一种具有抗炎症性肠病活性的羧甲基茯苓多糖及其制备与应用的制作方法

本发明属于功能食品与生物制药领域，具体涉及一种具有抗炎症性肠病(ibd)活性的羧甲基茯苓多糖cmp33及其制备与应用。

背景技术：

茯苓为多孔菌科真菌茯苓poriacocos(schw.)wolf的干燥菌核，收载于《中国药典》，位列中药“四君八珍”之中，别称玉灵、茯灵、松苓、茯菟等，具有很高的食补和药用价值，具有祛湿利尿、健脾和胃、安神宁心等功效，是一种药食两用的传统中药材。茯苓多糖为茯苓的主要有效成分，占茯苓菌核的80％以上。茯苓多糖经羧甲基化改性后可得到水溶性羧甲基茯苓多糖，具有抗肿瘤、抗炎、免疫增强等作用。目前，对于茯苓多糖羧甲基化改性、纯化以及评价其生物活性，并分析其构效关系等系统的研究工作仍处于起步阶段，尤其是对纯化羧甲基茯苓多糖的抗炎作用的研究鲜有报道。

技术实现要素：

本发明以羧甲基茯苓粗多糖为原料，利用离子交换层析柱和葡聚糖凝胶层析柱分离纯化出羧甲基茯苓多糖，并对纯化组分羧甲基茯苓多糖cmp33进行了结构鉴定，评价了体外抗氧化活性、体外抗肿瘤活性以及体外抗炎活性。建立了tnbs致小鼠急性结肠炎模型，使用纯化组分cmp33对受试小鼠进行灌胃治疗，评价了其体内抗炎活性。本发明的目的是提供一种具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、免疫调节及抗炎症性肠病(ibd)的活性羧甲基茯苓多糖及其制备方法，可应用于功能食品与生物制药领域。

本发明的目的通过如下技术方案实现。

一种羧甲基茯苓多糖cmp33的制备方法，所述多糖是利用deae-52纤维素层析柱、sephadex-g200+sephadex-g150层析柱联用，对现有的羧甲基茯苓粗多糖进行分离纯化，以0.1mol/lnacl溶液为洗脱液洗脱得到的羧甲基茯苓多糖cmp33。

进一步地，所述现有羧甲基茯苓粗多糖由中国专利文献cn105348407a公开的羧甲基茯苓多糖的制备工艺制得。

进一步地，所述多糖cmp33的单糖组成为d-葡萄糖，所述多糖分子量为15.23×10⁴da，结构为(1→3)-β-d-葡聚糖，含有(1→6)和(1→2)糖苷键，具有三螺旋结构。

本发明还提供了所述制备方法制得一种羧甲基茯苓多糖cmp33。

进一步地，所述cmp33对自由基dpph、·abts+、·oh的ec50值分别为3.62mg/ml、3.55mg/ml、2.31mg/ml。

所述多糖cmp33在31.25-1000μg/ml浓度范围内对结肠癌细胞ht-29、肝癌细胞hepg-2、乳腺癌细胞mcf-7、胃癌细胞sgc-7901以及肺癌细胞a549细胞增殖有抑制作用，对应的ic50值分别为113.3μg/ml、282.7μg/ml、385.8μg/ml、79.56μg/ml、204.1μg/ml。

所述多糖cmp33能显著抑制脂多糖lps诱导的小鼠单核巨噬细胞raw264.7释放一氧化氮(no)、白介素-6(il-6)、肿瘤坏死因子-α(tnf-α)及白介素-1β(il-1β)，在31.25-1000μg/ml浓度范围内，对lps诱导的no、il-6、tnf-α及il-1β生成的抑制率分别达到52.31％、47.96％、79.68％及51.80％，具有抗炎活性。

所述多糖cmp33无lps诱导时可激活raw264.7细胞分泌no、il-6、tnf-α及il-1β，具有免疫调节作用。

所述多糖cmp33灌胃给药处理改善三硝基苯磺酸(tnbs)诱导的炎症性肠病(ibd)小鼠的宏观表现，降低小鼠结肠病理切片组织学评分，降低小鼠结肠组织髓过氧化物酶(mpo)活性和丙二醛(mda)的含量。

