本发明属于兽医传染病快速诊断技术领域，具体涉及一种用于检测绵羊肺炎支原体的rpa引物及方法。
背景技术
绵羊肺炎支原体(mycoplasmaovipneumoniae,mo)是引起羊支原体性肺炎(mycoplasmapneumoniaofgoatsandsheep,mpgs)的主要病原。mpgs传染性强，主要通过呼吸道感染，也可垂直传播，病羊和耐过羊是该病的主要传染源。mpgs临床症状表现为高热、咳嗽、喘气、渐进性消瘦、肺和胸膜发生浆液性和纤维素性炎症，发病率为20%～30%，病死率一般为30%～50%，有的高达80%。当前国外非洲、西班牙、意大利、美国、约旦，国内四川、贵州、内蒙古、青海、广西、福建等地均有该病发生的报道，给养羊业造成了严重的经济损失。
常规pcr技术以其能够检测痕量的病因dna而一直被作为诊断多种疫病的金标方法。但是pcr需要特殊的热循环设备，不利于基层推广使用。重组聚合酶扩增（recombinasepolymeraseamplification,rpa）技术是由英国公司twistdxinc开发的一种可以替代传统pcr的新型核酸检测技术。rpa技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸的重组酶、单链节和蛋白和链置换dna聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在38℃左右。重组酶与引物结合形成的蛋白-dna复合物，能在双链dna中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动dna合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的dna链与ssb结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。目前已用于食品、药品、化妆品等领域的质量控制和环境、水质等监测；医学临床诊断，代谢性疾病和遗传疾病的基因诊断。
绵羊肺炎支原体的诊断方法主要有支原体的分离鉴定、常规pcr、血清学方法和sybrgreenirf-pcr，然而mo对培养基营养要求较高，且不易生长，培养周期需要很长时间；常规pcr和荧光定量pcr均需特殊仪器，血清学方法存在敏感性低、特异性差等缺点，无法及时对临床样品进行快速检测。
技术实现要素：
本发明针对现有技术中存在的问题，提供一种用于检测绵羊肺炎支原体的rpa引物及检测方法。本发明的rpa引物特异性强，能够检测绵羊肺炎支原体，为快速检测绵羊肺炎支原体提供一种有效方法，便于兽医基层工作者使用。
为实现发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种用于检测绵羊肺炎支原体的rpa引物，其中，所述rpa引物的核苷酸序列为：引物上游p1:5'-cttaatgatgagcgtagtagataccaaaccac-3'，下游引物p2：5'-gctgaggtcggatttggactaacaatatttg-3'。扩增片段大小为353bp。
上述rpa引物用于制备检测绵羊肺炎支原体的试剂。
一种用于检测绵羊肺炎支原体的rpa方法，包括以下步骤：
1)引物合成：合成所述rpa引物；
2)dna模板提取：提取样品中的dna；
3)rpa扩增反应：以步骤2）提取的dna为模板，采用rpa引物、rehydrationbuffer和280mm醋酸镁，在rpa反应管仲进行rpa扩增反应；
4)分析rpa扩增产物。
根据上述的方法，采用英国twistdxinc公司的twistamp®basic试剂盒进行rpa扩增反应，所述rpa扩增反应体系为50μl：10μm上游引物和10μm下游引物各2.4μl、rehydrationbuffer29.5μl、无核酸酶纯水12.2μl、dna模板1μl和280mm醋酸镁2.5μl。
根据上述的方法，所述rpa扩增反应的加样顺序和反应条件为：首先将rpa反应体系中出了醋酸镁之外的成分加入到twistamp®basic试剂盒提供的冻干酶复合物反应管中，然后将醋酸镁加入到反应管盖子内，盖上盖子瞬时离心，使醋酸镁进入反应体系中，然后将反应管放入38℃恒温水浴锅中孵育30min。
步骤4）中分析rpa扩增产物的方法为：利用pcr纯化试剂盒回收扩增产物，然后经2%琼脂糖电泳对扩增产物进行检测。
本发明的有益效果：
（1）本发明设计的rpa引物特异性强，检测结果准确。
