水稻高抗性淀粉含量突变基因sbe3-rs的SNP检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于农业分子生物技术领域，具体地涉及一种水稻高抗性淀粉含量突变基因sbe3-rs的SNP检测方法，用于水稻高抗性淀粉突变基因sbe3-rs水稻资源的鉴定和品种选育。
【背景技术】
[0002]随着我国经济的发展和人民生活水平的不断提高，人们的饮食结构已发生巨大变化。我国居民传统上以谷物为主食，但现在谷类的消费量不断下降，肉和蛋等高脂肪和高蛋白类食物的摄入量不断上升，导致人类疾病谱也发生很大转变。由于膳食结构不平衡和营养过剩而造成的“文明病”已在我国出现并呈逐年扩大的趋势。糖尿病、肥胖症、高血压、高血脂、心脑血管病及冠心病等已成为危害我国人民健康的主要疾病。这些疾病中尤其以糖尿病发病率增长最为显著。
[0003]糖尿病已经成为继肿瘤和心血管病变之后第三大严重威胁人类健康的慢性疾病。2013年9月4日《美国医学会杂志》发布的一篇文章显示，根据2010年中国的流行病学调查数据显示，中国糖尿病的患病率在近10年翻了近两倍，中国糖尿病发生率已达11.6%，达到警戒级别，显著高于世界平均水平6.4%。中国糖尿病高危人群也在扩大，约1.5亿，每年有数以万计的患者死于糖尿病及其并发症。中国的糖尿病现状已非常严峻，而且中国已成为全球范围糖尿病增长最快的地区，并且发病年龄更趋于年轻化。未来50年，糖尿病将是中国一个最为严重的公共卫生问题。
[0004]水稻(Oryza sativa L.)作为三大粮食作物之一，稻米淀粉含量最高，为人类最重要的碳水化合物和能量来源之一，改良稻米中的营养成分有利于降低人体对碳水化合物的吸收，从而可能降低“文明病”的发病率。提高稻米中抗性淀粉(Resistant Starch,RS)含量是一种十分有效可行的办法之一。抗性淀粉是指“在健康个体的小肠中不能被吸收的淀粉或淀粉降解产物”(欧洲抗性淀粉协会EURESTA定义)。RS在调节膳食结构中占有十分重要的地位，通过筛选和鉴定高RS含量的水稻遗传资源，改良水稻品种，来改善人们的饮食结构是治疗和预防糖尿病等文明病病发的最经济有效的手段之一。
[0005]中国专利201210266649.9定位了控制水稻RS含量的主效基因sbe3_rs，该突变基因在对应于水稻淀粉分支酶SBE3基因第16个外显子的第105位处具有T — C的碱基突变，并且针对该位点开发了一个CAPS功能标记分子标记，为通过分子标记辅助选择技术(Marker-assisted select1n，MAS)或转基因手段培育高RS含量的高产水稻新品种提供理论和技术指导。
[0006]但是，由于CAPS分子标记涉及到先PCR反应后用限制性内切酶SpeI酶切步骤，所以使用起来存在步骤繁琐，费用昂贵等一系列弊端，因此，建立一种新的基于PCR技术的基因分型方法来快速、准确的鉴定水稻高抗性淀粉突变体基因sbe3-rS基因型已成为目前抗性淀粉育种应用中亟待解决的技术难题。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种水稻高抗性淀粉含量突变基因sbe3-rs的SNP检测方法，采用四引物扩增受阻突变体系PCR即ARMS-PCR的方法来快速、准确地检测水稻抗性淀粉突变基因sbe3-rS的不同基因型，其灵敏度高、特异性强，用于高抗性淀粉水稻资源鉴定以及分子标记辅助选择育种中以培育高抗性淀粉水稻新品种。
[0008]为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案:
[0009]一种水稻高抗性淀粉含量突变基因sbe3-rs的SNP检测方法，为四引物扩增受阻突变体系PCR即ARMS-PCR的分子标记方法，包括:
[0010]1)ARMS引物设计