所述多糖cmp33在制备功能食品与生物制药中的应用，具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、免疫调节及抗炎症性肠病(ibd)的活性。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明除使用deae-52纤维素层析柱之外，更重要的是使用了sephadex-g200+sephadex-g150两种层析柱联用，对羧甲基茯苓粗多糖进行分离纯化，以0.1mol/lnacl溶液为洗脱液得到羧甲基茯苓多糖cmp33。实验表明，羧甲基茯苓多糖cmp33是一种具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、免疫调节及抗炎症性肠病(ibd)的活性多糖。

附图说明

图1为deae-52纤维素层析柱洗脱曲线(横坐标为管数，纵坐标为吸光度值)。

图2为sephadex-g200和sephadex-g150葡聚糖凝胶层析柱洗脱曲线(横坐标为管数，纵坐标为吸光度值)。

图3为cmp33的hpgpc色谱图(横坐标为时间min，纵坐标为电压mv)。

图4为cmp33红外光谱图(横坐标为波数，纵坐标为透过率)。

图5a为混合标准品的gc图(横坐标为时间min，纵坐标为丰度)。

图5b为cmp33的gc图。

图6a为混合标准品的smith降解产物gc图。

图6b为cmp33的smith降解产物gc图。

图7a为cmp33的1h的nmr谱图(横坐标是化学位移)。

图7b为13c的nmr谱图。

图7c为hsqc的nmr谱图。

图7d为h-hcosy的nmr谱图。

图7e为hmbc的nmr谱图。

图8为不同碱浓度下cmp33与刚果红混合液的最大吸收波长变化折线图(横坐标为naoh的浓度,纵坐标为最大吸收波长。

图9a为不同浓度cmp33对raw264.7细胞增殖的影响情况柱状图(横坐标为浓度，纵坐标为raw264.7细胞的相对活度)。

图9b为不同浓度lps对raw264.7细胞增殖的影响情况柱状图。

图10a为不同浓度lps对raw264.7细胞释放no的影响柱状图(横坐标为浓度，纵坐标为no的浓度)。

图10b为不同浓度cmp33对raw264.7细胞释放no的影响柱状图。

图11为各组小鼠dai评分柱状图(与normal组比较#p＜0.05，##p＜0.01；与model组比较*p＜0.05，**p＜0.01)。

图12为各组小鼠结肠外观图。

图13a为各组小鼠结肠长度柱状图。

图13b为各组小鼠结肠结肠厚度柱状图(与normal组比较#p＜0.05，##p＜0.01；与model组比较*p＜0.05，**p＜0.01)。

图14为各组小鼠宏观病理评分柱状图(与normal组比较#p＜0.05，##p＜0.01；与model组比较*p＜0.05，**p＜0.01)。

图15a为对照组200倍显微镜下小鼠结肠he染色图。

图15b为模型组200倍显微镜下小鼠结肠he染色图。

图15c为低剂量cmp33用药组200倍显微镜下小鼠结肠he染色图。

图15d为高剂量cmp33用药组200倍显微镜下小鼠结肠he染色图。

图15e为阳性对照组sasp用药组200倍显微镜下小鼠结肠he染色图。

图15f为各组组织学评分图(与normal组比较#p＜0.05，##p＜0.01；与model组比较*p＜0.05，**p＜0.01)。

图16为各组小鼠结肠组织中mpo活性柱状图(与normal组比较#p＜0.05，##p＜0.01；与model组比较*p＜0.05，**p＜0.01)。

图17为各组小鼠结肠组织中mda含量柱状图(与normal组比较#p＜0.05，##p＜0.01；与model组比较*p＜0.05，**p＜0.01)。

图18a为各组小鼠结肠组织内细胞因子ifn-γ含量柱状图。

图18b为各组小鼠结肠组织内细胞因子il-1β含量柱状图。

图18c为各组小鼠结肠组织内细胞因子il-6含量柱状图。

图18d为各组小鼠结肠组织内细胞因子il-12含量柱状图。

图18e为各组小鼠结肠组织内细胞因子il-17含量柱状图。

图18f为各组小鼠结肠组织内细胞因子tnf-α含量柱状图(与normal组比较#p＜0.05，##p＜0.01；与model组比较*p＜0.05，**p＜0.01)。

图19a为各组小鼠血液中细胞因子ifn-γ含量柱状图。

图19b为各组小鼠血液中细胞因子il-1β含量柱状图。

图19c为各组小鼠血液中细胞因子il-6含量柱状图。

图19d为各组小鼠血液中细胞因子il-12含量柱状图。

图19e为各组小鼠血液中细胞因子il-17含量柱状图。

图19f为各组小鼠血液中细胞因子tnf-α含量柱状图(与normal组比较#p＜0.05，##p＜0.01；与model组比较*p＜0.05，**p＜0.01)。

