一种羧肽酶B分泌表达的方法与流程

本发明涉及基因表达的技术领域，尤其是涉及一种在羧肽酶原b基因的n端添加信号肽突变体使目的蛋白在大肠杆菌中可溶性分泌表达的方法。

背景技术：

羧肽酶b(carboxypeptidaseb，简称cpb，ec3.4.17.2)是一类含有锌离子的金属酶，能够特异性地切除蛋白或多肽c末端的碱性氨基酸，尤其是精氨酸和赖氨酸。羧肽酶b含307个氨基酸，分子量为35kda。羧肽酶原b是羧肽酶b的酶原形式，胰蛋白酶可将羧肽酶原b激活，得到有活性的羧肽酶b。羧肽酶b的应用范围十分广泛，主要用于科研、医学诊断和药物生产。特别是，在胰岛素原活化为胰岛素的过程中，羧肽酶b是不可缺少的双酶之一。

目前制备活性cpb的方法主要有两类：一类是从猪或牛的胰腺中直接提取并活化获得，但得到的cpb不仅产量低、成本高，而且还可能混有蛋白酶或感染物质(如病毒)，因此应用有限；另一类是在原核(主要是大肠杆菌表达系统)或真核中通过基因重组的方法制备cpb。真核系统具有发酵周期长、成本高的缺点，不适合工业大规模生产。原核表达系统易于形成包涵体，必须经过变性、复性才能得到活性蛋白，操作繁琐、复性效率低；张映新(2006)等人通过降低温度(15℃)实现了大鼠羧肽酶原b在大肠杆菌胞内的可溶性表达，但胞内蛋白需破碎细胞壁，工艺繁琐。因此，如果能够采用原核表达体系实现外源蛋白的胞外分泌表达，那么在实践应用中将会大大提高工作效率，节约生产成本。

技术实现要素：

针对现有技术存在的上述问题，本发明申请人提供了一种羧肽酶b(cpb)分泌表达的方法。本发明方法能够将羧肽酶原b直接分泌到培养基中，无需破壁，实现了胞外可溶性分泌表达，有效地简化了下游提取步骤、降低产物纯化的成本。

本发明的技术方案如下：

一种羧肽酶b(cpb)分泌表达的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)以信号肽ompa、pelb、endoxylanase和ompt序列为出发序列，分别进行定点突变；

(2)在编码羧肽酶原b(pcpb)的基因序列的n端添加信号肽突变序列，在编码pcpb的基因序列的c端添加编码组氨酸标签(histaq)的密码子，得到核苷酸序列sdb-pcpb-6×his；

(3)将步骤(2)确定的核苷酸序列sdb-pcpb-6×his克隆到载体ptig-trx，获得重组表达载体；

(4)将重组表达载体转化至宿主大肠杆菌e.colibl21(de3)并诱导表达pcpb；

(5)酶切上述pcpb并纯化cpb。

步骤(1)中所述信号肽ompa的第3位密码子c突变成g，信号肽ompa突变体(ompa-db)的序列如seqidno.1所示。

步骤(1)中所述信号肽pelb的第7位密码子t突变成a，第9位密码子c突变成g，信号肽pelb突变体(pelb-db)的序列如seqidno.2所示。

其特征在于，步骤(1)中所述信号肽endoxylanase的第4、5、6位密码子t突变成a，信号肽endoxylanase突变体(endoxylanase-db)的序列如seqidno.3所示。

