液，37℃，5％co2培养箱中培养，诱导单核细胞向dc细胞分化；d.每3天半量换液一次，并补足细胞因子；在培养的第5天，加入之前获得的afp-hbsag重组慢病毒浓缩液，以moi＝5～10对dc进行感染；e.培养的第7天或第8天，即感染后48h或72h，细胞数量达到1×107个以上，收获afp-hbsag修饰的dc细胞；(4)cik细胞培养：收集上述单个核细胞中未贴壁的悬浮细胞，用cik无血清培养液调整细胞浓度至1～2x106/ml，加入1000u/ml的重组人ifn-γ继续培养；培养24h后加入100ng/ml的cd3单克隆抗体和1000u/ml的重组人il-2，刺激cik细胞的生长和增殖；每3天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人il-21000u/ml，在培养的第7天或第8天，数量达到1x109个以上，收获cik细胞；(5)afp-hbsag修饰的dc细胞与cik细胞的联合培养：将afp-hbsag修饰的dc细胞和cik细胞按照细胞数目比1:10的比例在无血清培养液中共培养，无血清培养液中添加1000u/ml重组人il-2，每3天半量换液一次，并补加1000u/ml重组人il-2，共培养7天后，收集dc-cik细胞，细胞数量应达到1×1010个以上。上述方案中，所述步骤(1)所述phage-afp-hbsag重组质粒的构建过程具体包括：(a)根据genebank登录的afp和hbsag全长cds序列，分别设计p1/p2、p3/p4两对引物用于扩增afp基因片段和hbsag基因片段，且在所述用于扩增afp基因片段的引物p1/p2上引入bamhⅰ、xhoⅰ酶切位点，在所述用于扩增hbsag基因片段的引物p3/p4上引入xhoⅰ和nheⅰ酶切位点；以表达afp和hbsag的乙肝阳性肝癌患者癌组织样本为模板，对afp基因片段和hbsag基因片段分别进行pcr扩增，用bamhi和xhoⅰ酶双酶切afp基因pcr产物和慢病毒表达载体phage-cmv-mcs-izsgreen，经凝胶回收盒回收后，用dna连接酶连接，然后转化至大肠杆菌宿主细胞在氨苄青霉素抗性下筛选阳性克隆，获得重组质粒phage-afp，小提质粒并经bamhⅰ、xhoⅰ酶双酶切鉴定重组质粒含1800bp条带目的基因；(b)用xhoⅰ和nheⅰ酶切双酶切hbsag基因pcr产物和重组质粒phage-afp，经凝胶回收盒回收后，用dna连接酶连接，然后转化至大肠杆菌宿主细胞，在氨苄青霉素抗性下筛选阳性克隆，获得重组质粒phage-afp-hbsag，小提质粒并经xhoⅰ和nheⅰ酶切双酶切鉴定重组质粒含1400bp条带目的基因；其中，所述p1、p2、p3、p4的引物为：p1：ggattcatgaagtgggtggaatcaat；p2：ctcgagttaaactcccaaagcagca；p3：ctcgagatgggaggttggtcttcc；p4：gctagcgtagatctaaggcatcaaggc。上述方案中，步骤(2)所述重组质粒phage-afp-hbsag、辅助质粒pspax2和pmd2g的质量比为3:2:2。上述方案中，步骤(2)所述离心为：4℃、500g离心10min，所述过滤为通过0.45μm滤器过滤，所述超速离心为：4℃、26000r/min超速离心4h。上述方案中，步骤(3)所述细胞因子为：重组人gm-csf500～1000u/ml和重组人il-4500u/ml。上述方案中，步骤(4)所述cik细胞培养中，在加入100ng/ml的cd3单克隆抗体和1000u/ml的重组人il-2时，可同时加入100u/ml的重组人il-1a。上述afp与hbsag双抗原基因修饰的dc联合cik免疫细胞在制备用于治疗治疗hbv相关肝癌药品中的应用。本发明的有益效果如下：(1)本发明利用基因工程技术获得了phage-afp-hbsag慢病毒重组质粒，并优化了包装及慢病毒浓缩纯化技术，最终高滴度的phage-afp-hbsag慢病毒感染dc细胞使其基因组插入afp、hbsag双抗原全序列片段，通过鉴定，dc细胞能持续稳定的表达afp及hbsag两种抗原，同时dc的标志性细胞因子表型cd80，cd86，cd83，mhc-ⅱ均有高表达，说明慢病毒感染对dc的培养和分化没有显著影响；(2)本发明优化了基因修饰dc细胞联合cik细胞的培养方案，14天培养(共培养7天)后，对dc-cik细胞进行质检，其技术指标为dc-cik细胞总量为1×1010～1.4×1010个；细胞存活率≥95％；dc-cik纯度≥90％；cd3+cd56+双阳性率≥25％；cd80+cd83+≥30％；cd4+cd25+≤5％；对肝癌细胞体外细胞毒活性水平＞80％(效靶比为5:1)；细菌、真菌、支原体检测为阴性，内毒素＜0.25eu/ml；同时，以两种肝癌细胞为靶细胞进行体外杀瘤测试，结果表明，afp-hbsag修饰dc-cik细胞对乙肝阳性的肝癌细胞hepg2.215和普通肝癌细胞hepg2都具有极高的特异杀伤活性，在效应细胞：靶细胞为5:1时分别达到了97.8±10.2％和78.5±12.3％；说明双抗原修饰dc与cik联合应用，使dc捕获肝癌细胞和感染hbv细胞的过程与cik对其的杀伤过程紧密结合，整个识别、杀灭过程更加完善，杀伤效果更加显著；(3)本发明还开展了afp-hbsag修饰dc联合cik在治疗乙肝相关小肝癌ⅰ期临床应用的研究，临床实验的结果在一定程度上达到了我们的技术发明预期：afp、hbsag双抗原表达的dc具有识别肝癌细胞和hbv感染肝细胞的双重特异性，并将其捕获后呈递给相应的ctl进行杀灭既能杀灭肝癌细胞又能遏制hbv大量增殖带来的恶性影响。