图20a为各组小鼠结肠组织内细胞因子il-2含量柱状图。

图20b为各组小鼠结肠组织内细胞因子il-4含量柱状图。

图20c为各组小鼠结肠组织内细胞因子il-10含量柱状图(与normal组比较#p＜0.05，##p＜0.01；与model组比较*p＜0.05，**p＜0.01)。

图21a为各组小鼠血液中细胞因子il-2含量柱状图。

图21b为各组小鼠血液中细胞因子il-4含量柱状图。

图21c为各组小鼠血液中细胞因子il-10含量柱状图(与normal组比较#p＜0.05，##p＜0.01；与model组比较*p＜0.05，**p＜0.01)。

具体实施方式

以下结合具体实例对本发明作进一步说明，但本发明的实施和保护范围不限于此，需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程或参数，均是本领域技术人员可参照现有技术理解或实现的。

羧甲基茯苓多糖的纯化

羧甲基茯苓粗多糖100-300mg溶于1-10ml超纯水中上deae-52纤维素离子交换层析柱纯化，用0.1mol/lnacl溶液洗脱，用流速为0.45ml/min，12min/管收集，苯酚-硫酸法进行跟踪检测，收集洗脱峰，真空浓缩，透析后冷冻干燥，制得羧甲基茯苓多糖cmp3。再将cmp350-150mg溶于1-5ml超纯水中上saphadex-g200和saphadex-g150层析柱进一步纯化，0.1mol/lnacl溶液洗脱，用流速为0.3ml/min，10min/管收集，真空浓缩，透析后冷冻干燥，制得羧甲基茯苓多糖cmp33样品。

羧甲基茯苓多糖cmp33结构鉴定

纯度测定上述cmp33样品10mg溶于100ml蒸馏水制成待测液，取1.0ml待测液于25ml比色管中，补加蒸馏水至2.00ml，再加入5％苯酚溶液1ml，混合摇匀后迅速加入5.00ml浓硫酸，沸水浴30min，静置冷却，以不加葡萄糖标准溶液的管为空白，于490nm波长处测吸光度值。待测液做五个平行组，按照葡萄糖标准曲线计算样品中多糖含量。

分子量测定gpc色谱条件：凝胶渗透色谱仪(waterbreezegpc)，色谱柱使用tosoh公司生产的tsk-gelg-5000pwxlcolumn(7.8mm×300mm)与tsk-gelg-3000pwxlcolumn(7.8mm×300mm)串联在一起形成；柱温35℃；流动相0.02mol/lkh2po4溶液，ph6.0；流速0.6ml/min。使用检测器2414型示差折光检测器检测。

gpc校正曲线方程：将葡聚糖标准品系列分别用流动相配成1.0mg/ml浓度的标准溶液，进样量20μl，采集gpc色谱图。

紫外光谱分析称取cmp33样品1mg，用蒸馏水溶解，配制成浓度为1mg/ml的多糖溶液，以蒸馏水为对照，200～400nm波长范围内进行扫描分析。

红外光谱分析称取cmp33样品2mg，加入适量已干燥溴化钾(kbr)粉末，研磨均匀压片，使用ft-ir仪器400～4000cm-1区间内进行扫描分析。

单糖组成分析gc色谱条件：色谱仪(aglient6890n气相色谱仪)；色谱柱db-1701毛细管柱(30.0m×320μm×0.25μm)，进样前用吡啶洗针3次，丙酮洗针3次；进样口温度250℃，分流比20：1；载气为氮气，流速40ml/min；氢气流速为25ml/min，空气流速为450ml/min。采用程序升温：初始温度180℃，保持恒温2min，然后以2℃/min速度升温至220℃,保持恒温1min，再7℃/min升温至250℃，保持恒温1min；检测器为fid检测器，温度为250℃；进样量1.0μl。

样品水解：称取上述cmp33样品10mg于安瓿瓶中，加入2mol/l的三氟乙酸(tfa)溶液4ml，酒精喷灯封口后置于110℃下水解8h。待水解液冷却至室温后加入适量甲醇，45℃以下减压浓缩蒸干，重复3至5次以完全去除tfa，得到水解物。