步骤(1)中所述信号肽ompt的第7位密码子g突变成c，第8位密码子c突变成g，信号肽ompt突变体(ompt-db)的序列如seqidno.4所示。

步骤(2)中所述羧肽酶原b的基因(procarboxypeptidaseb，pcpb)序列如seqidno.5所示。

步骤(3)中所述载体ptig-trx含有硫氧还蛋白的基因，其具有分子伴侣相类似的功能，将其与目的基因进行共表达，能够促进目的蛋白的可溶性表达。

步骤(4)中所述诱导表达的pcpb通过改造后信号肽的引导可直接分泌到培养基中，不需破壁，实现了胞外可溶性分泌表达。

本发明有益的技术效果在于：

1、本发明通过对信号肽的改造，能够实现鼠源羧肽酶原b在大肠杆菌中的胞外分泌表达。

2、本发明将目的蛋白直接分泌到培养基中，相比于胞内和周质表达，不需要破碎细胞，回收与纯化更能容易操作。另外，培养基中空间足够大，利于重组蛋白的过量表达。

3、本发明胞外分泌表达的羧肽酶原b无需经过变性和复性，可直接用胰蛋白酶酶解得到活性cpb。

4、本发明采用的载体ptig-trx含有硫氧还蛋白的基因，其具有分子伴侣相类似的功能，将其与目的基因进行共表达，能够促进目的蛋白的可溶性表达。

附图说明

图1重组表达载体双酶切验证；

图中：m、dnamarker；1、重组表达质粒ptig-trx-ompa-db-pcpb；2、重组表达质粒ptig-trx-pelb-db-pcpb；3、重组表达质粒ptig-trx-endoxylanase-db-pcpb；4、重组表达质粒ptig-trx-ompt-db-pcpb；

图2重组cpb的蛋白纯化sds-page电泳图谱。

图中：m、标准蛋白marker；1、纯化后的cpb。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。

本发明所涉及的酶切、连接、回收、转化、pcr扩增等常规实验操作步骤详见《分子克隆(第三版)》。

除非本文另作限定，本文所用的全部技术术语和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。具体如下：

如本文所用，术语“cpb”指羧肽酶b，“pcpb”指羧肽酶原b。

如本文所用，术语“酶原”是指酶的无活性前体。也就是说，酶原是一种具有酶活性的蛋白(比如一种具有羧肽酶b活性的蛋白)的无活性前体。许多具有酶活性的蛋白是以这种无活性前体的方式合成，并随后通过剪切掉一个或一些特定肽键来活化的。通过特定蛋白水解引发的酶和其他蛋白的活化常常发生在生物系统中。

如本文所使用的大肠杆菌是e.colibl21(de3)，购于neb(北京)有限公司。

如本文所用，术语“信号肽”是一种存在于来源于可分泌蛋白的前体蛋白形式中的可切除的氨基酸信号序列。蛋白转运穿过细胞膜，即“分泌”，一般具有一约15至30个氨基酸长度的富含疏水氨基酸的n-末端序列。有时，在穿过细胞膜的过程中，该信号序列被信号肽酶酶切。

如本文所用，术语“酶解”是指羧肽酶原b被胰蛋白酶酶切，从而产生了有活性的羧肽酶b，即“活化”。

如本文所用，术语“重组”当被用于指代细胞、核酸、蛋白或载体时，表示该细胞、核酸、蛋白或载体已通过导入异源核酸或蛋白或者通过改变天然核酸或蛋白而被修饰，或者所述细胞来自于未修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的该细胞中不曾发现的基因，或者表达天然基因，但这些基因异常表达、表达不足或者完全不表达。

如本文所用，术语“培养”指使一种微生物细胞在适当条件在液体或固体培养基中生长。

如本文所用，有关细胞所用的术语“转化”是指将dna导入有机体使得该dna作为染色体外的元件是可复制的或通过染色体整合的方式是可复制的。

如本文所用，有关细胞所用的术语“载体”是指携带和保持本发明的dna片段的dna，其包括如噬菌体和质粒。例如，携带和保持编码羧肽酶原b基因序列的质粒ptig-trx。

在以下的公开内容和实验部分中，应用下列缩略语：

℃(摄氏度)、rpm(每分钟的转速)、ddh2o(去离子水，milli-q过滤)、kda(千道尔顿)、g(克)、mg(毫克)、μg(微克)、cm(厘米)、μm(微米)、l(升)、ml(毫升)、μl(微升)、m(摩尔浓度)、mm(毫摩尔浓度)、u(酶活单位)、min(分钟)、h(小时)、d(天)、tris(三羟甲基氨基甲烷)、sds(十二烷基硫酸钠)、page(聚丙烯酰胺凝胶电泳)。

