具有除草剂抗性的ACCase突变型基因和蛋白及其应用的制作方法

文档序号：16398953发布日期：2018-12-25 20:00阅读：132来源：国知局

本发明属于植物蛋白和植物抗除草剂领域，涉及具有除草剂抗性的accase突变型基因、蛋白及其应用；具体而言，本发明涉及水稻的乙酰辅酶a羧化酶(accase)突变基因及其编码的突变accase蛋白，该突变蛋白能赋予植物尤其水稻抗乙酰辅酶a羧化酶抑制剂类除草剂的特性。本发明公开了该突变蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列，以及它们在植物抗除草剂领域中的应用。

背景技术

农田杂草是导致农作物减产的最主要的原因之一。与传统依靠栽培措施、人工除草和机械除草等方法相比，化学除草剂的使用是人们公认的农田除草技术中最可靠且最经济的手段。自2,4-d于20世纪40年代开始使用以来，除草剂工业已有60多年的发展历史，迄今已成功开发了一大批选择性除草剂。其中乙酰辅酶a羧化酶(acetyl-coacarboxylase，简称accase)是化学除草剂的一个重要靶标。accase酶存在于大多数的生物体中，主要存在于细菌、酵母、真菌、植物、动物和人类中。目前已经确定在植物体内有两种同工型的accase，主要位于质体和细胞溶胶中，它们的功能区域在结构上有很大的差别。大多数植物质体中的accase有4个亚基：一个是生物素羧基载体蛋白亚基(biotincarboxylcarrier-protein，bccp)，一个是生物素羧化酶亚基(biotincarboxylase，bc)，以及羧基转移酶(carboxyltransferase，ct)的两个亚基ctα和ctβ，二者之间以共价键相连。大多数植物细胞溶胶中的accase与酵母、大鼠和人的accase属于同一类型，它的一条多肽链包含原核型accase所有的4个亚基，排列顺序是bc、bccp、ctβ、ctα，形成了3个功能域(ctβ和ctα算一个功能域)。除草剂对accase的抑制主要是通过抑制羧基转移酶(ct)，造成酰基脂类生物合成受到抑制，影响细胞膜渗透性，造成代谢产物渗漏，致使植物死亡，从而达到防除禾本科杂草的目的。

accase是一种以生物素为辅基的多功能酶。它利用atp供给的能量催化由乙酰辅酶a生成丙二酰-coa的羧基化反应，该反应是脂肪酸全合成的第一个关键步骤，也是限速步骤，这步由accase催化的反应实际上是由3个亚基组成的两步反应。第一步，首先由atp提供能量给重碳酸，产生活化的羧基(羧酸、磷酸复合物)，然后在bc作用下将羧基连接到bccp中生物素的脲环n1上，形成羧化的生物素羧基载体蛋白，该过程中由mg²⁺或者mn²⁺等的参与，碳酸氢盐为羧基供体。第二步，在ct作用下，将生物素脲环n1上的羧基转移至乙酰-coa的甲基，产生丙二酰-coa，该过程不需要其他的辅助能量。合成的丙二酰-coa参与脂肪酸从头合成等生物过程。

对于accase类抑制剂的研究始于20世纪70年代，accase类除草剂包括芳氧苯氧丙酸酯类(aryloxyphenoxypropanoates，app)、芳氧苯基环己二酮类(aryloxyphenylcy-clohexanedione，apchd)以及三酮类环己二酮(cyclictriketones,ctr)。由于其选择性高，能够苗后防除一年或多年生禾本科杂草，且在植物体内传导，具有高效、低毒、施用期长、对后茬作物安全等优点，此类除草剂迅速发展、品种不断增多、使用面积迅速扩大，已成为世界第三类重要除草剂。

但是随着长期和大面积的使用，杂草很快对这两种除草剂产生了抗性，目前，已在26个国家发现了高达35种杂草对这两类抑制剂产生了抗性。

遗憾的是，accase抑制剂类除草剂的作用机理尚未确定，很难提前预测accase蛋白其它氨基酸位点的突变是否会产生除草剂抗性，只能依赖于科研人员长期、艰苦的实践探索，并凭借一些运气才可能发现accase蛋白新的除草剂抗性位点。