[0011]根据sbe3-rs基因在第16个外显子的第105位处具有T — C的单核苷酸碱基突变，设计四条基因特异性引物，分别为:正向外引物，反向外引物，正向内引物和反向内引物，其中，正向内引物和反向内引物的3’末端终止在待检测突变位点，在正向内引物和反向内引物的3’端倒数第3位增加设置一个碱基错配；
[0012]2) ARMS-PCR 扩增
[0013]将步骤I)中的四条基因特异性引物加入同一 PCR反应体系，并对水稻植株的DNA进行PCR扩增，并进行琼脂糖凝胶电泳；
[0014]3)根据电泳结果确定基因型
[0015]如果有572bp，218bp两条特征条带即为不含sbe3_rs基因型纯合体即低抗性淀粉含量植株；如果有572bp和397bp两条带即为高抗性淀粉突变体基因sbe3-rs纯合体；如果同时存在572bp，218bp和397bp三条带，则为高抗性淀粉突变体基因sbe3-rs的杂合体。
[0016]进一步，正向内引物为非sbe3_rs等位基因扩增内引物，在其3’末端倒数第3位错配引入A-C的互换，反向内引物为突变体sbe3-rs基因型内引物，在其3’末端倒数第3位错配引入C-A的互换。
[0017]具体地，所述特异性ARMS引物的序列为:
[0018]正向外引物sbe3-rs-0-Fl:5’ -TGTGATGTGCTGGATTTGGT-3’ ；
[0019]反向外引物sbe3-rs-0-Rl:5’ -GCTGTGGTTTTCATACCGTTC-3’ ；
[0020]正向内引物sbe3-rs-1-F2:5’ -TGAAAGTCATGATCAAGCCCT-3，；
[0021]反向内引物sbe3-rs-1-R2:5’ -GCAATAGTTTTGTCACCAAATG-3’。
[0022]又进一步，ARMS-PCR扩增时，PCR反应体系中，DNA模板的用量为50?10ng，正向外引物和反向外引物的终浓度各为0.2?0.6 μΜ，优选0.4?0.6 μΜ ;正向内引物和反向内引物的终浓度分别为正向外弓I物或反向外引物的I?5倍，优选3?5倍。
[0023]进一步，所述PCR反应体系的总体积为10?50 yL ;其中，DNA模板，50?10ng;10 X Buffer，I?5 yL ;Mg2+终浓度为1.5?2.0mM ；dNTP终浓度为0.2?0.25mM ;正向外弓I物和反向外引物的终浓度各为0.2?0.6μΜ;正向内引物和反向内引物的终浓度分别为正向外引物或反向外引物的I?5倍；Taq聚合酶用量为0.5U?5U，余量用ddH20补足。
[0024]优选地，所述的PCR反应体系的总体积为25 μ L，其中，DNA模板，50?10ng;10 XBuffer, 2.5 μ L ;Mg2+终浓度为1.5mM ；dNTP终浓度为0.25mM ;正向外引物和反向外引物的终浓度各为0.2μΜ;正向内引物和反向内引物的终浓度分别为正向外引物或反向外引物的5倍，Taq聚合酶2.5U，余量用ddH20补足。
[0025]进一步，ARMS-PCR扩增时，循环反应的条件为:94°C预变性5min ；94°C 30s ；56?58°C 30s ；72°C 40 ?60s ；35 个循环；然后 72°C延伸 lOmin。
[0026]利用本发明的水稻抗性淀粉含量突变基因sbe3-rs的SNP检测方法扩增水稻品种的基因组的DNA后，被正向外引物sbe3-rs-0-Fl和反向外引物sbe3-rs-0-Rl扩增的572bp的条带在每个DNA样品中均出现，它不仅起到阳性对照的作用(检测DNA能否得到有效扩增)，同时也可以有效降低非特异性PCR产物的扩增及引物二聚体的形成。
[0027]扩增的水稻品种为sbe3-rs纯合基因型时，除了扩增出572bp的对照条带外，还扩增出397bp的条带，该397bp条带是由正向外引物sbe3-rs-0_Fl和反向内引物sbe3-rs-1-R2扩增产生的，它特异性扩增的是SBE3第16个外显子的第105位核苷酸C等位基因位点。