实施例1：重组表达载体的构建

(1)信号肽定点突变

分别以质粒pet20b(带有信号肽pelb)和合成的信号肽ompa、endoxylanase、ompt为模板，并分别用引物oa-db-f和oa-db-r、pb-db-f和pb-db-r、end-db-f和end-db-r、ot-db-f和ot-db-r进行pcr；

pcr反应体系(200μl)：2×superpfupcrmastermix100μl，模板各2μl，上下游引物各1μl，灭菌的ddh2o94μl；

pcr扩增条件：95℃预变性5min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min。

pcr产物用dna纯化试剂盒回收后，加入dpnⅰ消化模板，纯化后再用t4dna连接酶在16℃过夜连接，将10μl连接产物转化到克隆宿主jm109中，进行菌落pcr验证并测序。

引物序列如下(5’-3’)：

oa-db-f:gaattctaatgaaaaagagagctatcgcga

oa-db-r:tcgcgatagctctctttttcattagaattc

pb-db-f:gatatacatatgaaaaagctgctgccgacc

pb-db-r:ggtcggcagcagctttttcatatgtatatc

end-db-f:aagaattctaatgaaaaagtttaaaaaga

end-db-r:tctttttaaactttttcattagaattctt

ot-db-f:aagaattctaatgcggcggaaacttctggg

ot-db-r:cccagaagtttccgccgcattagaattctt

(2)信号肽突变体片段的制备

分别以突变正确的信号肽ompa-db、pelb-db、endoxylanase-db、ompt-db为模板，并分别用引物ompa-db-f和ompa-db-r、pelb-db-f和pelb-db-r、endoxylanase-db-f和endoxylanase-db-r、ompt-db-f和ompt-db-r进行pcr扩增。

pcr反应体系(200μl)：2×pfupcrmastermix100μl，模板2μl，上下游引物各1μl，灭菌的ddh2o96μl。

pcr扩增条件：95℃预变性5min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min。

pcr后跑1.5％琼脂糖凝胶电泳，用dna胶回收试剂盒回收信号肽突变体片段。

引物序列如下(5’-3’)：上游f下划线部分为ecori的识别位点，下游r下划线部分是ncoi的识别位点。

ompa-db-f:

ccggaattctaatgaaaaagagagctatcgcgattgcagtggc

ompa-db-r:

aagtgctcctcggaagcatggcccatggcctgcgctacggtagcga

pelb-db-f:ccggaattctaatgaaaaagctgctgccgaccgc

pelb-db-r:

aagtgctcctcggaagcatggcccatggccatcgccggctgggcag

endoxylanase-db-f:

cgcgcgggccggaattctaatgaaaaagtttaaaaagaa

endoxylanase-db-r:

aagtgctcctcggaagcatggcccatggcagaggcggttgcagaaa

ompt-db-f:ccggaattctaatgcggcggaaacttctggg

ompt-db-r:

aagtgctcctcggaagcatggcccatggcaaaagagctgatcgcaa

(3)羧肽酶原b片段的制备

以合成的基因为模板，分别用引物apcpb-f和pcpb-r、bpcpb-f和pcpb-r、epcpb-f和pcpb-r、tpcpb-f和pcpb-r进行pcr扩增。

pcr反应体系(200μl)：2×pfupcrmastermix100μl，模板2μl，上下游引物各1μl，灭菌的ddh2o96μl。

pcr扩增条件：95℃预变性5min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸1min30s，30个循环；72℃延伸10min。

pcr后跑1.5％琼脂糖凝胶电泳，用dna胶回收试剂盒回收目的片段。

引物序列如下(5’-3’)：上游引物f下划线部分为ncoi的识别位点，下游引物r下划线部分是hindiii的识别位点。

apcpb-f:

tcgctaccgtagcgcaggccatgggccatgcttccgaggagcactt

bpcpb-f:

ctgcccagccggcgatggccatgggccatgcttccgaggagcactt

epcpb-f:

tttctgcaaccgcctctgccatgggccatgcttccgaggagcactt

tpcpb-f:

ttgcgatcagctcttttgccatgggccatgcttccgaggagcactt

pcpb-r:

cccaagcttctagtggtggtggtggtggtggccgctatatagatgttctcggacat

(4)融合pcr构建表达载体

以胶回收后的信号肽突变体片段和羧肽酶原b片段为模板，分别用引物ompa-db-f和pcpb-r、pelb-db-f和pcpb-r、endoxylanase-db-f和pcpb-r、ompt-db-f和pcpb-r进行pcr扩增。