技术实现要素：

技术问题：本发明所要解决的技术问题是提供一种可以赋予植物抗除草剂抗性的突变型蛋白。进一步地，本发明所要解决的技术问题是提供一种可以赋予植物抗(耐)乙酰辅酶a羧化酶类除草剂抗性的水稻accase突变型蛋白。

进一步地，本发明所要解决的技术问题是提供一种可以赋予植物抗除草剂抗性的突变型基因。进一步地，本发明所要解决的技术问题是提供一种可以赋予植物抗(耐)乙酰辅酶a羧化酶类除草剂抗性的水稻accase突变型基因。

为此，本发明提供了一种编码水稻accase突变型蛋白的核酸或基因。

在一种实施方式中，本发明提供了一种水稻accase突变型蛋白，所述accase突变型蛋白的氨基酸序列存在以下任意一种或多种突变：其对应于水稻accase的氨基酸序列的第1796位、第1797位、第1835位、第1875位、第2010位、第2050位、第2060位、第2070位、第2106位发生突变。

作为优选，本发明的水稻accase的氨基酸序列第1796位氨基酸由丙氨酸突变为甘氨酸、第1797位氨基酸由丙氨酸突变为脯氨酸、第1835位氨基酸由谷氨酰胺变为脯氨酸、第1875位氨基酸由缬氨酸变为苯丙氨酸、第2010位氨基酸由色氨酸变为甘氨酸、第2010位氨基酸由色氨酸变为半胱氨酸、第2050位氨基酸由谷氨酸变为甘氨酸、第2060位氨基酸由缬氨酸变为亮氨酸、第2070位氨基酸由丙氨酸变为缬氨酸、第2106位氨基酸由赖氨酸变为谷氨酸。

优选地，本发明的水稻accase的氨基酸序列第1796位氨基酸为除了丙氨酸之外的其它氨基酸、第1797位氨基酸为除了丙氨酸之外的其它氨基酸、第1835位氨基酸为除了谷氨酰胺之外的其它氨基酸、第1875位氨基酸为除了缬氨酸之外的氨基酸、第2010位氨基酸为除了色氨酸之外的其它氨基酸、第2010位氨基酸为除了色氨酸之外的其它氨基酸、第2050位氨基酸为除了谷氨酸之外的其它氨基酸、第2060位氨基酸为除了缬氨酸之外的其它氨基酸、第2070位氨基酸为除了丙氨酸之外的其它氨基酸、第2106位氨基酸为除了赖氨酸之外的其它氨基酸。

优选地，本发明的accase突变型蛋白发生突变的氨基酸包括但不仅限于以下几种突变，在以下位点突变成其他氨基酸的情况也在本发明的保护范围之内，例如：第1796位氨基酸由丙氨酸突变为苯丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、赖氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、缬氨酸、谷氨酸、天冬氨酸；第1797位氨基酸由丙氨酸突变为苯丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、赖氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、缬氨酸、谷氨酸、天冬氨酸；第1835位氨基酸由谷氨酰胺变为苯丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、赖氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬氨酸；第1875位氨基酸由缬氨酸突变为丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、赖氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸；第2010位氨基酸由色氨酸变为苯丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸、脯氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸；第2050位氨基酸由谷氨酸变为苯丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、赖氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬氨酸；第2060位氨基酸由缬氨酸变为苯丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、赖氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸；第2070位氨基酸由丙氨酸变为苯丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、赖氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、谷氨酸、天冬氨酸；第2106位氨基酸由赖氨酸变为苯丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬氨酸。

本发明还提供一种水稻accase突变型蛋白，包括：

(a)其氨基酸序列选自由seqidno.2、seqidno.4、seqidno.6、seqidno.8、seqidno.10、seqidno.12、seqidno.14、seqidno.16、seqidno.18和seqidno.20组成的组中；或