（2）本发明建立绵羊肺炎支原体rpa方法，该方法灵敏度高，最低可检测到700fg/ul，特异性好、重复性好，可用于绵羊肺炎支原体的临床诊断和流行病学调查。
附图说明
图1为绵羊肺炎支原体rpa引物特异性检测结果。图中，m为marker，泳道1为绵羊肺炎支原体目标片段，泳道2为羊口疮病毒、泳道3为山羊支原体山羊肺炎亚种、泳道4为丝状支原体山羊亚种、泳道5为山羊支原体山羊亚种、泳道6为大肠杆菌、泳道7为金黄色葡萄球菌、泳道8为溶血性曼氏杆菌、泳道9为牛支原体和泳道10莱氏无胆甾原体。
图2为绵羊肺炎支原体rpa引物灵敏性检测测结果。图中：m为marker，1-9泳道模板浓度分别为70ng/ul、7ng/ul、700pg/ul、70pg/ul、7pg/ul、700fg/ul、70fg/ul、7fg/ul、700ag/ul，10泳道为阴性对照。
具体实施方式
以下实施例中使用rpa试剂盒为twistamp®basic试剂盒，购自英国twistdxinc公司，整个rpa反应时在rpa管中进行。
实施例1：用于检测绵羊肺炎支原体的rpa方法的建立
1、引物的设计与合成
引物的特异性是本实验所建立方法的重要因素。根据genbank登录的km435069.1的p80基因序列，利用oligo7软件设计引物，通过blast软件比对分析，初步验证其特异性。引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。
所述rpa引物的核苷酸序列为：
引物上游p1:5'-cttaatgatgagcgtagtagataccaaaccac-3'，
下游引物p2：5'-gctgaggtcggatttggactaacaatatttg-3'。
扩增片段大小为353bp。
2、阳性标准品制备
以提取的dna为模板，取1ml绵羊肺炎支原体培养液加入1.5ml离心管中，10000r/min离心3min，弃上清收集菌体，使用生工组织dna提取试剂盒提取dna，利用蛋白质核酸仪测定其浓度，作为阳性标准品备用。
3、特异性试验
分别以绵羊肺炎支原体、山羊支原体山羊肺炎亚种、大肠杆菌、溶血性曼氏杆菌、金黄色葡萄球菌、莱氏无胆甾原体、山羊支原体山羊亚种、牛支原体、丝状支原体山羊亚种、羊口疮病毒核酸样品为模版，采用twistamp®basic试剂盒进行rpa扩增，验证合成rpa引物的特异性。所述rpa扩增反应的加样顺序和反应条件为：首先将rpa反应体系中出了醋酸镁之外的成分加入到twistamp®basic试剂盒提供的冻干酶复合物反应管中，然后将醋酸镁加入到反应管盖子内，盖上盖子瞬时离心，使醋酸镁进入反应体系中，然后将反应管放入38℃恒温水浴锅中孵育30min。
rpa扩增反应体系为50μl：10μm上游引物和10μm下游引物各2.4μl、rehydrationbuffer29.5μl、无核酸酶纯水12.2μl、dna模板1μl和280mm醋酸镁2.5μl。
反应结束后，利用pcr纯化试剂盒回收扩增产物，然后经2%琼脂糖电泳检测。如图1所示，引物具有良好的特异性。
4、灵敏性试验
将提取的绵羊肺炎支原体的dna进行10倍连续倍比稀释，分别以稀释后的不同浓度的dna为模版进行rpa反应，以确定该引物的灵敏度。反应体系和条件同特异性试验。绵羊肺炎支原体的dna浓度测定结果为70ng/ul，如图2所示。本发明中rpa引物最低检测线为700fg/ul，表明灵敏性高。
5、重复性试验
绵羊肺炎支原体2份阳性样品，以丝状支原体山羊亚种、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、山羊支原体山羊亚种、山羊支原体山羊肺炎亚种、羊口疮病毒、牛支原体、莱氏无胆甾原体各1份作阴性对照，反应条件和体系参照特异性试验，间隔3天检测1次，共重复3次。
反应终止后，分别取7μlrpa产物，用2％琼脂糖电泳检测扩增结果，能够扩增得到353bp片段即可认为对应成功检测出丝状支原体山羊亚种，结果显示该方法能够特异性扩增绵羊肺炎支原体，对其它羊常见病原均无扩增，表明可重复性好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
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<110>福建省农业科学院畜牧兽医研究所
<120>一种用于检测绵羊肺炎支原体的rpa引物
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