本发明涉及微生物发酵技术领域，特别是涉及一种微生物活菌载体及其制备方法和应用。
背景技术：
随着水产养殖业的快速发展，近年来频繁暴发的水产动物疫病，制约着水产养殖业的健康发展。此外，抗生素的长期滥用导致水产养殖中的耐药菌株不断出现，严重破坏养殖水体中的微生物生态平衡。自然界存在着各种各样的有益菌，如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌和沼泽红假单胞菌等，具有改善养殖环境和促进水产动物生长发育的作用。若将2种或2种以上的不具拮抗作用的有益菌混合制成复合菌，各菌株通过功能上的协同互补，其作用相比单一菌株更明显。复合菌具有净化养殖水质、抑制有害病原、增强动物免疫力和减轻应激反应等多种功能。
提高复合菌活菌数的方法可以从发菌种筛选、菌种诱变、培养条件优化等方面进行。固定化微生物技术是利用物理或化学手段将游离微生物限定在特定区域内，使其高浓度密集、保持较高生物活性且可持续使用的一种新型生物工程技术。因其分离方便、对生物无危害等优点，已广泛应用于酶催化、生物发酵等领域。但是目前尚无一种水产养殖中可应用的微生物活菌载体。
技术实现要素：
基于此，有必要针对上述问题，提供一种微生物活菌载体，采用该载体能够将复合菌的生物量提高40％～60％。
一种微生物活菌载体，包括由石蜡、微晶石蜡和汽油制备而成的多孔石蜡主体，所述多孔石蜡主体的孔径大小为4～10μm，比表面积为100～200m2/g，孔隙率达80～90％。
本发明人经过调研发现，固定微生物的载体孔径分布中，通常70％的孔径应大于微生物的最小尺寸，但又小于微生物最大尺寸的5倍。在复合菌种中，粪肠球菌呈圆形或椭圆形，直径0.5～1.0微米；嗜酸乳酸杆菌一般呈短杆状或球杆状，细胞大小约0.6～0.9μm×1.5～6.0μm；枯草芽孢杆菌呈杆状，细胞大小约为0.7～0.8μm×2～3μm，其芽孢呈椭圆或圆柱状，细胞大小约为0.6～0.9μm×1.0～1.5μm；地衣芽孢杆菌呈呈杆状，细胞大小约为0.8μm×1.5～3.5μm。
在此基础上，发明人通过反复试验后发现，采用孔径大约在4～10μm的多孔石蜡，其较大的表面积能为复合菌提供良好的生长附着面。并且选用石蜡、微晶石蜡和汽油制备得到的多孔石蜡，含有丰富的微孔结构，具有较大的比表面积，可以在载体表面及内部吸附大量的有益菌，发酵液中的砂糖、蜂蜜也可以聚集在载体表面上，随着砂糖、蜂蜜的积累和有益菌的不断生长和富集，有利于复合菌生长繁殖，形成高密度生物催化剂，进而可以大幅度提高参与反应的微生物浓度，提高催化效率，提高生产能力。此外，多孔石蜡也可回收处理，反复使用，降低了生产成本。
优选的，所述多孔石蜡主体的孔径大小为6～8μm，比表面积为130～170m2/g，孔隙率达82～88％。
在其中一个实施例中，所述石蜡、微晶石蜡和汽油的质量百分比分别为40～50％、40～50％、1～20％。优选的，所述石蜡、微晶石蜡和汽油的质量百分比分别为42～48％、42～48％、7～13％。
在其中一个实施例中，所述石蜡的熔点为55～65℃，所述微晶石蜡的熔点为80～90℃。优选的，所述石蜡的熔点为58～62℃，所述微晶石蜡的熔点为83～87℃。
本发明还公开了上述的微生物活菌载体的制备方法，包括以下步骤：将所述石蜡、微晶石蜡和汽油加热熔融，搅拌均匀，继续加热去除汽油，熔融成分冷却，即得所述多孔石蜡主体。
在其中一个实施例中，将所述石蜡、微晶石蜡和汽油在90～110℃加热熔融，加热去除汽油后，将熔融成分倒入磨具中冷却。
本发明还公开了上述的微生物活菌载体在提高复合菌活菌数中的应用。