单糖衍生化：向上述水解物中加入0.5ml吡啶和10mg盐酸羟胺，90℃水浴中加热并振荡反应30min，取出冷却至室温，再加入0.5ml醋酸酐，90℃水浴中继续反应30min进行乙酰化；单糖标准品采用相同操作进行衍生化作为对照。将上述单糖气相衍生物经0.45μm微孔滤膜过滤后按照气相色谱条件，上机分析。

高碘酸氧化和smith降解分析高碘酸氧化：称取上述cmp33样品20mg，溶解于15mmol/l的naio4溶液。混匀后溶液置于暗处室温反应，间隔6h取样，用紫外分光光度计在223nm处测定吸光度值，至其恒定时向溶液中加入1.5ml乙二醇以终止反应。根据高碘酸钠标准曲线计算出高碘酸消耗量。并将含有乙二醇溶液放置20min，取2ml溶液于锥形瓶中，加酚酞指示剂，naoh标准溶液进行滴定，计算出甲酸生成量。剩余部分用于smith降解反应。

smith降解：将乙二醇处理后的溶液用透析袋透析，流水、纯化水各24h。浓缩后加入硼氢化钠还原，过夜。50％的醋酸调ph值至6～7，然后中和剩余硼氢化钠，流水及纯化水各透析24h。浓缩至干，加入2mol/ltfa，110℃封管水解8h，乙酰化后进行gc上机分析，色谱条件同前述gc色谱条件。葡萄糖、丙三醇和赤藓醇采用相同操作进行衍生化作为对照。

核磁共振分析上述cmp33样品15mg溶于0.5ml重水中，溶解后转移至核磁管中，于600mhz核磁共振仪上进行氢谱(1h-nmr)、碳谱(13c-nmr)、碳氢关系谱(hsqc、hmbc)及氢氢关系谱(h-hcosy)分析，采用mestrenova-11.0.2软件对图谱进行分析。

三螺旋结构分析称取上述cmp33样品2mg，加入蒸馏水和100μmol/l刚果红试剂各2ml，再逐渐加入4mol/lnaoh溶液，使溶液中naoh浓度逐渐增加至0.5mol/l，然后在400～600nm波长范围内进行扫描，测定不同naoh浓度下最大吸收波长。以不加多糖样品的刚果红溶液为对照。naoh浓度为横坐标，最大吸收波长为纵坐标绘制曲线。

体外抗氧化活性实验

样品溶液配制将羧甲基茯苓多糖cmp33样品和抗坏血酸vc分别用蒸馏水配成质量浓度为10mg/ml和0.5mg/ml的母液，并稀释成不同浓度梯度溶液待用。

还原力测定取不同浓度待测样品溶液1ml，加入ph6.6的0.2mol/l磷酸盐缓冲液2.5ml、1％铁氰化钾溶液2.5ml，混合均匀，50℃水浴反应20min后，取出迅速冷却，再加入10％三氯乙酸溶液2.5ml，混合均匀，3000r/min离心分离10min，取上清液2.5ml于试管中，加蒸馏水2.5ml、0.1％三氯化铁溶液0.5ml，室温反应5min，以蒸馏水调零，于700nm测定其吸光值a，平行实验三次。以vc为阳性对照。

dpph自由基(dpph·)清除活性测定取不同浓度待测样品溶液1ml，加入60μmol/l的dpph溶液(以50％乙醇溶液配制)3ml，混合均匀，室温下避光静置反应30min，于517nm波长处测定吸光度值a1，平行实验三次。以vc为阳性对照。

dpph自由基清除率(％)＝[1－(a1－a2)/a0]×100％

式中，a0—蒸馏水代替样品溶液的吸光度值；a1—样品溶液的吸光度值；a2—乙醇溶液代替dpph溶液的吸光度值。

abts自由基(abts⁺)清除活性测定abts工作液：7mmol/labts溶液和2.45mmol/lk2s2o8溶液(终浓度)在室温下避光反应12～16h备用。使用前用pbs(0.01mol/l,ph7.4)稀释至734nm波长下吸光度值为0.70±0.02。abts自

由基清除测定：0.2ml不同浓度的待测样品溶液与3.8mlabts工作液混合，避光反应6min，于734nm波长处测定吸光度值a1，平行实验三次。以vc为阳性对照。按式(3-2)计算abts自由基清除率：

abts自由基清除率(％)＝[1－(a1－a2)/a0]×100％

式中，a0—未加样品溶液的吸光度值；a1—加入样品溶液的吸光度值；a2—以超纯水代替abts工作液的吸光度值。

羟基自由基(·oh)清除活性测定反应体系中依次加入9mmol/lfeso4溶液2ml和9mmol/l水杨酸溶液2ml，再加入不同浓度待测样品溶液2ml，最后加入8.8mmol/l双氧水2ml启动整个反应，37℃水浴恒温反应30min。以蒸馏水为参比，在510nm波长处测定各反应液吸光度值a1，平行实验三次。以vc为阳性对照。

