PFKFB3蛋白的第194位酪氨酸的磷酸化及其应用的制作方法

本发明涉及pfkfb3蛋白酪氨酸第194位的磷酸化，尤其是涉及人和鼠的pfkfb3蛋白的第194位酪氨酸的磷酸化及其应用。

背景技术：

癌症是威胁人类健康的重大疾病，根据who的报告，2000年全球癌症死亡已经突破700万，占全部死亡人数的12％。2015年我国恶性肿瘤发病人数为429.2万，死亡281.4万，癌症成为威胁人民生命财产安全的最严重的疾病之一^[1]。因此，鉴定新型的肿瘤筛选及诊断标记、发现新的肿瘤治疗靶点对提高癌症的防治手段、降低癌症死亡率至关重要。

c-src基因作为在动物中发现的第一个原癌基因，它编码一个分子量为60kda的酪氨酸激酶c-src，是一个重要的非受体酪氨酸激酶。c-src是胞内非受体酪氨酸激酶家族(src激酶家族)的一个成员，该家族包括c-src、fyn、yes,blk,yrk,fgr,hck,lck和lyn共9个成员^[2]。c-src激酶由一个催化结构域，三个src同源结构域(sh2、sh3、sh4)和一个位于c端的负调控结构域构成^[3]。正常情况下c-src羧基末端的第530位酪氨酸会被磷酸化，与其自身的sh2结构域结合形成分子内结构，从而抑制了其本身的激酶活性。细胞因子受体、粘附受体、酪氨酸激酶受体等跨膜蛋白能激活磷酸酶使c-src的第530位酪氨酸去磷酸化，从而解除分子内抑制，激活c-src的激酶活性^[4]，激活的c-src能通过磷酸化一系列底物蛋白激活细胞生长、血管生成、细胞增殖和细胞迁移等信号途径，在肿瘤诱发、恶化和转移中起重要作用^[5]。研究表明，在大约50％的结肠癌、肝癌、肺癌、乳腺癌和胰腺癌组织中都存在c-src通路的过度激活。在小鼠模型中vegf、akt和erk信号通路可激活c-src，导致前列腺癌、卵巢癌和结肠癌的形成与转移^[6,7]。

由于c-src的高表达或激活与多种肿瘤的发生和发展密切相关，而warburg效应是恶性肿瘤的基本特征之一，且以前没有关于c-src调节warburg效应的报道，因此，在前期工作中研究了c-src与糖酵解及warburg效应的关系。

糖酵解是发生在细胞质的无氧代谢过程，一分子葡萄糖经过十步酶促反应生成两分子丙酮酸和2个atp。整个糖酵解通路有两个限速酶，第一个是己糖激酶(hk)，催化糖酵解的第一步反应，将葡萄糖磷酸化生成6-磷酸葡萄糖(glucose-6-p,g-6-p)，6-磷酸葡萄糖可进入后续的糖酵解和磷酸戊糖途径。第二个是磷酸果糖激酶1(pfk1)，催化6-磷酸果糖生成果糖1,6-二磷酸(fructose1,6-bisphosphate,f-1,6-bp)。已知f-2,6-bp是pfk1的最强的变构激活剂，而磷酸果糖激酶-2(pfk2)能催化f-2-p生成f-2,6-bp。哺乳动物中，pfk-2有4种不同的同工酶，即pfkfb1、pfkfb2、pfkfb3和pfkfb4。其中pfkfb3是分布最广泛，且在所有同工酶中其激酶活性最强，对糖酵解的激活作用也最强^[8,9]。另外，pfkfb3在肿瘤中高表达，与肿瘤的发生和发展密切相关^[10,11]。

参考文献：

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技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供pfkfb3蛋白的第194位酪氨酸的磷酸化。

本发明的第二目的在于提供pfkfb3蛋白第194位酪氨酸磷酸化的抗体。

本发明的第三目的在于提供pfkfb3蛋白第194位酪氨酸磷酸化的抗体的制备方法。

本发明的第四目的在于提供pfkfb3蛋白第194位酪氨酸磷酸化在临床肿瘤中的检测。

本发明的第五目的在于提供pfkfb3蛋白第194位酪氨酸磷酸化在临床抗肿瘤药物的应用。

所述pfkfb3蛋白的第194位酪氨酸的磷酸化，c-src蛋白能与pfkfb3蛋白相互作用，磷酸化pfkfb3蛋白的酪氨酸194位点，磷酸化位点的磷素化决定了pfkfb3蛋白的酶活性，即转化果糖-6-磷酸(f-6-p)为果糖-2，6-二磷酸(f-2，6-bp)，所述转化增强了糖酵解的速率，进而促进了肿瘤的发生、发展和转移；相反的，所述磷酸化位点的酪氨酸突变为苯丙胺酸(pfkfb3-y194f)时，c-src失去了对糖代谢的调控能力，因而失去了促进肿瘤发生、发展和转移的能力。