附图说明图1为phage-afp鉴定电泳图谱。图2为phage-afp-hbsag鉴定电泳图谱。图3为转导phage-afp-hbsag慢病毒的真核细胞荧光照片，a：阴性细胞对照；b：转导慢病毒的真核细胞。图4为westernblot检测afp和hbsag蛋白表达。图5为dc细胞荧光照片，其中a：感染后48h；b：感染后72h。图6为第14天dc-cik细胞流式表型分析。图7为各组dc-cik细胞对肝癌细胞的体外杀伤效率。图8为afp-hbsag修饰dc联合cik临床治疗方案。图9为4号病人治疗前后的ct照片。具体实施方式为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。实施例1afp和hbsag重组慢病毒表达体系的构建1、phage-afp-hbsag重组质粒的构建：根据genebank登录的afp和hbsag全长cds序列，我们设计如下2对引物，引物在p1，p2，p3和p4位置分别引入bamhⅰ，xhoⅰ，xhoⅰ和nheⅰ酶切位点：p1：ggattcatgaagtgggtggaatcaatp2：ctcgagttaaactcccaaagcagcap3：ctcgagatgggaggttggtcttccp4：gctagcgtagatctaaggcatcaaggc以表达afp和hbsag的乙肝阳性肝癌患者癌组织样本为模板，进行pcr扩增。其中p1、p2可扩增afp基因片段，p3和p4可扩增hbsag基因片段。用bamhi和xhoⅰ双酶切afp基因pcr产物和慢病毒表达载体phage-cmv-mcs-izsgreen，凝胶回收盒回收afp基因片段和线性phage载体。胶回收后，用dna连接酶，16℃连接过夜，转化大肠杆菌dh5a菌株，单克隆扩增，小提质粒后，bamhi和xhoⅰ双酶切鉴定的约1800bp条带，在氨苄青霉素抗性下筛选阳性克隆，获得重组质粒phage-afp，鉴定正确电泳图谱如图1所示。将鉴定正确的重组质粒以15％甘油菌形式-70℃保存，并测序鉴定正确，其afp阅读框序列见seqidno：1，afp蛋白质序列见seqidno：2。再用xhoⅰ和nheⅰ酶切双酶切hbsag基因pcr产物和重组质粒phage-afp，凝胶回收盒回收hbsag基因片段和线性phage-afp载体。胶回收后，用dna连接酶，16℃连接过夜，转化大肠杆菌dh5a菌株，单克隆扩增，小提质粒后，xhoⅰ和nheⅰ双酶切鉴定的约1400bp条带，在氨苄青霉素抗性下筛选阳性克隆，获得重组质粒phage-afp-hbsag，鉴定正确电泳图谱如图2所示。将鉴定正确的重组质粒以15％甘油菌形式-70℃保存，并测序鉴定正确，其hbsag基因阅读框序列见seqidno：3，hbsag抗原氨基酸序列见seqidno：4。2、phage-afp-hbsag重组蛋白的真核表达及鉴定:将重组慢病毒表达质粒phage-afp-hbsag和包装质粒pspax2和包膜质粒pmd2g共转染293t细胞，转染48h后收取含有病毒的培养上清，并用0.45μm的滤膜过滤得到病毒原液。然后用此病毒原液再转导293t细胞，48h后观察绿色荧光蛋白在细胞中表达情况如图3所示，在293t细胞内绿色荧光蛋白有大量的表达，预示着目的蛋白的表达(图3.b)，而没有转染的细胞则无绿色荧光蛋白产生。同时，我们将转导了慢病毒phage-afp-hbsag，空病毒phage和不转导病毒的293t细胞的蛋白样品做sds-page电泳后进行westernblot检测。结果如图4所示：当用afp蛋白和hbsag蛋白的鼠源单抗分别检测时，转导慢病毒phage-afp-hbsag细胞都有清晰的条带，均为120kd左右的afp-hbsag偶联蛋白，对应转导了空病毒phage和未转导的mock细胞，两者均不能检测到特异性蛋白。这一结果进一步说明我们克隆出来的afp-hbsag基因是正确的，能在真核细胞293t中表达，并能被其特异性抗体检测出来。实施例2afp-hbsag修饰dc联合cik培养1、phage-afp-hbsag慢病毒纯化浓缩用质粒大提试剂盒分别提取慢病毒表达质粒phage-afp-hbsag和包装质粒pspax2和包膜质粒pmd2g，分光光度计测定质粒浓度，三种质粒以3：2：2的质量比用磷酸钙转染试剂共转染293t细胞。分别在转染72h时收集病毒上清于15ml管中，4℃，500g离心10min，转移上清至新15ml管中，用0.45μm滤器过滤病毒上清；过滤的病毒上清于4℃，26000r/min超速离心4h，弃上清，沉淀用4℃预冷的gibcoaim-v无血清培养基溶解过夜，即得phage-afp-hbsag病毒浓缩液，进行分装，-80℃保存备用。