在其中一个实施例中，所述复合菌包括粪肠球菌、嗜酸乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述复合菌由粪肠球菌、嗜酸乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌组成，所述复合菌中各菌种的组成比例为：
在其中一个实施例中，所述提高复合菌活菌数的方法包括以下步骤：
接种：将复合菌的种子培养液接种到同一液体培养基中；
发酵：在发酵过程中放置所述微生物活菌载体固定化复合菌，共同进行复合菌发酵。
在其中一个实施例中，所述接种步骤中，所述液体培养基中各成分浓度为：砂糖40.0～60.0g/l，蜂蜜5.0～15.0g/l；分别接种各种子培养液，其中粪肠球菌种子培养液的活菌数≧3.0×108cfu/ml，嗜酸乳酸杆菌种子培养液的活菌数≧1.0×108cfu/ml，枯草芽孢杆菌种子培养液的活菌数≧0.4×108cfu/ml、地衣芽孢杆菌种子培养液的活菌数≧0.4×108cfu/ml；所述各种子培养液的接种总量为液体培养基体积百分含量的2％～5﹪；
所述发酵步骤中，按照每10m3的液体培养基放置2～3块多孔石蜡主体，所述多孔石蜡主体的体积为1～2l，放置位置为液体培养基液体表面下、底部和/或中部；所述复合菌发酵条件为：在溶氧度为4～6﹪的发酵罐中，氧气的体积与发酵液的体积比为4～6％的条件下，28℃～32℃密闭式静置培养7～15天。
在其中一个实施例中，所述粪肠球菌的种子培养液的制备方法为：无菌条件下将粪肠球菌atcc51299接种到液体培养基中，该液体培养基为：蛋白胨27.0～33.0g，酵母粉9.0～11.0g，葡萄糖27.0～33.0g，吐温-800.9～1.1ml,柠檬酸三铵1.8～2.2g，七水硫酸镁0.78～0.22g，一水硫酸锰0.045～0.055g，碳酸钙9.0～11.0g；ph调至6.9～7.3，35～39℃，100～200r/min培养48～72h；
所述嗜酸乳酸杆菌的种子培养液的制备方法为：在无菌条件下将嗜酸乳酸杆菌accc11073接种到液体培养基中，该液体培养基为：乳清粉18.0～22.0g，牛肉膏13～17g，蛋白胨13～17g，七水硫酸镁0.5～0.7g，一水硫酸锰0.22～0.28g，三水合乙酸钠2.2～2.8g，磷酸氢二钾1.8～2.2g；ph调至5.5～6.0，35～39℃下，亨盖特滚管法厌氧培养16～30h；
所述枯草芽孢杆菌的种子培养液的制备方法为：在无菌条件下将枯草芽孢杆菌accc10627接种到液体培养基中，该液体培养基为：蛋白胨0.9～1.1g，葡萄糖3.1～3.9g，酵母膏0.45～0.55g，磷酸二氢钾0.3～0.4g，碳酸钙0.21～0.29g；32～36℃，100～200r/min培养10～22h；
所述地衣芽孢杆菌的种子培养液的制备方法为：在无菌条件下将地衣芽孢杆菌atcc11946接种到液体培养基中，该液体培养基为：葡萄糖13～17g，酵母抽提物9～11g，硫酸镁2.7～3.3g；ph调至6.2～6.8，32～36℃，100～200r/min培养24h。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的一种微生物活菌载体，采用孔径大约在4～10μm的多孔石蜡，其较大的表面积能为复合菌提供良好的生长附着面。并且选用石蜡、微晶石蜡和汽油制备得到的多孔石蜡，含有丰富的微孔结构，具有较大的比表面积，可以在载体表面及内部吸附大量的有益菌，发酵液中的砂糖、蜂蜜也可以聚集在载体表面上，随着砂糖、蜂蜜的积累和有益菌的不断生长和富集，有利于复合菌生长繁殖，形成高密度生物催化剂，进而可以大幅度提高参与反应的微生物浓度，提高催化效率，提高生产能力。并且本发明采用的多孔石蜡可以回收重复利用，降低了生产成本。