所述pfkfb3蛋白第194位酪氨酸磷酸化的抗体，为单克隆抗体或多克隆抗体；所述多克隆抗体的制备方法包括以下步骤：

1)多肽合成；

2)动物免疫；选用健康家兔2只，经过2mg/只、5次免疫后，收集血清50～70ml/只；

3)免疫血清的鉴定：利用10g/ml抗原包被，elisa的方法鉴定血清的效价及特异性。

所述pfkfb3蛋白第194位酪氨酸磷酸化的抗体在检测第pfkfb3蛋白194位酪氨酸的磷酸化的应用。

当c-src蛋白被激活时，pfkfb3蛋白第194位酪氨酸被磷酸化，pfkfb3蛋白的酶活性极大增强，对糖酵解的正向调控能力上调，从而促进c-src对糖酵解的调控能力和促进肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和转移的能力。

所述pfkfb3蛋白第194位酪氨酸磷酸化在临床肿瘤中的检测，包括在结肠癌、肝癌和乳腺癌等各种肿瘤中作为检测靶点；用于评估c-src、pfkfb3及糖酵解的激活情况；用于肿瘤的分期、分级及预后评估；用于指导临床抗肿瘤药物的选择；用于指导开发能抑制pfkfb3磷酸化的抗肿瘤药物。

所述pfkfb3蛋白第194位酪氨酸磷酸化在临床抗肿瘤药物的应用，包括抗体在检测临床标本中pfkfb3蛋白的磷酸化水平，确定包括结肠癌、肝癌、乳腺癌和肠癌等各种c-src激活的肿瘤标本中pfkfb3的磷酸化与c-src的磷酸化之间的相关性，pfkfb3蛋白的磷酸化与肿瘤的分级、分期及预后的关系等的应用，及评估c-src、pfkfb3及糖酵解的激活情况，用于指导临床抗肿瘤药物的选择和用于指导开发能抑制pfkfb3磷酸化的抗肿瘤药物。

pfkfb3蛋白的第194位酪氨酸残基是一个新的磷酸化位点，此位点的磷酸化决定了pfkfb3作为糖酵解的正向调控酶对糖代谢的调控，当该位点的酪氨酸残基突变为苯丙胺酸时，pfkfb3蛋白失去对糖酵解的调控作用，进而失去促进肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移和转移的能力。本发明根据以上对pfkfb3新的磷酸化位点的研究成果，制备了针对此位点的多克隆特异性磷酸化抗体，此抗体能够特异识别pfkfb3的磷酸化状态。

当pfkfb3蛋白194位酪氨酸发生磷酸化时，pfkfb3蛋白的酶活性增强，糖酵解增强。因而，该位点的磷酸化可用来指示pfkfb3的酶活性及细胞的糖酵解水平。所述的应用包括，pfkfb3蛋白第194位点的磷酸化水平，可指示c-src(geneid：6714)及其家族其他激酶的活性水平。通过各种基于抗原-抗体的方法(如elisa、wb、ip、if、ihc等)检测细胞或组织中pfkfb3-y194位点的磷酸化水平；开发能抑制pfkfb3-y94位点磷酸化的药物，制备针对该位点磷酸化的单克隆抗体或多克隆抗体。所述的应用包括，该磷酸化位点在包括结肠癌，肝癌，乳腺癌和肠癌等各种肿瘤标本中，作为检测靶点，应用于评估c-src、pfkfb3及糖酵解的激活情况；应用于肿瘤的分期、分级及预后评估；应用于指导临床抗肿瘤药物的选择；应用于指导开发能抑制pfkfb3磷酸化的抗肿瘤药物。

本发明检测了c-src与pfkfb3的相互作用，发现c-src与pfkfb3有很强的相互作用，且能高度磷酸化pfkfb3上的酪氨酸位点，进而促进糖酵解的速率和乳酸的生成。在本发明中，发现了pfkfb3的磷酸化激活模式，即c-src及其家族激酶能通过磷酸化pfkfb3酪氨酸194位点而增强其酶活性，增强糖酵解速率，促进肿瘤的发生、发展和转移。

