tarch branching enzyme in rice (Oryzasativa L.), Plos One, 2012, 0043026)；
[0046]一般品种:密阳23 ；
[0047]sbe3_rs基因型分离群体:降糖稻I号/密阳23杂交的F2R 178个单株中随机挑选的15株。
[0048]2.分子标记的开发
[0049]根据水稻淀粉分支酶SBE3基因第16个外显子的第105位处具有T — C的碱基突变，设计ARMS-PCR引物，参见图1，黑色背景碱基表示单核苷酸突变碱基位点，灰色背景表示四条不同引物序列对应位置，设计引物序列如下:
[0050]正向外引物sbe3-rs-0-Fl:5，-TGTGATGTGCTGGATTTGGT-3，；
[0051]反向外引物sbe3-rs-0-Rl:5，-GCTGTGGTTTTCATACCGTTC-3，；
[0052]正向内引物sbe3-rs-1-F2:5’ -TGAAAGTCATGATCAAGCCCT-3’ ；
[0053]反向内引物sbe3-rs-1-R2:5’ -GCAATAGTTTTGTCACCAAATG-3’。
[0054]3.分子标记的验证
[0055]I)水稻基因组DNA的提取
[0056]水稻小量DNA提取法，主要参考McCouch等(1988)的报道，方法简述如下:
[0057]a)剪取一小片叶片 4 ?5cm，加入 700 μ L 1.5 X CTAB (含 1.5 % CTAB, 75mMTris-HCl，15mM EDTA, 1.05M NaCl)，充分研磨；
[0058]b)将匀浆转入1.5mL的离心管，56°C水浴20min后冷却至室温；
[0059]c)加入700 μ L的氯仿:异戊醇(V: V，24:1)，摇匀；
[0060]d)以最高速度(13200rpm)离心 1min ；
[0061]e)将上清液转入新的离心管，并加入两倍体积的预冷的100%酒精，静止20min后，1?心收集DNA ；
[0062]f)去上清，加入70%酒精600-800 yL，轻摇离心管，12000rpm离心；
[0063]g)去上清，风干DNAjP 50?100 μ L双蒸水溶解，于紫外分光光度计中检测。稀释DNA，制备一套DNA工作溶液，其浓度为50?10ng/ μ L左右，4°C冰箱保存备用。
[0064]2)分子标记的扩增和电泳检测
[0065]将上述四条分子标记引物sbe3-rs-0_Fl、sbe3-rs_0-Rl、sbe3-rs_I_F2 和sbe3-rs-1-R2加入同一 PCR反应体系，并对水稻种质资源或育种群体植株的DNA进行扩增；
[0066]25 μ LPCR反应体系包括:DNA模板，50?10ng/ μ L，IyL(表示IyL浓度为 50 ?10ng/μ L 的 DNA 模板，下同);10XBuffer，2.5 μ L ;MgCl2,25mM(试剂浓度，下同)，1.5 yL ;dNTP，2.5mM, 2.5 yL ;正向外引物 sbe3-rs-0_Fl，10 μ M，0.5 μ L ;反向夕卜弓丨物 sbe3-rs-0-Rl, 10 μ M，0.5 μ L ;正向内引物 sbe3-rs-1_F2，10 μ M，2.5 μ L ;反向内引物sbe3-rs-1-R2,10 μ M，2.5 μ L ；Taq 聚合酶，5U/ μ L，0.5 μ L，余量用 ddH20 补足。
[0067]PCR 循环的反应条件为:94°C预变性 5min ；94°C 30s ；57°C 30s ；72°C 40s ；35 个循环；然后72°C延伸10min?
[0068]将扩增产物加入上样缓冲液(10 X loading buffer)终止反应，取10 μ LPCR产物，在1.2%的琼脂糖上凝胶电泳分离PCR扩增产物，并呈像记录。
[0069]4.结果分析
[0070]对降糖稻I号，密阳23及其杂交F1代单株进行四引物ARMS-PCR扩增，扩增产物经过1.2%琼脂糖凝胶电泳检测显示三种类型的条带。
[0071]参见图2，其中，被外引物sbe3-rs-0-Fl和sbe3-rs_0-Rl扩增的572bp的条带在每个DNA样品中均出现，它不仅起到阳性对照的作用(检测DNA能否得到有效扩增)，同时也可以有效降低非特异性PCR产物的扩增及引物二聚体的形成。
[0072]密阳23除了可以扩增出572bp对照条带外，还可以扩增出218bp的条带，该条带是由正向内引物sbe3-rs-1-F2和反向外引物sbe3-rs_0-Rl扩增产生的，它特异性扩增的是SBE3第16个外显子的第105为核苷酸T等位基因位点(非sbe3-rs基因型，图2:1?