pcr反应体系(200μl)：2×pfupcrmastermix100μl，模板各2μl，上下游引物各2μl，灭菌的ddh2o94μl。

pcr扩增条件：95℃预变性5min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸1min30s，30个循环；72℃延伸10min。

pcr后跑1.5％琼脂糖凝胶电泳，用dna胶回收试剂盒回收目的片段后，t/a克隆进pmd19-tsimplevector，分别命名为pmd19t-ompa-db-pcpb、pmd19t-pelb-db-pcpb、pmd19t-endoxylanase-db-pcpb和pmd19t-ompt-db-pcpb。测序验证正确，获得重组质粒pmd19t-ompa-db-pcpb、pmd19t-pelb-db-pcpb、pmd19t-endoxylanase-db-pcpb和pmd19t-ompt-db-pcpb。

用ecori和hindiii对pmd19t-ompa-db-pcpb、pmd19t-pelb-db-pcpb、pmd19t-endoxylanase-db-pcpb和pmd19t-ompt-db-pcpb进行双酶切，切胶回收目的片段，用dna纯化试剂盒回收经ecori-hindiii线性化的载体ptig-trx，酶切反应于37℃下进行2h。根据各片段的回收情况确定连接体系，用t4dna连接酶在16℃过夜连接。

将10μl连接产物转化到克隆宿主jm109中，对单菌落进行菌落pcr验证，再将验证正确的转化子转化到表达宿主e.colibl21(de3)中，提质粒酶切验证正确，结果如图1所示。由此可知，重组表达载体ptig-trx-ompa-db-pcpb、ptig-trx-pelb-db-pcpb、ptig-trx-endoxylanase-db-pcpb和ptig-trx-ompt-db-pcpb构建成功。

实施例2：羧肽酶b在大肠杆菌中的表达与纯化

1、种子培养：挑取甘油管保藏的菌种少量，划线于lb平板(含有100μg/ml氨苄青霉素amp)上，置37℃培养箱中过夜培养。次日，挑取单克隆，转接至15ml的lb培养液中(含有100μg/ml氨苄青霉素amp)，置于37℃、200rpm摇床过夜培养。

2、摇瓶培养：以2％接种量转入二级瓶中，37℃继续培养至od600为0.5-0.6时，加入终浓度为0.1mmiptg，置于25℃培养30h。

3、羧肽酶原b的酶解：将诱导表达后的培养基12000rpm离心10min，上清即为羧肽酶原b粗酶液，用考马斯亮蓝法测蛋白浓度。将上清液用0.45um滤膜过滤，然后按照1:150的质量比加入胰蛋白酶，37℃酶解1h后，立刻加入0.1mmol/l苯甲基磺酰氟(pmsf)终止反应并测酶活。

4、羧肽酶b的纯化与鉴定：histraptmhp纯化操作，上样开始先用15mla液冲洗亲和柱，进样量40ml，进样时流速为1ml·min^-1，进样结束后，先用30mla液洗脱杂蛋白，再以b液线性洗脱重组蛋白10ml，b液的浓度从0-100％，收集蛋白峰。使用sds-page进行分析，结果如图2所示，得到单一目的条带，大小为35kda。

a液：25mmol·l^-1tris-hcl(ph7.4)，0.5mol·l^-1nacl，20mmol·l^-1咪唑；

b液：25mmol·l^-1tris-hcl(ph7.4)，0.5mol·l^-1nacl，500mmol·l^-1咪唑。

上述洗脱液用含有0.1mnaci的25mmtris-hci溶液(ph7.65)进行透析，去除高浓度咪唑。

实施例3：重组cpb的酶活性测定

测活缓冲液：25mmtris-hci，含有0.1mol/lnacl(ph7.65)

底物溶液(1.0mmol/l)：精密称取hippuryl-l-arginine(sigma)16.7mg,加入50ml的测活缓冲液，使其溶解，或者按照称量的实际重量进行等比例溶解。配置好后放置30min，保证充分溶解，为1.0mmol/l底物溶液。现配现用。预热至25℃+0.5℃。