附图说明

图1为免疫共沉淀证明内源性pfkfb3和c-src蛋白具有相互作用。

图2为c-src能够磷酸化pfkfb3，磷酸化的强度与c-src的活性呈正相关。

图3为确定pfkfb3上c-src的磷酸化位点为酪氨酸194位点，且自制的抗pfkfb3-y194的抗体有很好的特异性。

图4为pfkfb3y194位点的磷酸化能激活其激酶活性。

图5为c-src通过磷酸化pfkfb3促进糖酵解。

图6为c-src通过磷酸化pfkfb3促进细胞增殖。

图7为c-src通过磷酸化pfkfb3促进肿瘤发生。

图8为肿瘤组织中c-src的磷酸化水平和pfkfb3-y194的磷酸化ihc染色结果图。

图9为肿瘤组织中c-src的磷酸化水平和pfkfb3-y194的磷酸化统计学图。

图10为c-src通过磷酸化pfkfb3促进肿瘤细胞的迁移能力。

图11为c-src通过磷酸化pfkfb3促进肿瘤细胞的侵袭能力。

图12为c-src通过磷酸化pfkfb3促进肿瘤细胞转移能力的he染色结果图。

图13为c-src通过磷酸化pfkfb3促进肿瘤细胞转移能力的统计学图。

具体实施方式

图1为本发明通过免疫共沉淀实验发现c-src能与pfkfb3相互作用。在结肠癌hct116细胞中免疫沉淀了内源性的pfkfb3，在沉淀中能检测到c-src，说明二者在内源水平有很强的相互作用。

图2给出c-src能够磷酸化pfkfb3，磷酸化的强度与c-src的活性呈正相关。由于c-src是一个酪氨酸激酶，它对下游蛋白的调节作用主要是通过磷酸化作用实现的，因此在293t细胞中共表达了ha-pfkfb3和flag标签的c-src、c-src的激酶失活突变体(c-src-kd)、c-src的持续性激活突变体(c-src-ca)，免疫沉淀ha-pfkfb3，用抗磷酸化酪氨酸的抗体(anti-ptyr)检测pfkfb3，发现c-src能强烈地磷酸化pfkfb3，c-src-ca的磷酸化作用更强，而c-src-kd没有作用，说明c-src的确是pfkfb3的上游激酶。

图3进一步确定pfkfb3上c-src的磷酸化位点为酪氨酸194位点，且自制的抗pfkfb3-y194的抗体有很好的特异性。为了确定pfkfb3上最主要的磷酸化位点，质谱鉴定到并构建了pfkfb3-y194f和pfkfb3-y315f两个突变体，发现c-src不能使pfkfb3-y194f磷酸化，说明pfkfb3-y194是c-src的主要磷酸化位点(图3a)。随后合成了y194磷酸化的pfkfb3的多肽，注射兔子，制备了能特异性识别y194位点磷酸化的pfkfb3的多抗(命名为anti-p-y194)(图3b)。

图4为pfkfb3y194位点的磷酸化能激活其激酶活性。随后研究了y194位点的磷酸化对pfkfb3的酶活性的影响，通过在pfkfb3ko细胞中的补救实验(回补的表达载体前用前缀“r”标记，如rflag-pfkfb3)发现c-src能通过磷酸化y194强烈地激活pfkfb3的酶活性(图4)。

图5为c-src通过磷酸化pfkfb3促进糖酵解。通过在pfkfb3敲除的mhcc97h和hct116细胞中补救表达野生型pfkfb3和不能被c-src磷酸化的pfkfb3-y194f，检测细胞对2-nbdg(一种荧光标记的葡萄糖类似物)的摄入(图5a)及乳酸的产生(图5b)，结果表明c-src能通过磷酸化pfkfb3-y194f促进糖酵解的速率和乳酸的生成。

图6为c-src通过磷酸化pfkfb3促进细胞增殖。在发现了c-src能通过磷酸化pfkfb3-y194而激活糖酵解后，想知道该调节作用在细胞增殖及肿瘤发生中的作用。从绘制的细胞生长曲线可知，敲除pfkfb3能显著削弱hct116细胞的增殖，该作用能被重新表达野生型pfkfb3补救，而不能被pfkfb3-y194f补救，说明c-src能通过磷酸化pfkfb3-y194促进细胞的增殖(图6)。

图7为c-src通过磷酸化pfkfb3促进肿瘤发生。研究了该磷酸化对小鼠移植瘤生长的影响。在pfkfb3kohct116细胞中稳定表达了pfkfb3-y194f，然后进行了裸鼠皮下移植瘤实验，同时与表达野生型pfkfb3的细胞及相应的ko细胞进行对比，发现c-src通过磷酸化pfkfb3-y194能促进肿瘤的发生。