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或多个氨基酸，且具有乙酰辅酶a羧化酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

本发明还提供一种核酸或基因，其编码所述的蛋白。

本发明所述的核酸或基因，包括：

(i)编码所述的蛋白的核酸或基因；或

(ii)在严格条件下与(a)限定的核苷酸序列杂交且编码具有乙酰辅酶a羧化酶活性的蛋白质的核苷酸序列；或

(iii)其核苷酸序列选自由seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11、seqidno:13、seqidno:15、seqidno:17和seqidno:19组成的组中。

所述严格条件为：在0.1×ssc、0.1％sds的溶液中，65℃洗膜15分钟的高度严谨的杂交条件。

本发明的accase突变型基因发生突变的核苷酸包括但不仅限于以下几种突变，在以下位点突变成其他核苷酸的情况也在本发明的保护范围之内，例如：a突变为t、c、g；或c突变为t、a、g；或t突变为a、c、g；或g突变为t、c、a等等均在本发明的保护范围之内。

进一步地，本发明的水稻accase突变型基因，所述水稻accase基因存在以下一种或多种突变：在水稻accase基因的第5387位核苷酸、在水稻accase基因的第5389位核苷酸、在水稻accase基因的第5504位核苷酸、在水稻accase基因的第5623位核苷酸、在水稻accase基因的第6028位核苷酸、在水稻accase基因的第6030位核苷酸、在水稻accase基因的第6149位核苷酸、在水稻accase基因的第6178位核苷酸、在水稻accase基因的第6209位核苷酸、在水稻accase基因的第6316位核苷酸发生突变。

作为优选，本发明的水稻accase突变型基因，所述水稻accase基因存在以下一种或多种突变：在水稻accase基因的第5387位核苷酸由c突变为g，在水稻accase基因的第5389位核苷酸由g突变为c，在水稻accase基因的第5504位核苷酸由a突变为c，在水稻accase基因的第5623位核苷酸由g突变为t，在水稻accase基因的第6028位核苷酸由t突变为g，在水稻accase基因的第6030位核苷酸由g突变为t，在水稻accase基因的第6149位核苷酸由a突变为c，在水稻accase基因的第6178位核苷酸由g突变为c，在水稻accase基因的第6209位核苷酸由c突变为t，在水稻accase基因的第6316位核苷酸由a突变为g。

本发明还提供一种表达盒、重组载体或细胞，其含有所述的核酸或基因。

本发明还提供所述的水稻accase突变型蛋白、核酸或基因，表达盒、重组载体或细胞在植物抗除草剂方面的应用。

其中，上述除草剂是喹禾灵、吡氟氯禾灵、烯草酮、吡氟禾草灵中的一种或多种。

本发明还提供获得具有除草剂抗性的植物的方法，包括如下步骤：

1)使植物包含所述核酸或基因；或

2)使植物表达所述水稻accase突变型蛋白。

进一步地，所述方法包括crispr基因编辑、转基因、杂交、回交或无性繁殖步骤。

本发明还提供一种鉴定植物的方法，其中所述植物是包含所述的核酸或基因的植物、表达所述的蛋白的植物或由所述的方法获得的植物，包括以下步骤：

1)测定所述植物是否包含所述的核酸或基因；或，

2)测定所述植物是否表达所述的蛋白。

本发明还提供一种除草剂的防护剂，该防护剂包括所述的水稻accase突变型蛋白。

本发明还提供一种控制杂草的方法，包括：对种植作物的大田施用有效剂量的除草剂，所述作物包含所述的核酸或基因或所述的表达盒、重组载体或细胞，所述除草剂为喹禾灵、吡氟氯禾灵、烯草酮、吡氟禾草灵中的一种或多种。

本发明还提供一种用于保护植物免受由除草剂引起的损伤的方法，包括：对种植作物的大田施用有效剂量的除草剂，所述作物包含所述的核酸或基因或将所述的表达盒、重组载体导入植物，导入后的植物产生除草剂抗性蛋白，所述除草剂为喹禾灵、吡氟氯禾灵、烯草酮、吡氟禾草灵中的一种或多种。