本发明的微生物活菌载体在提高复合菌活菌数中的应用，利用上述微生物活菌载体发酵复合菌的方法，包括液体培养基经灭菌处理后，接种复合菌种子液进行发酵，同时在发酵过程中放置微生物活菌载体固定化复合菌，本发明能够将复合菌的生物量提高40％～60％。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关实施例对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
以下实施例所用原料均为市售购得。
实施例1
一种微生物活菌载体，包括由石蜡、微晶石蜡和汽油制备而成的多孔石蜡主体，所述多孔石蜡主体的孔径大小为7μm，比表面积为150m2/g，孔隙率达85％。
上述微生物活菌载体通过以下方法制备得到：
1、原料配方：
石蜡(熔点60℃)45％
微晶石蜡(熔点85℃)45％
汽油10％
2、工艺流程：
将上述石蜡、微晶石蜡和汽油三者置于反应釜中，100℃加热，搅拌均匀，加热去除汽油，熔融成分倒入体积为1.5l的圆形磨具中，冷却，即得。
实施例2
种子培养液的制备。
粪肠球菌的种子培养液的制备方法为：
无菌条件下将粪肠球菌(高耐)atcc51299接种到液体培养基中，该液体培养基为：蛋白胨30.0g，酵母粉10.0g，葡萄糖30.0g，吐温-801.0ml,柠檬酸三铵2.0g，七水硫酸镁0.2g，一水硫酸锰0.05g，碳酸钙10.0g；ph调至7.1，37℃，150r/min培养48～72h，得到粪肠球菌8.0×109cfu/ml。
嗜酸乳酸杆菌的种子培养液的制备方法为：
在无菌条件下将嗜酸乳酸杆菌accc11073接种到液体培养基中，该液体培养基为：乳清粉20.0g，牛肉膏15g，蛋白胨15g，七水硫酸镁0.6g，一水硫酸锰0.25g，三水合乙酸钠2.5g，磷酸氢二钾2.0g；ph调至5.8，37℃下，亨盖特滚管法厌氧培养22h，得到嗜酸乳酸杆菌1.0×1011cfu/ml。
枯草芽孢杆菌的种子培养液的制备方法为：
在无菌条件下将枯草芽孢杆菌accc10627接种到液体培养基中，该液体培养基为：蛋白胨1.0g，葡萄糖3.5g，酵母膏0.5g，磷酸二氢钾0.35g，碳酸钙0.25g；34℃，150r/min培养16h，得到枯草芽孢杆菌3.0×1010cfu/ml。
地衣芽孢杆菌的种子培养液的制备方法为：
在无菌条件下将地衣芽孢杆菌atcc11946接种到液体培养基中，该液体培养基为：葡萄糖15g，酵母抽提物10g，硫酸镁3g；ph调至6.5，35℃，150r/min培养24h，得到地衣芽孢杆菌2.2×1010cfu/ml。
实施例3
一种微生物活菌载体在提高复合菌活菌数中的应用，具体提高复合菌活菌数的方法包括以下步骤：
s1、接种。
粪肠球菌(高耐)的种子培养液50％，嗜酸乳酸杆菌的种子培养液40％，枯草芽孢杆菌的种子培养液4％，地衣芽孢杆菌的种子培养液6％。即种子培养液中各菌种的浓度为：粪肠球菌4.0×109cfu/ml，嗜酸乳酸杆菌4×1010cfu/ml，枯草芽孢杆菌1.2×109cfu/ml，地衣芽孢杆菌1.32×109cfu/ml。
按照上述配比称取实施例2制备得到的各菌种的种子培养液，在无菌条件下分别接种到同一液体培养基中，接种量为液体培养基重量的3﹪，每10m3的液体培养基放置2块实施例1制备得到的微生物活菌载体，液体培养基液体表面下、底部各放置1块。
上述同一液体培养基中各组分在1.0l蒸馏水中的含量为：砂糖50.0g，蜂蜜10.0g，经121℃高压灭菌20分钟。
s2、发酵。
在溶氧度为5﹪的发酵罐中，氧气的体积与发酵液的体积比为5％的条件下，28℃～32℃密闭式静置培养7～15天，使ph值降到3.3～3.8即可。