2);降糖稻I号含有sbe3-rs纯合基因型，除了扩增出572bp的对照条带外，还扩增出397bp的条带，该条带是由正向外引物sbe3-rs-0-Fl和反向内引物sbe3-rs_1-R2扩增产生的，它特异性扩增的是SBE3第16个外显子的第105位核苷酸C等位基因位点(sbe3-rs基因型，参见图2:3?4);降糖稻I号与密阳23杂交F1代单株可以扩增出三条条带，包括572bp、397bp 和 218bp (sbe3_rs 基因杂合型，图 2:5 ?6)。
[0073]为了进一步验证四引物ARMS-PCR分子标记对高抗性淀粉突变基因sbe3_rs基因型检测的效果，对15株降糖稻I号与密阳23杂交的匕单株进行DNA扩增检测，挑选的15个单株为已经用之前开发的CAPS标记酶切鉴定过(参考文献yang et al.A putative genesbe3_rs for resistant starch mutanted from SBE3for starch branching enzyme inrice (Oryza sativa L.), Plos 0ne2012，0043026)，具体检测结果参见图3，其检测结果与CAPS酶切标记鉴定结果完全一致。
[0074]因此，本发明的四引物ARMS-PCR分子标记方法可以有效区分水稻高抗性淀粉突变基因sbe3-rs的三种不同基因型，提高对其基因的选择效率，加速高抗性淀粉水稻品种的选育进程。
【主权项】
1.一种水稻高抗性淀粉含量突变基因sbe3-rs的SNP检测方法，其为四引物扩增受阻突变体系PCR即ARMS-PCR的分子标记方法，包括如下步骤: DARMS引物设计 根据sbe3-rs基因在第16个外显子的第105位处具有T — C的单核苷酸碱基突变，设计四条基因特异性引物，分别为:正向外引物、反向外引物、正向内引物和反向内引物；其中，正向内引物和反向内引物的3’末端终止在待检测突变位点，在正向内引物和反向内引物的3’端倒数第3位设置碱基错配；2)ARMS-PCR 扩增 将步骤I)中的四条基因特异性引物加入同一 PCR反应体系，并对水稻植株的DNA进行PCR扩增，进行琼脂糖凝胶电泳； 3)根据电泳结果确定基因型 如果有572bp和218bp两条特征条带，即为不含sbe3-rs基因型纯合体即低抗性淀粉含量植株；如果有572bp和397bp两条带，即为高抗性淀粉突变体基因sbe3-rs纯合体；如果同时存在572bp、218bp和397bp三条带，则为高抗性淀粉突变体基因sbe3-rs的杂合体。
2.根据权利要求1所述的SNP检测方法，其特征在于，所述的正向内引物为非sbe3-rs等位基因扩增内引物，在其3’末端倒数第3位错配引入A-C的互换；反向内引物为突变体sbe3-rs基因型内引物，在其3’末端倒数第3位错配引入C-A的互换。
3.根据权利要求1所述的SNP检测方法，其特征在于，所述的ARMS-PCR扩增步骤中，PCR反应体系中，DNA模板的用量为50?lOOng，正向外引物和反向外引物的终浓度各为0.2?0.6 μΜ，正向内引物和反向内引物的终浓度分别为正向外引物或反向外引物的I?5倍。
4.根据权利要求1所述的SNP检测方法，其特征在于，所述的ARMS-PCR扩增步骤中，PCR反应体系中，DNA模板的用量为50?lOOng，正向外引物和反向外引物的终浓度各为0.4?0.6 μΜ，正向内引物和反向内引物的终浓度分别为正向外引物或反向外引物的3?5倍。
5.根据权利要求1所述的SNP检测方法，其特征在于，所述PCR反应体系的总体积为10 ?50 μ L ;其中，DNA 模板，50 ?10ng ； 10 X Buffer, I ?5 yL ;Mg2+终浓度为 1.5mM ?2.0mM ；dNTP终浓度为0.2?0.25mM ;正向外引物和反向外引物的终浓度各为0.2?0.6 μΜ;正向内引物和反向内引物的终浓度分别为正向外引物或反向外引物的I?5倍；Taq聚合酶用量为0.5U?5U，余量用ddH20补足。
6.根据权利要求1所述的SNP检测方法，其特征在于，所述的PCR反应体系的总体积为25 μ L，其中，DNA 模板，50 ?10ng ； 10 X Buffer, 2.5 yL ;Mg2+终浓度为 L 5mM ;dNTP 终浓度为0.25mM ;正向外引物和反向外引物的终浓度各为0.2 μΜ;正向内引物和反向内引物的终浓度分别为正向外引物或反向外引物的5倍，Taq聚合酶2.5U，余量用ddH20补足。
7.根据权利要求1?6任一项所述的SNP检测方法，其特征在于，所述的四条基因特异性ARMS引物的序列为:正向外引物 sbe3-rs-0-Fl:5’ -TGTGATGTGCTGGATTTGGT-3’ ；反向外引物 sbe3-rs-0-Rl:5’ -GCTGTGGTTTTCATACCGTTC-3’ ；正向内引物 sbe3-rs-1-F2:5’ -TGAAAGTCATGATCAAGCCCT-3’ ； 反向内引物 sbe3-rs-1-R2:5’ -GCAATAGTTTTGTCACCAAATG-3’。
8.根据权利要求1?6任一项所述的SNP检测方法，其特征在于，进行所述的ARMS-PCR扩增时，循环反应的条件为:94°C预变性5min ;94°C，30s ；56?58°C, 30s ;72°C，40?60s ；35个循环；然后72°C延伸lOmin。
9.根据权利要求7所述的SNP检测方法，其特征在于，进行所述的ARMS-PCR扩增时，循环反应的条件为:94°C预变性5min ;94°C，30s ；56?58°C，30s ;72°C，40?60s ；35个循环；然后72°C延伸1mino
【专利摘要】本发明公开了一种水稻高抗性淀粉含量突变基因sbe3-rs的SNP检测方法，根据sbe3-rs基因存在单核苷酸变异，采用四引物扩增受阻突变体系PCR即ARMS-PCR的方法，设计四条基因特异性引物，加入同一PCR反应体系对不同水稻DNA进行扩增，根据其PCR的特征条带，能够快速、准确地鉴定水稻种植资源或其育种群体中是否含有突变基因sbe3-rs，本发明的检测方法具有灵敏度高、特异性强的特点，可以提高对高抗性淀粉突变基因sbe3-rs的选择效率，加速高抗性淀粉水稻品种的选育过程。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104561315
【申请号】CN201510011470
【发明人】朴钟泽, 杨瑞芳, 白建江, 方军
【申请人】上海市农业科学院
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月9日