进一步地，本发明的野生型基因来源于水稻的嘉花1号。

进一步地，本发明的嘉花1号的野生型植株不具有喹禾灵除草剂抗性，本发明的含有accase突变位点的转基因嘉花1号植株能赋予水稻植物增加对乙酰辅酶a羧化酶类除草剂的耐受性。

其中，本发明的嘉花1号的突变型基因序列的编号及其对应的核苷酸和氨基酸序列分别是：嘉花1号的accase基因的第5387位核苷酸由c突变为g，1796位氨基酸由丙氨酸变为甘氨酸，其核苷酸序列如seqidno:1所示，其氨基酸序列如seqidno:2所示；

其中，嘉花1号的accase基因的第5389位核苷酸由g变为c，1797位氨基酸由丙氨酸变为脯氨酸，其核苷酸序列如seqidno:3所示，其氨基酸序列如seqidno:4所示；

其中，嘉花1号的accase基因的第5504位核苷酸由a变为c，1835位氨基酸由谷氨酰胺变为脯氨酸，其核苷酸序列如seqidno:5所示，其氨基酸序列如seqidno:6所示；

其中，嘉花1号的accase基因的第5623位核苷酸由g变为t，1875位氨基酸由缬氨酸变为苯丙氨酸，其核苷酸序列如seqidno:7所示，其氨基酸序列如seqidno:8所示；

其中，嘉花1号的accase基因的第6028位核苷酸由t变为g，2010位氨基酸由色氨酸变为甘氨酸，其核苷酸序列如seqidno:9所示，其氨基酸序列如seqidno:10所示；

其中，嘉花1号的accase基因的第6030位核苷酸由g变为t，2010位氨基酸由色氨酸变为半胱氨酸，其核苷酸序列如seqidno:11所示，其氨基酸序列如seqidno:12所示；

其中，嘉花1号的accase基因的第6149位核苷酸由a变为c，2050位氨基酸由谷氨酸变为甘氨酸，其核苷酸序列如seqidno:13所示，其氨基酸序列如seqidno:14所示；

其中，嘉花1号的accase基因的第6178位核苷酸由g变为c，2060位氨基酸由缬氨酸变为亮氨酸，其核苷酸序列如seqidno:15所示，其氨基酸序列如seqidno:16所示；

其中，嘉花1号的accase基因的第6209位核苷酸由c变为t，2070位氨基酸由丙氨酸变为缬氨酸，其核苷酸序列如seqidno:17所示，其氨基酸序列如seqidno:18所示；

其中，嘉花1号的accase基因的第6316位核苷酸由a变为g，2106位氨基酸由赖氨酸(lys)变为谷氨酸，其核苷酸序列如seqidno:19所示，其氨基酸序列如seqidno:20所示；

其中，嘉花1号野生型accase基因核苷酸序列如seqidno:21所示，其氨基酸序列如seqidno:22所示。

本发明还提供了获得具有除草剂抗性的植物的方法。进一步地，本发明提供了用于增强植物、植物组织、植物细胞对于至少一种除草剂的耐受性的方法，所述除草剂干扰accase酶的活性。因此，本发明中除草剂抗性指的是抗(耐)乙酰辅酶a羧化酶类除草剂。

本发明所述的增强植物、植物组织或者植物细胞对除草剂的抗性方法可以通过转化或者杂交、自交和无性繁殖的方法实施，也可通过基因定点突变的方式获得，使改变的植株包括本发明的核苷酸序列seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11、seqidno:13、seqidno:15、seqidno:17、seqidno:19中的任意一种，所述的突变后的植株具有一种或者一种以上的上述突变后的核苷酸序列。