2、dc细胞培养及phage-afp-hbsag慢病毒感染dc细胞的培养流程如下：2.1将采集的外周血收集到2支离心管中，2000r/min离心5min，弃上清，将沉淀细胞混合，到加生理盐水至25ml，使沉淀细胞充分悬浮；2.2用淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(pbmc)；aim-v无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90％以上的pbmc；2.3获得的pbmc用aim-v无血清培养液调整细胞浓度至2x106/ml，置于培养瓶内，37℃，5％co2培养箱中孵育2h，以使单核细胞贴壁；贴壁细胞(主要是cd14+的单核细胞)，加入含重组人gm-csf500～1000u/ml和重组人il-4500u/ml的aim-v无血清培养液，37℃，5％co2培养箱中培养，诱导单核细胞向dc细胞分化；2.4每3天半量换液一次，并补足细胞因子(重组人gm-csf500～1000u/ml和重组人il-4500u/ml)；在培养的第5天，加入之前获得的phage-afp-hbsag浓缩病毒或空载phage慢病毒(对照组)，以moi＝5～10对dc进行感染；2.5培养的第7天(感染后48h)或第8天(感染后72h)，收获dc细胞，其数量应达到1×107个以上，对dc细胞进行质检，测定细胞表型及感染效率。表1phage-afp-hbsag慢病毒感染效率及对dc细胞各因子表型影响细胞组阳性率(％)cd83(％)cd86(％)cd80(％)hla-dr(％)空白细胞068.3±7.373.5±6.488.4±7.893.2±6.5感染空载细胞91.4±8.266.2±6.275.3±5.883.2±6.491.8±5.8感染双抗原细胞78.8±6.269.1±7.171.9±4.980.8±3.992.5±4.4其荧光照片如图5，分别拍取感染后48h，72h的dc细胞荧光照片，表明dc细胞被高效感染，有载体自带的荧光蛋白表达，也即是有afp-hbsag融合蛋白的表达。同时对感染后48h的dc细胞进行流式分析，其细胞表型见表1：感染空载phage慢病毒的dc阳性率极高，达到91.4±8.2％；感染phage-afp-hbsag慢病毒的dc也较高的阳性率(78.8±6.2％)，说明浓缩后的包装慢病毒能很好的对dc细胞进行基因修饰，使其稳定表达重组afp-hbsag融合蛋白。同时，无论感染空载phage慢病毒还是phage-afp-hbsag慢病毒的dc细胞，与不感染的dc细胞一样，其标志性细胞因子表型cd80，cd86，cd83，mhc-ⅱ均有高表达，说明慢病毒感染对dc的培养和分化没有显著影响。3、afp-hbsag修饰dc-cik的联合培养3.1、cik细胞培养取上述步骤2.3中的pbmc细胞中的未贴壁细胞，用cik无血清培养液调整细胞浓度至1～2x106/ml，加入1000u/ml的重组人ifn-γ培养；24h后加入100ng/ml的cd3单克隆抗体和1000u/ml的重组人il-2，刺激cik细胞的生长和增殖，此时也可同时加入100u/ml的重组人il-1a；每3天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人il-21000u/ml；培养的第7天或第8天，收获cik细胞，此时数量应达到1x109个以上。3.2、dc-cik的联合培养收集上述步骤中所获得的dc细胞和cik细胞，按1：10(数目比)的比例在aim-v无血清培养液中共培养，所述aim-v无血清培养液中添加了重组人il-2(1000u/ml)；每3天半量换液一次，并补加重组人il-2(1000u/ml)；共培养7天后，收集dc-cik细胞，细胞数量应达到1×1010个以上。对dc-cik细胞进行质检，其技术指标为使得双抗原修饰的dc细胞数量应达到6～12×106个；dc-cik联合共培养经过5～7天，培养细胞总量为1×1010～1.4×1010个；细胞存活率≥95％；cd3+cd56+双阳性率≥25％；cd80+cd83+≥30％；cd4+cd25+≤5％；对肝癌细胞体外细胞毒活性水平＞80％；细菌、真菌、支原体检测为阴性，内毒素＜0.25eu/ml。部分流式表型分析结果见图6，cd3：94.5％；cd3cd4：24.7％；cd3cd8：52.3％；cd3cd56：25.7％。实施例3dc-cik的体外杀伤肝癌细胞实验取稳定表达乙肝表面抗原的肝癌细胞hepg2.215与普通肝癌细胞hepg2，用羧基荧光素琥珀酞亚胺酰(cfse)进行预染色，次日与实施例2制备的afp-hbsag修饰dc-cik细胞以1:5、1:10、1:20的比率进行共培养，经过4小时的共培养后，pi进行染色。流式细胞术对细胞凋亡进行检测，细胞死亡的量根据下面的公式计算：死亡率＝(对照-样品)/对照×100％，对照为未加dc-cik的肿瘤细胞：样本为加入dc-cik的肿瘤细胞，如图7所示：afp-hbsag修饰dc-cik细胞对乙肝阳性的肝癌细胞hepg2.215和普通肝癌细胞hepg2都具有极高的特异杀伤活性，在效应细胞：靶细胞为5:1时分别达到了97.8±10.2％和78.5±12.3％。实施例4afp-hbsag修饰dc联合cik治疗乙肝相关小肝癌的临床研究小肝癌又称为亚临床肝癌或早期肝癌，临床上无明显肝癌症状和体征。小肝癌一般指肝细胞癌中单个癌结节最大直径不超过3厘米或两个癌结节直径之和不超过3厘米的肝癌称为小肝癌。患者常无临床症状。瘤结节多呈球形，边界清楚，切面均匀一致，无出血及坏死。我国的小肝癌标准是：单个癌结节最大直径不超过3厘米；多个癌结节数目不超过两个，其最大直径总和应小于3厘米。