[0028]扩增的水稻品种为非sbe3-rs基因型时，除了可以扩增出572bp对照条带外，还可以扩增出218bp的条带，该218bp条带是由反向外引物sbe3-rs-0-Rl和正向内引物sbe3-rs-1-F2扩增产生的，它特异性扩增的是SBE3第16个外显子的第105为核苷酸T等位基因位点。
[0029]扩增的水稻品种为sbe3_rs基因杂合型时可以扩增出三条条带，包括572bp、397bp 和 218bp。
[0030]有益效果:
[0031]本发明提供的用于鉴定水稻高抗性淀粉突变基因sbe3-rs不同基因型的四引物ARMS-PCR分子标记方法，具有以下优点:
[0032]I)本发明提供的分子标记是基于突变基因突变位点设计的分子标记，是功能性标记，与抗性淀粉性状完全共分离，能直接反映植株的表型，不存在由于交换而造成的错误鉴定。
[0033]2)本发明的分子标记方法能实现对抗性淀粉突变基因sbe3-rs水稻资源的快速鉴定。
[0034]3)本发明提供的分子标记方法能有效用于高抗性淀粉基因引起的高抗性淀粉含量水稻品种的辅助育种。利用基因sbe3-rs突变位点设计的四引物ARMS-PCR分子标记对植株进行DNA检测，可以在苗期鉴定出高抗性淀粉突变体基因sbe3-rs纯合基因型的单株，淘汰其它单株，这样不仅节约育种成本，而且大大提高了高抗性淀粉水稻品种的选择效率。
[0035]4)与现有的鉴定突变基因sbe3_rs的CAPS分子标记相比，本发明提供的分子标记方法采用四引物一步PCR扩增的方法对sbe3-rs不同基因型进行鉴定，不仅能有效区别sbe3-rs的纯合和杂合基因型，而且由于不涉及限制性内切酶的使用，因此不存在操作繁琐，费用昂贵等弊端，更为高效、快捷。
【附图说明】
[0036]图1为本发明的实施例中设计用于检测水稻高抗性淀粉突变基因sbe3-rs不同基因型的四引物ARMS-PCR体系的策略；
[0037]其中，黑色背景碱基表示单核苷酸突变碱基位点，灰色背景表示四条不同引物序列对应位置。
[0038]图2为本发明的实施例中的四引物ARMS-PCR分子标记方法对不同水稻品种sbe3-rs基因型的检测结果；
[0039]其中，M:DNA marker, DL2000 ;1?2:不含sbe3_rs基因型水稻品种密阳23两个重复；3?4:sbe3-rs基因纯合型水稻降糖稻的两个重复；5?6:sbe3_rs杂合型水稻植株，降糖稻I号与密阳23杂交F1代单株的两个重复。
[0040]图3为本发明的实施例中四引物ARMS-PCR分子标记对降糖稻I号/密阳23&群体sbe3_rs基因型的检测结果；
[0041]其中，M:DNA marker DL2000 ；1:密阳 23 ；2:降糖稻 I 号；3 ?17 SF2单株，其中3，4，5，11，14，16，17为突变基因sbe3_rs杂合型单株；7为sbe3_rs纯合型单株；6，8，9，10，12，13，15为不含突变基因sbe3-rs的单株。
【具体实施方式】
[0042]以下结合具体实施例与附图进一步详细描述本发明的技术方案。需要特别指出的是，这些描述仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。各种对本发明作出的显而易见的修正和改变也纳入本发明的范围内。
[0043]实施例水稻高抗性淀粉含量突变基因sbe3-rs的SNP检测
[0044]1.实验材料
[0045]高抗性淀粉水稻品种:降糖稻I 号(yang et al.A putative gene sbe3_rs forresistant starch mutanted from SBE3 for s