以上发酵过程同时进行不投入微生物活菌载体的平行试验，发酵后，经检测，该复合菌中各菌种的活菌数分别是：粪肠球菌(高耐)atcc51299的活菌数≧7.6×108cfu/ml，嗜酸乳酸杆菌accc11073的活菌数≧6.4×108cfu/ml，枯草芽孢杆菌accc10627的活菌数≧1.7×106cfu/ml、地衣芽孢杆菌atcc11946的活菌数≧1.8×106cfu/ml,活菌总数为14.0×108cfu/ml，比不放置多孔石蜡主体的发酵方法增加了大约40％。
实施例4
一种微生物活菌载体在提高复合菌活菌数中的应用，具体提高复合菌活菌数的方法包括以下步骤：
s1、接种。
粪肠球菌(高耐)的种子培养液60％，嗜酸乳酸杆菌的种子培养液30％，枯草芽孢杆菌的种子培养液6％，地衣芽孢杆菌的种子培养液4％。
按照上述配比称取实施例2制备得到的各菌种的种子培养液，在无菌条件下分别接种到同一液体培养基中，接种量为液体培养基重量的4﹪，每10m3的液体培养基放置3块实施例1制备得到的微生物活菌载体，液体培养基液体表面下、中部、底部各放置1块；
上述同一液体培养基中各组分在1.0l蒸馏水中的含量为：砂糖50.0g，蜂蜜10.0g，经121℃高压灭菌20分钟。
s2、在溶氧度为5﹪的发酵罐中氧气的体积与发酵液的体积比为5％的条件下，28℃～32℃密闭式静置培养7～15天，使ph值降到3.3～3.8即可。
以上发酵过程同时进行不投入微生物活菌载体的平行试验，发酵后，经检测，该复合菌中各菌种的活菌数分别是：粪肠球菌(高耐)atcc51299的活菌数≧10.2×108cfu/ml，嗜酸乳酸杆菌accc11073的活菌数≧5.1×108cfu/ml，枯草芽孢杆菌accc10627的活菌数≧1.0×107cfu/ml、地衣芽孢杆菌atcc11946的活菌数≧0.6×107cfu/ml。活菌总数为16.0×108cfu/ml，比不放置多孔石蜡主体的发酵方法增加了大约60％。
实施例5
一种微生物活菌载体在提高复合菌活菌数中的应用，与实施例3基本相同，区别仅在于：所采用的石蜡、微晶石蜡和汽油的质量百分比分别为40％、40％、20％。
经检测，本实施例的方法中复合菌中各菌种的活菌数分别是：粪肠球菌(高耐)atcc51299的活菌数≧8.7×108cfu/ml，嗜酸乳酸杆菌accc11073的活菌数≧5.5×108cfu/ml，枯草芽孢杆菌accc10627的活菌数≧3.4×106fu/ml、地衣芽孢杆菌atcc11946的活菌数≧4.6×106cfu/ml,活菌总数为13.2×108cfu/ml，比不放置多孔石蜡主体的发酵方法增加了大约32％。
实施例6
一种微生物活菌载体在提高复合菌活菌数中的应用，与实施例3基本相同，区别仅在于：粪肠球菌(高耐)的种子培养液60％，嗜酸乳酸杆菌的种子培养液30％，枯草芽孢杆菌的种子培养液5％，地衣芽孢杆菌的种子培养液5％。即种子培养液中各菌种的浓度为：粪肠球菌4.8×109cfu/ml，嗜酸乳酸杆菌3.0×1010cfu/ml，枯草芽孢杆菌1.5×109cfu/ml，地衣芽孢杆菌1.1×109cfu/ml。
经检测，本实施例的方法中复合菌中各菌种的活菌数分别是：粪肠球菌(高耐)atcc51299的活菌数≧9.6×108cfu/ml，嗜酸乳酸杆菌accc11073的活菌数≧3.0×108cfu/ml，枯草芽孢杆菌accc10627的活菌数≧2.3×106cfu/ml、地衣芽孢杆菌atcc11946的活菌数≧1.7×106cfu/ml,活菌总数为12.6×108cfu/ml，比不放置多孔石蜡主体的发酵方法增加了大约26％。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。