图8和9给出肿瘤组织中c-src的磷酸化水平和pfkfb3-y194的磷酸化有很强的相关性。结肠癌组织芯片ihc染色可以看到肿瘤组织相较于癌旁组织，pfkfb3y194的磷酸化水平有显著的上调，并且和c-src的活性水平也有很好的相关性。

图10为c-src通过磷酸化pfkfb3促进肿瘤细胞的能力。表明，敲除pfkfb3能显著削弱hct116细胞的迁移能力，该作用能被重新表达野生型pfkfb3补救，而不能被pfkfb3-y194f补救，说明c-src能通过磷酸化pfkfb3-y194促进细胞的迁移。

图11为c-src通过磷酸化pfkfb3促进肿瘤细胞的侵袭能力。表明，敲除pfkfb3能显著削弱hct116细胞的侵袭能力，该作用能被重新表达野生型pfkfb3补救，而不能被pfkfb3-y194f补救，说明c-src能通过磷酸化pfkfb3-y194促进细胞的侵袭。

图12和13为c-src通过磷酸化pfkfb3促进肿瘤细胞的转移能力。随后研究了该磷酸化对肿瘤转移能力的影响。在pfkfb3kdb16f10细胞中稳定表达了pfkfb3-y194f，然后进行了裸鼠尾静脉注射实验，同时与表达野生型pfkfb3的细胞及相应的kd细胞进行对比，发现c-src通过磷酸化pfkfb3-y194能促进肿瘤的转移。

本发明给出pffkb3蛋白酪氨酸第194位的磷酸化，提出了该位点的磷酸化对糖酵解的促进作用等，并制备了抗pfkfb3-y194磷酸化的多克隆抗体，该抗体能用于检测结肠癌、肝癌等各种c-src被激活的肿瘤等分级、分期，转移及预后评估，有重要的应用价值，同时可用于评估c-src的激活程度，进一步考虑用c-src的抑制剂来治疗肿瘤。研究结果对临床化疗药物的选择也有一定的指导意义，对c-src和pfkfb3高度激活的肿瘤，考虑用c-src的抑制剂。并且研究结果还可用于指导开发能抑制pfkfb3磷酸化的抗肿瘤药物。

材料与方法如下：

1、常用药品和试剂：

本说明使用的大部分药品与试剂分别购自美国sigma公司、上海生工(sangon)生物工程公司和newenglandbiolab(neb)公司。此外，限制性内切酶、核酸外切酶ⅲ(exoⅲ)和dna标准分子量marker购自大连宝生(takara)生物工程公司或transgene公司；碱性磷酸酶(cip)购自美国promega公司；t4dna连接酶(t4ligase)购自美国invitrogen公司；pvdf膜购自millipore公司；用于免疫共沉淀和westernblot分析的抗体购自美国santacruz,cellsignaling。此外，pfkfb3的抗体是用与gst融合的pfkfb3(aa440-520)蛋白免疫新西兰兔子，纯化血清获得；pfkfb3磷酸化的抗体是合成磷酸化的多肽{ptyr}easyqpldpdkc免疫新西兰兔子，通过cnbrbeads纯化血清获得。phos-tag是购买的wako公司的。

2、免疫共沉淀(co-ip)：

对于过量表达免疫共沉淀实验，以35mm的细胞培养皿为例。转染24～36h后收集细胞。将培养皿置于冰上，接下来的所有操作皆在冰上进行。用真空泵将35mm细胞培养皿中的培养液彻底吸干净，加入400μl细胞裂解液，用细胞刮将细胞从培养皿内刮下，将细胞裂解液收集在1.5mleppendorf管中。随后用手持式超声破碎仪30％的功率超声12次，每次1s。随后将细胞裂解液4℃13,500rpm离心15min。取30μl上清转移到新管，加入2×sds样品缓冲液制备成tcl(totalcelllysis)，置沸水中煮5min，放于-20℃备用于westernblot分析。剩余上清中取出350μl用于免疫共沉淀分析。以每个样品用量5μlproteina/g琼脂糖珠(santacruz)(使用前用适量裂解缓冲液洗3次，每次3,000rpm离心1min)与1μg抗体或者m2beads(直接带有flag的标签抗体)。将beads和350μl细胞裂解液混合，在4℃的垂直混合仪缓慢颠倒混匀3h，使目的蛋白从细胞裂解液中被特异性抗体免疫沉淀下来。随后4℃以3,000rpm速度离心2min，将beads离心至管底，弃上清，分别用500μllysisbuffer洗beads三次，去除一些非特异的结合。最后向beads中加入50μl1.2×sds样品缓冲液，沸水煮5min，为ip(co-ip)的样品，存于-20℃用于westernblot分析。