本发明还提供了耐受除草剂的水稻植物，其表达含有抗除草剂突变位点的accase基因，该基因序列不同于野生型水稻植物的accase基因序列，是accase基因含有抗除草剂突变位点的序列。发明人通过定向突变的方法获得了上述携带有突变位点的水稻accase突变序列，并将其转入到野生型水稻品种，发现携带有accase突变位点的转基因水稻可以抗accase类除草剂，而野生型水稻对accase类除草剂表现敏感。本发明还提供了所述核酸或基因及蛋白在植物育种中的应用，用于培育具有除草剂抗性的植物，尤其是农作物，还提供了这些蛋白及其编码基因在转基因或者非转基因如水稻等作物中的应用。

有益效果：相对于现有技术，本发明具备以下优点：

1)本发明首次通过同源比对的方式获得了具备除草剂抗性的水稻accase突变位点，并通过定点突变的方式扩增获得突变后的accase基因序列。

2)将accase突变序列转入到野生型水稻中，转基因水稻获得了accase酶类除草剂抗性。在田间喷施accase抑制剂类除草剂喹禾灵的实验结果表明，含有本发明的水稻accase突变蛋白的转基因水稻在施用2倍推荐使用浓度的乙酰辅酶a羧化酶抑制剂类除草剂后，植株仍然正常生长发育和结实，而野生型水稻幼苗在施用1倍推荐使用浓度的乙酰辅酶a羧化酶抑制剂类除草剂后，植株生长逐渐停止，叶片逐渐失绿、变浅黄色，植株不能拔节，最终整株死亡。

附图说明

图1示出了抗喹禾灵除草剂的含有accase突变位点的转基因水稻；

图2示出了pcr扩增10个含有水稻accase突变位点的accase基因全长结果图；第1泳道为marker；marker分子量从上到下依次为15kb、8kb、5kb、3kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp，第2泳道为野生型嘉花1号的dna，第3泳道为含有抗除草剂突变位点(accase-5387)的dna，第4泳道为含有抗除草剂突变位点(accase-5389)的dna，第5泳道为含有抗除草剂突变位点(accase-5504)的dna，第6泳道为含有抗除草剂突变位点(accase-5623)的dna，第7泳道为含有抗除草剂突变位点(accase-6028)的dna，第8泳道为含有抗除草剂突变位点(accase-6030)的dna，第9泳道为含有抗除草剂突变位点(accase-6149)的dna，第10泳道为含有抗除草剂突变位点(accase-6178)的dna，第11泳道为含有抗除草剂突变位点(accase-6209)的dna，第12泳道为含有抗除草剂突变位点(accase-6316)的dna。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：水稻accase基因突变位点的确定

我们将大穗看麦娘(alopecurusmyosuroides)(黑草)质体的accase序列(genbankaj310767.1)作为参考序列，与水稻基因组进行同源比对，发现与水稻基因组的accase基因(xm_015783727.1)的同源性最高。根据专利(cn102946714b)中提到的黑草accase可以抗除草剂的氨基酸突变位点，分别是1785(丙氨酸突变为甘氨酸)、1786(丙氨酸突变为脯氨酸)、1824(谷氨酰胺变为脯氨酸)、1864(缬氨酸变为苯丙氨酸)、1999(色氨酸变为甘氨酸)、1999(色氨酸变为半胱氨酸)、2039(谷氨酸变为甘氨酸)、2049(缬氨酸变为亮氨酸)、2059(丙氨酸变为缬氨酸)、2095(赖氨酸变为谷氨酸)作为参考，通过同源比对的方法，确定在水稻中accase基因突变的氨基酸位点分别为1796(丙氨酸突变为甘氨酸)、1797(丙氨酸突变为脯氨酸)、1835(谷氨酰胺变为脯氨酸)、1875(缬氨酸变为苯丙氨酸)、2010(色氨酸变为甘氨酸)、2010(色氨酸变为半胱氨酸)、2050(谷氨酸变为甘氨酸)、2060(缬氨酸变为亮氨酸)、2070(丙氨酸变为缬氨酸)、2106(赖氨酸变为谷氨酸)。根据氨基酸密码子对照表，确定对应核苷酸位点分别为5387(c变为g)、5389(g变为c)、5504(a变为c)、5623(g变为t)、6028(t变为g)、6030(g变为t)、6149(a变为c)、6178(g变为c)、6209(c变为t)、6316(a变为g)。