活性测定：吸取底物溶液3.0ml，取光程为1cm的带盖石英比色杯，加入25℃预热过的3.0ml底物溶液，在254nm的波长处立即调零。精密吸取重组cpb酶液10μl加入，立即计时并摇匀，每隔30秒读取吸光度，共5分钟。测定三次，取平均值。使比色池内的温度保持在25℃+0.5℃。

活性计算：以吸光度为纵坐标，时间为横坐标，作图，在吸光度对时间的关系图中，取呈直线部分的吸光度，按下式计算:

酶活性u/ml＝(δa254/分钟)×(3000+v)×稀释倍数/(0.36×v)

比活力(u/mg)＝酶活性(u/ml)/蛋白浓度(mg/ml)

结果：ptig-trx-ompa-db-pcpb发酵液上清中的蛋白浓度为0.345mg/ml，胞外酶活达到20.6u/ml；ptig-trx-pelb-db-pcpb发酵液上清中的蛋白浓度为0.442mg/ml，胞外酶活达到27u/ml；ptig-trx-endoxylanase-db-pcpb发酵液上清中的蛋白浓度为0.156mg/ml，胞外酶活达到9.8u/ml；ptig-trx-ompt-db-pcpb发酵液上清中的蛋白浓度为0.242mg/ml，胞外酶活达到16u/ml。

sequencelisting

<110>江南大学

<120>一种羧肽酶b分泌表达的方法

<130>1

<160>5

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>63

<212>dna

<213>ompa突变体（ompa-db）

<400>1

atgaaaaagagagctatcgcgattgcagtggcactggctggtttcgctaccgtagcgcag60

gcc63

<210>2

<211>66

<212>dna

<213>pelb突变体（pelb-db）

<400>2

atgaaaaagctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcg60

atggcc66

<210>3

<211>84

<212>dna

<213>endoxylanase突变体（endoxylanase-db）

<400>3

atgaaaaagtttaaaaagaaattcttagtgggattaacggcagctttcatgagtatcagc60

atgttttctgcaaccgcctctgcc84

<210>4

<211>60

<212>dna

<213>ompt突变体（ompt-db）

<400>4

atgcggcggaaacttctgggaatagtcctgacaacccctattgcgatcagctcttttgcc60

<210>5

<211>1209

<212>dna

<213>羧肽酶原b（procarboxypeptidaseb）

<400>5

catgcttccgaggagcactttgatggcaaccgggtgtaccgtgtcagtgtacatggtgaa60

gatcacgtcaacttaattcaggagctagccaacaccaaagagattgatttctggaaacca120

gattctgctacacaagtgaagcctctcactacagttgactttcatgttaaagcagaagat180

gttgctgatgtggagaactttctggaggagaatgaagttcactatgaggtactgataagc240

aacgtgagaaatgctctggaatcccagtttgatagccacacccgtgcaagtggacacagc300

tacaccaagtacaacaagtgggaaacgattgaggcgtggattcaacaagttgccactgat360

aatccagaccttgtcactcagagcgtcattggaaccacatttgaaggacgtaacatgtat420

gtcctcaagattggcaaaactagaccgaataagcctgccatcttcatcgattgtggtttc480

catgcaagagagtggatttctcctgcattctgtcagtggtttgtgagagaggctgtccgt540

acctataatcaagagatccacatgaaacagcttctagatgaactggatttctatgttctg600

cctgtggtcaacattgatggctatgtctacacctggactaaggacagaatgtggagaaaa660

acccgctctactatggctggaagttcctgcttgggtgtagaccccaacaggaattttaat720

gctggctggtgtgaagtgggagcttctcggagtccctgctctgaaacttactgtggacca780

gccccagagtctgaaaaagagacaaaggccctggcagatttcatccgcaacaacctctcc840

accatcaaggcctacctgaccatccactcatactcacagatgatgctctacccttactcc900

tatgactacaaactgcctgagaactatgaggaattgaatgccctggtgaaaggtgcggca960

aaggagcttgccactctgcatggcaccaagtacacatatggcccaggagctacaacaatc1020

tatcctgctgctgggggatctgacgactggtcttatgatcagggaatcaaatattcattt1080

acctttgaactccgggatacaggcttctttggctttctccttcctgagtctcagatccgc1140

cagacctgtgaggagacaatgcttgcagtcaagtacattgccaattatgtccgagaacat1200

ctatattag1209