3、溶液配方：

lysisbuffer：20mmtris-hcl(ph7.5),150mmnacl,1mmedta,1mmegta,1％triton-x100,2.5mmsodiumpyrovate,1mmβ-glycerolphosphate,1mmsodiumorthovanadate,1mmdtt,1μg/mlleupeptin,1mmpmsf。

2×sdssamplebuffer(10ml)：2mlglycerol，4ml10％sds，2ml4×stackinggelbuffer，1mlβ-mercaptoethanol，0.002gbromophenolblue

1.2×sdssamplebuffer：将2×sdssamplebuffer用1×lysisbuffer稀释即可。

5×sdssamplebuffer(50ml)：5ml3mtris-hcl(ph6.8),5gsds,25mlglycerol,12.5mlβ-mercaptoethanol,25mgbromophenolblue，ddw7.3ml

4、mttassay：

mtt比色法检测细胞生长速率的原理是四唑盐(mtt)能够被细胞中脱氢酶还原成不溶于水的蓝色物质，并沉淀在细胞中，用dmso能够将这种蓝色物质溶解，溶液的颜色在570nm处有最大吸收峰，用酶标仪测的吸光度表示细胞量的多少。

将细胞培养在96孔板中，分5d的计数量，细胞密度起始都是1×10³。24h之后，测第一次增殖量，每个孔加入20μlmtt溶液(5mg/ml)，继续培养4h。将培养基吸干净，用150μldmso溶解甲瓒，测吸光度。连续测5d，将测得的吸光度为纵坐标，时间为横坐标绘制细胞生长曲线。

5、测定glucoseuptake：

细胞种植于6孔板中，密度60％左右用lowglucosedmem处理细胞4h后，pbs缓冲液清洗一次，随后用noglucosedmem加0.1mm2-nbdg孵育细胞30min,随后收集细胞，pbs漂洗3次后重悬细胞于1ml的pbs缓冲液中，上流式细胞仪分析活细胞内2-nbdg水平。

6、pfk酶活测定：

pfk催化果糖-6-磷酸和atp生成果糖-1,6-二磷酸和adp，丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化nadh氧化生成nad⁺，在340nm下测定nadh下降速率，即可反映pfk活性。

7、乳酸检测：

乳酸使用北京华宇亿康乳酸检测试剂盒检测。

8、裸鼠肿瘤移植实验：

利用pbobi载体或者plko.1载体构建慢病毒，感染细胞，建立稳定表达的细胞系，将细胞扩增起来。裸鼠的年龄大概为6周。每只小鼠注射1×10⁷个细胞于裸鼠的后侧大腿与背部相邻的皮下位置。注射3周后，肿瘤长至合适大小，断颈法处死小鼠，拍照并解剖取得肿瘤称重。

9、裸鼠尾静脉注射实验：

利用pbobi载体或者plko.1载体构建慢病毒，感染细胞，建立稳定表达的细胞系，将细胞扩增起来。裸鼠的年龄大概为6周。每只小鼠注射2×10⁶个细胞于裸鼠的尾静脉。注射2周后，断颈法处死小鼠，拍照并解剖取得小鼠肺，福尔马林固定后脱水、包埋、切片以及ihc染色。

本发明涉及pfkfb3蛋白的第194位酪氨酸的磷酸化(pfkfb3-p-y194)及针对该磷酸化位点的应用。应用包括：通过各种基于抗原-抗体的方法(如elisa、wb、ip、if、ihc等)检测细胞或组织中pfkfb3-y194位点的磷酸化水平；开发能抑制pfkfb3-y94位点磷酸化的药物，制备针对该位点磷酸化的单克隆抗体或多克隆抗体。当pfkfb3-y194位点被酪氨酸激酶(如c-src家族的蛋白激酶)磷酸化后，pfkfb3的酶活性上调，糖酵解增强，氧化性戊糖磷酸途径减弱，而非氧化性戊糖磷酸途径增强，从而促进了肿瘤的发生、发展和转移。本发明还涉及针对该位点的应用。pfkfb3-y194的磷酸化水平不仅能用于指标pfkfb3及其上游蛋白激酶(如c-src家族)的活性，而且能用于评估肿瘤细胞的增殖、迁移和转移能力，也能用于指导临床抗肿瘤药物的选择，及开发能抑制pfkfb3-y194位磷酸化的药物。

以下给出有关缩写：

1、pfkfb3-y194：pfkfb3蛋白的第194位酪氨酸；

2、pfkfb3-p-y194：pfkfb3蛋白的第194位酪氨酸被磷酸化；

3、anti-p-y194：抗pfkfb3蛋白的第194位酪氨酸磷酸化的抗体。