实施例2：水稻嘉花1号野生型accase全长基因的获得

选取嘉花1号野生型植株的叶片，提取基因组dna，根据ncbi中日本晴accase基因(ncbi：xm_015783727)设计引物进行扩增，采用koddnapolymerase聚合酶(购自toyobo公司)扩增accase基因，其反应体系如下：

补加无菌水至总体积50μl

pcr扩增反应程序采用两步法，退火和延伸合为一起，采用68度。

程序如下：预变性：94℃3min；35个循环：变性94℃10sec；延伸68℃10min；保温：72℃10min。

取2μlpcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，发现有预期大小的片段后(图2)，剩余的pcr产物经pcr清洁试剂盒(购自axygen公司)清洁回收后，克隆至pmd19-t载体(购自takara公司)，然后转化大肠杆菌。每个转化随机挑取12个大肠杆菌单克隆进行pcr检测，取pcr结果呈阳性的6个单克隆，送南京一道生物科技有限公司测序，获得突变accase基因序列，该基因片段长度为13127bp，通过去除内含子后获得基因全长6984bp，嘉花1号野生型accase序列全长基因片段的测序结果如seqidno:21所示。

实施例3：水稻accase基因突变位点基因序列的获得

利用点突变试剂盒扩增水稻accase基因的突变位点序列。首先，利用引物acc-cf和acc-cr，以嘉花1号cdna为模板，克隆accase全长cdna，连入tk007载体(南京擎科生物科技有限公司)，转化大肠杆菌top10菌株感受态细胞，挑选阳性转化子测序验证，获得正确单克隆，质粒命名为tk007-accase；第二，利用突变引物acc-mutf和acc-mutr，以tk007-accase为模版，进行pcr扩增，扩增产物限制性内切酶dpni消化后，转入大肠杆菌dmt菌株感受态细胞，挑选阳性转化子测序验证，获得accase目标位点突变的质粒。

利用突变引物acc5387-mutf和acc5387-mutr扩增accase-5387突变位点，其核苷酸序列的第5387位由c突变为g，导致其编码的氨基酸序列的第1796位由丙氨酸变为甘氨酸，其核苷酸序列如seqidno:1所示，其编码的氨基酸序列如seqidno:2所示；

利用突变引物acc5389-mutf和acc5389-mutr扩增accase-5389突变位点，其核苷酸序列的第5389位由g突变为c，导致其编码的氨基酸序列的第1797位由丙氨酸变为脯氨酸，其核苷酸序列如seqidno:3所示，其编码的氨基酸序列如seqidno:4所示；

利用突变引物acc5504-mutf和acc5504-mutr扩增accase-5504突变位点，其核苷酸序列的第5504位由a突变为c，导致其编码的氨基酸序列的第1835位由谷氨酰胺变为脯氨酸，其核苷酸序列如seqidno:5所示，其编码的氨基酸序列如seqidno:6所示；

利用突变引物acc5623-mutf和acc5623-mutr扩增accase-5623突变位点，其核苷酸序列的第5623位由g突变为t，导致其编码的氨基酸序列的第1875位由缬氨酸变为苯丙氨酸，其核苷酸序列如seqidno:7所示，其编码的氨基酸序列如seqidno:8所示；

利用突变引物acc6028-mutf和acc6028-mutr扩增accase-6028突变位点，其核苷酸序列第6028位由t突变为g，导致其编码的氨基酸序列的第2010位由色氨酸变为甘氨酸，其核苷酸序列如seqidno:9所示，其编码的氨基酸序列如seqidno:10所示。

利用突变引物acc6030-mutf和acc6030-mutr扩增accase-6030突变位点，其核苷酸序列的第6030位由g突变为t，导致其编码的氨基酸序列的第2010位由色氨酸变为半胱氨酸，其核苷酸序列如seqidno:11所示，其编码的氨基酸序列如seqidno:12所示。