研究表明，hbv与小肝癌有密切关系，两者相关率高达80％。人群hbv感染率与小肝癌地理分布一致。全球范围内的多项流行病学调查显示，小肝癌多发的地区，发病率一般在30/10万以上，这些地区正好也是hbv感染高流行区。有数据表明中国台湾地区从20世纪80年代开始对儿童普遍接种乙型病毒性肝炎疫苗后，小肝癌发病率也随之下降。所以说小肝癌的最重要形成因素是病毒性肝炎。因此，我们选取hbv阳性的小肝癌患者进组，用afp-hbsag修饰dc联合cik细胞免疫疗法进行临床研究。本研究为ⅰ期临床研究，已由当地医院临床研究伦理委员会批准，所有患者在进组之前均签署了书面的知情同意书，该研究的首要目的是评估afp-hbsag修饰dc联合cik细胞的安全性，观察其毒性和副作用，同时观察患者接受治疗后外周血淋巴细胞的百分比变化，同时观察免疫治疗对患者hbv病毒载量的影响，最后在一定程度上评估该特异性免疫疗法对hbv阳性小肝癌治疗的有效性。1、hbv阳性小肝癌患者招募进组十例hbv阳性小肝癌招募进入本临床研究(临床数据见表2)表210名hbv阳性小肝癌患者的临床参数afp:甲胎蛋白；alt：谷丙转氨酶；tp：胸腺嘧啶核苷磷酸化酶纳入标准包括以下内容：肝肿瘤为5厘米或更小的单发结节性；多发性结节性肝肿瘤3厘米以下，数量为3或更少；无门静脉血栓或肝外转移瘤；childpugh分类a或b；肿瘤可及性经皮途径治疗；慢性乙型肝炎hbv阳性；在肝癌诊断前肝硬化不到3年。门诊化验室所需化验指标如下：血红蛋白＞10g/dl，白细胞计数＞2×109/l，血小板计数＞75×109/l，血清肌酐＜110μmol/l，天门冬氨酸氨基转移酶＜3倍上限，血清胆红素＜2.5倍上限，凝血酶原时间＜19秒。患者要求丙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒阴性。排除标准包括：怀孕或哺乳；精神问题，药物成瘾，或任何其他妨碍了知情同意的行为；不可控重度感染；并发全身糖皮质激素治疗；全身性自身免疫性疾病；临床显著缺血性心脏病或心力衰竭；6个月内接受了化疗或放疗。2、自体afp-hbsag修饰dc联合cik培养与治疗方案采集临床受试患者自体血50ml，分离单个淋巴细胞并制备afp-hbsag修饰dc联合cik免疫细胞：①自体血清制备：将抗凝外周血室温离心，缓升缓降，吸取血浆，然后离心，去沉淀，上清即为所需血清，4℃保存备用；②将采集的外周血收集到2支离心管中，2000r/min离心5min，弃上清，将沉淀细胞混合，到加生理盐水至25ml，使沉淀细胞充分悬浮；③淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(pbmc)；aim-v无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90％以上的pbmc；④获得的pbmc用aim-v无血清培养液调整细胞浓度至2x106/ml，置于培养瓶内，37℃，5％co2培养箱中孵育2h，以使单核细胞贴壁；贴壁细胞(主要是cd14+的单核细胞)，加入含细胞因子(重组人gm-csf500～1000u/ml和重组人il-4500u/ml)的aim-v无血清培养液，37℃，5％co2培养箱中培养，诱导单核细胞向dc细胞分化；每3天半量换液一次，并补足细胞因子，在培养的第5天，加入之前获得的phage-afp-hbsag浓缩病毒，以moi＝5～10对dc进行感染，培养的第7天(感染后48h)或第8天(感染后72h)，收获dc细胞，其数量应达到1×107个以上，对dc细胞进行质检，测定细胞表型及感染效率。⑤未贴壁的悬浮细胞，用cik无血清培养液调整细胞浓度至1～2x106/ml，加入1000u/ml的重组人ifn-γ培养；24h后加入100ng/ml的cd3单克隆抗体和1000u/ml的重组人il-2，刺激cik细胞的生长和增殖，此时也可同时加入100u/ml的重组人il-1a，每3天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人il-21000u/ml，培养7天或8天，收获cik细胞，此时数量应达到1x109个以上；⑥收集所获得的dc细胞和cik细胞，按1：10(数目比)的比例在aim-v无血清培养液中共培养，所述aim-v无血清培养液中添加重组人il-2(1000u/ml)；⑦共培养第1天，视细胞生长状态，补加dc-cik工作液(aim-v无血清培养液)至1200ml；⑧共培养第3天，视细胞生长状态，将培养袋中细胞悬液转为两袋，分别补dc-cik工作液(aim-v无血清培养液)至1500ml(①)、1500ml(②)，取样送检验科做细菌、真菌、内毒素、支原体，cd3+cd56+等检测。