利用突变引物acc6149-mutf和acc6149-mutr扩增accase-6149突变位点，其核苷酸序列的第6149位由a突变为c，导致其编码的氨基酸序列第2050位由谷氨酸变为甘氨酸，其核苷酸序列如seqidno:13所示，其编码的氨基酸序列如seqidno:14所示。

利用突变引物acc6178-mutf和acc6178-mutr扩增accase-6178突变位点，其核苷酸序列第6178位由g突变为c，导致其编码的氨基酸序列第2060位由缬氨酸变为亮氨酸，其核苷酸序列如seqidno:15所示，其编码的氨基酸序列如seqidno:16所示。

利用突变引物acc6209-mutf和acc6209-mutr扩增accase-6209突变位点，其核苷酸序列第6209位由c突变为t，导致其编码的氨基酸序列第2070位由丙氨酸变为缬氨酸，其核苷酸序列如seqidno:17所示，其编码的氨基酸序列如seqidno:18所示。

利用突变引物acc6316-mutf和acc6316-mutr扩增accase-6316突变位点，其核苷酸序列第6316位由a突变为g，导致其编码的氨基酸序列第2106位由赖氨酸变为谷氨酸，其核苷酸序列如seqidno:19所示，其编码的氨基酸序列如seqidno:20所示。

实施例4accase转基因水稻的获得及其抗除草剂验证

通过infuison反应，将突变的accase片段连入含有花椰菜花叶病毒35s启动子和35s终止子的植物表达载体中，分别转化野生型水稻。获得纯合并稳定表达含有accase突变位点的转基因水稻，并对转基因水稻检测除草剂的耐受性。

将转基因水稻和野生型水稻分别播种，待水稻长至三叶期时，分别喷施乙酰辅酶a羧化酶抑制剂类除草剂喹禾灵(喷施浓度为施用1.5ml喹禾灵/l水(2倍推荐使用浓度))、吡氟氯禾灵(喷施浓度为施用1.5ml吡氟氯禾灵/l水(1倍推荐使用浓度))、烯草酮(喷施浓度为施用1.5ml烯草酮/l水(1倍推荐使用浓度))、吡氟禾草灵(喷施浓度为施用1.5ml吡氟禾草灵/l水(1倍推荐使用浓度))，喷施一个月后调查枯死情况，发现野生型对照在喷施和以上同样浓度的乙酰辅酶a羧化酶抑制剂类除草剂喹禾灵、吡氟氯禾灵、烯草酮、吡氟禾草灵后，几乎停止生长，新长出来的叶片完全枯黄，并逐渐枯死。而含有accase突变位点的转基因水稻则全部对乙酰辅酶a羧化酶抑制剂类除草剂表现出抗的表型，其正常的生长发育几乎没有受到影响，最终正常拔节抽穗。表1中显示本发明转基因水稻对accase抑制性除草剂的抗性比野生型要高，伤害百分比要低60％以上。这表明我们获得的携带有accase突变位点的转基因水稻确实能够稳定遗传的获得抗乙酰辅酶a羧化酶抑制剂类除草剂的抗性。

表1乙酰辅酶a羧化酶类除草剂对野生型和转基因水稻的伤害比率

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些均在本发明的保护范围内。本发明的全部范围由所附专利要求极其任何等同物给出。

序列表

<110>江苏省农业科学院

<120>具有除草剂抗性的accase突变型基因和蛋白及其应用

<160>44

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>6984

<212>dna

<213>水稻(oryzasativa嘉花1号accase-5387突变核苷酸序列)

<400>1

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<210>2

<211>2327

<212>prt

<213>水稻(oryzasativa嘉花1号accase-5387突变氨基酸序列)

<400>2

metthrserthrhisvalalathrleuglyvalglyalaglnalapro

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859095

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100105110

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115120125

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130135140

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145150155160

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165170175

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195200205

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210215220

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690695700

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725730735

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740745750

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2325

<210>3

<211>6984

<212>dna

<213>水稻(oryzasativa嘉花1号accase-5389突变核苷酸序列)

<400>3