⑨共培养第6天，收集①袋中细胞悬液300ml(约10～15亿细胞)，1500rpm×10min离心后弃去上面清液，将细胞悬于250ml生理盐水中，加入20万iu的il-2，20ml20％人血清白蛋白，封装好后送病房回输患者，同时留样封存；⑩共培养第7天，收集①袋中细胞悬液900ml(约30～45亿细胞)，1500rpm×10min离心后弃去上面清液，将细胞悬于250ml生理盐水中，加入20万iu的il-2，20ml20％人血清白蛋白，封装好后送病房回输患者，同时留样封存；共培养第8天，收集①、②袋中细胞悬液总计1800ml(约60～90亿细胞)，1500rpm×10min离心后弃去上面清液，将细胞悬于250ml生理盐水中，加入20万iu的il-2，20ml20％人血清白蛋白，封装好后送病房回输患者，同时留样封存；对每个病人进行两个疗程的afp-hbsag修饰dc联合cik免疫细胞治疗，每个疗程涉及三次细胞回输，其治疗流程如图8所示，分别在治疗前-8天，治疗后30，90和180天采血留样，分析患者的外周血淋巴细胞组成及hbvdna载量，同时密切观察免疫细胞对患者的毒副作用，并根据其他检测指标评估免疫细胞治疗的有效性。3、afp-hbsag修饰dc联合cik治疗乙肝相关小肝癌临床评估3.1毒性和副作用评估无严重的不良事件，总共进行60次细胞输注(每个病人两个疗程共6次细胞输注)。总共记录31个不良事件。不良事件包括i级/ii发热(29细胞输注，48％)和不适(12细胞输注，20％)，这些不良反应可以在2至72小时内恢复。没有观察到显著性肝、肾、肺、心、血液或由于细胞输注引起的神经毒性。没有观察自身免疫反应的临床表现。3.2免疫细胞回输前后患者淋巴细胞组成和hbvdna载量的变化治疗前-8天，治疗后30，90和180天采血留样，分析患者的外周血淋巴细胞组成，具体数据见表3：多组实验数据比较结果显示，接受治疗后，调节t细胞cd4+cd25+的和效应t细胞cd8+cd28-的比例发生了明显的变化，而其他淋巴细胞百分比没有显著改变。接受治疗一个月后，cd4+cd25+调节性高t细胞百分率显著下降(p＜0.05)，cd8+cd28-效应t细胞的百分比显著增加(p＜0.05)。治疗三个月后，cd8+cd28-效应细胞的百分比仍明显升高(p＜0.05)，而cd4+cd25+tregs的比例有明显下降(p＜0.05)而cd4+cd25high的比例无明显变化。治疗六个月后，虽然cd8+cd28-百分比效应t细胞仍在增加，但淋巴细胞亚群相比已经无显着差异了。表3afp-hbsag修饰dc联合cik治疗前后患者淋巴细胞参数*与治疗前相比，该淋巴细胞组分百分比发生了显著变化同时，取治疗前-8天，治疗后30和180天的血样，检测患者治疗前后hbvdna载量的变化。具体数据见表4：表4afp-hbsag修饰dc联合cik治疗前后患者hbvdna载量变化经过1个月的治疗后，所有8个可测的患者hbv载量都发生了显著降低，并有1位患者的hbvdna已降至检测下限；免疫治疗6个月后，几乎所有的患者(6/8)hbvdna载量已低于检测下限，其余两位患者的病毒载体也已经及其显著降低。说明该特异性免疫细胞疗法能显著改善患者的免疫状态，增强机体抗病毒能力。3.3部分病人afp-hbsag修饰dc联合cik治疗前后的影像学检查4号病人治疗前后的ct照片如图9所示，该病人治疗前的肿瘤大小为49×31mm，经过两个疗程共计6次afp-hbsag修饰dc联合cik治疗治疗后，最终肿瘤缩小到21×13mm大小，说明特异性免疫细胞疗法对该病人的hbv阳性小肝癌有显著的治疗效果，更充分的实验数据需要进一步的临床试验研究。综上，通过观察患者接受治疗后外周血淋巴细胞的百分比变化，观察免疫治疗对患者hbv病毒载量的影响，最后在一定程度上评估该特异性免疫疗法对hbv阳性小肝癌治疗的有效性；最终结果显示，该疗法无严重的不良事件，不良事件都在可控范围内，总体是安全的；接受治疗后，调节t细胞cd4+cd25+的比例显著下降，而效应t细胞cd8+cd28-的比例显著上升，而其他淋巴细胞百分比没有显著改变，这一变化在治疗后180天依然存在，说明患者的免疫系统被持续激活；经过治疗后，患者的hbvdna载量显著降低，大部分患者病毒载量低于检测下限，说明该特异性免疫细胞疗法能显著改善患者的免疫状态，增强机体抗病毒能力；最后ct结果显示治疗后部分病人的肿瘤组织显著缩小，证明该方法对这些病人的hbv小肝癌有显著疗效，但最终的有效性评估需要更大的样本量和更长的随访期来证明。临床实验的结果在一定程度上达到了我们的技术发明预期：afp、hbsag双抗原表达的dc具有识别肝癌细胞和hbv感染肝细胞的双重特异性，并将其捕获后呈递给相应的ctl进行杀灭既能杀灭肝癌细胞又能遏制hbv大量增殖带来的恶性影响。显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。序列表<110>武汉大学人民医院（湖北省人民医院）<120>一种afp与hbsag双抗原基因修饰的dc联合cik免疫细胞及其制备方法和应用<160>4<210>1<211>1830bp<212>dna<213>afp阅读框序列<400>1atgaagtgggtggaatcaatttttttaattttcctactaaattttactgaatccagaaca60ctgcatagaaatgaatatggaatagcttccatattggattcttaccaatgtactgcagag120ataagtttagctgacctggctaccatattttttgcccagtttgttcaagaagccacttac180aaggaagtaagcaaaatggtgaaagatgcattgactgcaattgagaaacccactggagat240gaacagtcttcagggtgtttagaaaaccagctacctgcctttctggaagaactttgccat300gagaaagaaattttggagaagtacggacattcagactgctgcagccaaagtgaagaggga360agacataactgttttcttgcacacaaaaagcccactccagcatcgatcccacttttccaa420gttccagaacctgtcacaagctgtgaagcatatgaagaagacagggagacattcatgaac480aaattcatttatgagatagcaagaaggcatcccttcctgtatgcacctacaattcttctt540tgggctgctcgctatgacaaaataattccatcttgctgcaaagctgaaaatgcagttgaa600tgcttccaaacaaaggcagcaacagttacaaaagaattaagagaaagcagcttgttaaat660caacatgcatgtgcagtaatgaaaaattttgggacccgaactttccaagccataactgtt720actaaactgagtcagaagtttaccaaagttaattttactgaaatccagaaactagtcctg780gatgtggcccatgtacatgagcactgttgcagaggagatgtgctggattgtctgcaggat840ggggaaaaaatcatgtcctacatatgttctcaacaagacactctgtcaaacaaaataaca900gaatgctgcaaactgaccacgctggaacgtggtcaatgtataattcatgcagaaaatgat960gaaaaacctgaaggtctatctccaaatctaaacaggtttttaggagatagagattttaac1020caattttcttcaggggaaaaaaatatcttcttggcaagttttgttcatgaatattcaaga1080agacatcctcagcttgctgtctcagtaattctaagagttgctaaaggataccaggagtta1140ttggagaagtgtttccagactgaaaaccctcttgaatgccaagataaaggagaagaagaa1200ttacagaaatacatccaggagagccaagcattggcaaagcgaagctgcggcctcttccag1260aaactaggagaatattacttacaaaatgcgtttctcgttgcttacacaaagaaagccccc1320cagctgacctcgtcggagctgatggccatcaccagaaaaatggcagccacagcagccact1380tgttgccaactcagtgaggacaaactattggcctgtggcgagggagcggctgacattatt1440atcggacacttatgtatcagacatgaaatgactccagtaaaccctggtgttggccagtgc1500tgcacttcttcatatgccaacaggaggccatgcttcagcagcttggtggtggatgaaaca1560tatgtccctcctgcattctctgatgacaagttcattttccataaggatctgtgccaagct1620cagggtgtagcgctgcaaacgatgaagcaagagtttctcattaaccttgtgaagcaaaag1680ccacaaataacagaggaacaacttgaggctgtcattgcagatttctcaggcctgttggag1740aaatgctgccaaggccaggaacaggaagtctgctttgctgaagagggacaaaaactgatt1800tcaaaaactcgtgctgctttgggagtttaa1830<210>2<211>609<212>prt<213>人甲胎蛋白<400>2metlystrpvalgluserilepheleuilepheleuleuasnphethr151015gluserargthrleuhisargasnglutyrglyilealaserileleu202530aspsertyrglncysthralagluileserleualaaspleualathr354045ilephephealaglnphevalglnglualathrtyrlysgluvalser505560lysmetvallysaspalaleuthralaileglulysprothrglyasp65707580gluglnserserglycysleugluasnglnleuproalapheleuglu859095gluleucyshisglulysgluileleuglulystyrglyhisserasp100105110cyscysserglnserglugluglyarghisasncyspheleualahis115120125lyslysprothrproalaserileproleupheglnvalproglupro130135140valthrsercysglualatyrglugluasparggluthrphemetasn145150155160lyspheiletyrgluilealaargarghispropheleutyralapro165170175thrileleuleutrpalaalaargtyrasplysileileprosercys180185190cyslysalagluasnalavalglucyspheglnthrlysalaalathr195200205valthrlysgluleuarggluserserleuleuasnglnhisalacys210215220alavalmetlysasnpheglythrargthrpheglnalailethrval225230235240thrlysleuserglnlysphethrlysvalasnphethrgluilegln245250255lysleuvalleuaspvalalahisvalhisgluhiscyscysarggly260265270aspvalleuaspcysleuglnaspglyglulysilemetsertyrile275280285cysserglnglnaspthrleuserasnlysilethrglucyscyslys290295300leuthrthrleugluargglyglncysileilehisalagluasnasp305310315320glulysprogluglyleuserproasnleuasnargpheleuglyasp325330335argasppheasnglnpheserserglyglulysasnilepheleuala340345350serphevalhisglutyrserargarghisproglnleualavalser355360365valileleuargvalalalysglytyrglngluleuleuglulyscys365370375pheglnthrgluasnproleuglucysglnasplysglyglugluglu380385390395leuglnlystyrileglngluserglnalaleualalysargsercys400405410glyleupheglnlysleuglyglutyrtyrleuglnasnalapheleu415420425valalatyrthrlyslysalaproglnleuthrsersergluleumet430435440alailethrarglysmetalaalathralaalathrcyscysglnleu445450455sergluasplysleuleualacysglygluglyalaalaaspileile460465470475ileglyhisleucysilearghisglumetthrprovalasnprogly480485490valglyglncyscysthrsersertyralaasnargargprocysphe495500505serserleuvalvalaspgluthrtyrvalproproalapheserasp510515520asplyspheilephehislysaspleucysglnalaglnglyvalala525530535leuglnthrmetlysglnglupheleuileasnleuvallysglnlys540545550555proglnilethrglugluglnleuglualavalilealaasppheser560565570glyleuleuglulyscyscysglnglyglngluglngluvalcysphealaglugluglyglnlysleuileserlysthrargalaalaleugly609val<210>3<211>1436bp<212>dna<213>hbsag基因阅读框序列<400>3atgggaggttggtcttccaaacctcgacaaggcatggggacgaatctttctgttcccaat60cctctgggattctttcccgatcaccagttggaccctgcgttcggagccaactcaaacaat120ccagattgggacttcaaccccaacaaggatcattggccagaggcaaatcaggtaggagcg180ggagcattcgggccagggttcaccccaccacacggcggtcttttggggtggagccctcag240gctcagggcatattgacaacagtgccagcagcacctcctcctgcctccaccaatcggcag300tcaggaagacagcctactcccatctctccacctctaagagacagtcatcctcaggccatg360cagtggaactccacgacattccaccaagctctgctagatcccagagtgaggggcctatat420tttcctgctggtggctccagttccggaacagtaaaccctgttccgactactgcctcaccc480atatcgtcaatcttctcgaggactggggaccctgcaccgaacatggagagcacaacatca540ggattcctaggacccctgctcgtgttacaggcggggtttttcttgttgacaagaatcctc600acaataccacagagtctagactcgtggtggacttctctcaattttctagggggagcaccc660acgtgtcctggccaaaattcgcagtccccaacctccaatcactcaccaacctcttgtcct720ccaacttgtcctggctatcgctggatgtgtctgcggcgttttatcatattcctcttcatc780ctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactaccaaggtatgttgcccgtt840tgtcctctacttccaggaacatcaactaccagcacgggaccatgcaagacctgcacgatt900cctgctcaaggaacctctatgtttccctcttgttgctgtacaaaaccttcggacggaaac960tgcacttgtattcccatcccatcatcctgggctttcgcaagattcctatgggagtgggcc1020tcagtccgtttctcctggctcagtttactagtgccatttgttcagtggttcgtagggctt1080tcccccactgtttggctttcagttatatggatgatgtggtattgggggccaagtctgtac1140aacatcttgagtccctttttacctctattaccaattttcttttgtctttgggtatacatt1200tgaatcctaataaacccaaacgttggggctactcccttaacttcatgggatatgtaattg1260gaagttggggtactttaccgcaggaacatattgtacaaaaactcaagcaatgttttcgga1320aattgcctgtaaatagacctattgattggaaagtatgtcaaagaattgtgggtcttttgg1380gctttgctgccccttttacacaatgtggctatcctgccttgatgccttagatctac1436<210>4<211>400<212>prt<213>乙肝表面抗原<400>4metglyglytrpserserlysproargglnglymetglythrasnleu51015servalproasnproleuglyphepheproasphisglnleuasppro202530alapheglyalaasnserasnasnproasptrpasppheasnproasn354045lysasphistrpproglualaasnglnvalglyalaglyalaphegly505560proglyphethrproprohisglyglyleuleuglytrpserprogln657075alaglnglyileleuthrthrvalproalaalaproproproalaser808590thrasnargglnserglyargglnprothrproileserproproleu95100105argaspserhisproglnalametglntrpasnserthrthrphehis110115120glnalaleuleuaspproargvalargglyleutyrpheproalagly125130135140glyserserserglythrvalasnprovalprothrthralaserpro145150155ileserserilepheserargthrglyaspproalaproasnmetglu160165170serthrthrserglypheleuglyproleuleuvalleuglnalagly175180185phepheleuleuthrargileleuthrileproglnserleuaspser190200205trptrpthrserleuasnpheleuglyglyalaprothrcysprogly210215220225glnasnserglnserprothrserasnhisserprothrsercyspro230235240prothrcysproglytyrargtrpmetcysleuargargpheileile250255260pheleupheileleuleuleucysleuilepheleuleuvalleuleu265270275asptyrglnglymetleuprovalcysproleuleuproglythrser280285290thrthrserthrglyprocyslysthrcysthrileproalaglngly295300305310thrsermetpheprosercyscyscysthrlysproseraspglyasn315320325cysthrcysileproileprosersertrpalaphealaargpheleu330335340trpglutrpalaservalargphesertrpleuserleuleuvalpro345350355phevalglntrpphevalglyleuserprothrvaltrpleuserval360365370iletrpmetmettrptyrtrpglyproserleutyrasnileleuser375380385propheleuproleuleuproilephephecysleutrpvaltyrile当前第1页12