羟基自由基清除率(％)＝[1－(a1－a2)/a0]×100％

式中，a0—蒸馏水代替样品溶液的吸光度值；a1—样品溶液的吸光度值；a2—蒸馏水代替水杨酸的本底吸光度值。

超氧阴离子自由基(·o2^-)清除活性测定取不同浓度待测样品溶液1ml，ph8.2tris-hcl缓冲液4.5ml以及蒸馏水3.2ml，于37℃水浴10min，其后加入已预热的25mmol/l邻苯三酚溶液0.4ml，振荡混匀，立即置于比色皿中320nm波长处测定其吸光度值a1，每30s测定1次，共4min，最后以0.5ml浓hcl溶液终止反应，平行实验三次。以vc为阳性对照。

超氧阴离子自由基清除率(％)＝(1－δa1/δa0)×100％

式中，δa0—未加样品溶液的自氧化速率；δa1—加入样品溶液的自氧化速率。

体外抗肿瘤活性实验

样品溶液配制羧甲基茯苓多糖cmp33样品分别以dmem高糖基础培养基和mccoy’s5a基础培养基配制成1000μg/ml母液，无菌环境下用0.22μm滤膜过滤除菌，并依次两倍稀释成不同浓度梯度溶液待用。

细胞培养以dmem高糖完全培养基(含10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素)培养hepg-2、mcf-7、sgc-7901、a549细胞；mccoy’s5a完全培养基(含10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素)培养ht-29细胞。取对数生长期细胞进行相应实验。

细胞增殖测定采用mtt比色法分析cmp33对五种细胞的生长抑制作用。取对数生长期的细胞100μl接种至96孔板中，置于培养箱内培养48h。分别加入浓度为31.25-1000μg/ml的梯度cmp33样品(图9a)和阳性药物5-氟尿嘧啶(5-fu)，每孔200μl，设置空白培养基为对照，每个样品均设5个复孔，置于培养箱内继续培养48h。pbs洗板，加入5mg/ml的mtt溶液20μl和相应基础培养液180μl，再于培养箱内培养4h。吸去含有mtt的培养液，加入dmso150μl振荡15min，于490nm处测定吸光度值。

细胞增殖抑制率(％)＝(1－od给药/od对照)×100％

体外抗炎活性实验

样品溶液配制羧甲基茯苓多糖cmp33以rpmi-1640培养基配制成1000μg/ml的多糖母液，无菌环境下用0.22μm滤膜过滤除菌，依次两倍稀释成不同浓度梯度溶液待用。

细胞培养以含8％胎牛血清(56℃灭活30min)的rpmi-1640完全培养基培养小鼠巨噬细胞raw264.7。取对数生长期细胞进行相应实验。

细胞毒性测定采用mtt比色法检测cmp33处理对raw264.7细胞的毒性强弱，测定操作同1.2.4.3。

实验分组取对数生长期raw264.7细胞，血球平板计数调整悬液密度约1×10⁵个/ml，反复吹打均匀后100μl/孔体积接种于96孔细胞培养板，置于37℃、含5％co2培养箱内培养24h后，吸去培养液，依照以下实验分组进行给药处理：control组，细胞培养基100μl；lps组：lps终浓度为1μg/ml的细胞培养基100μl；lps+多糖样品组：含lps终浓度为1μg/ml及31.25-1000μg/ml浓度梯度多糖样品的细胞培养基100μl；多糖样品组：31.25-1000μg/ml浓度梯度多糖样品(图9b)的细胞培养基100μl。每组样本设平行5个复孔。封板后置于培养箱内孵育24h，收集上清液。

no释放量测定羧甲基茯苓多糖cmp33对lps刺激诱导的raw264.7细胞no释放量采用griess试剂法^[13]测定。取已收集的上清液100μl于96孔板中，加入等体积griess试剂(0.1％1-萘乙烯二胺与溶于5％磷酸的1％对氨基苯磺酸等量混合)，室温下振荡反应10min后于540nm波长处测定吸光度值，根据no2^-标准曲线(nano2溶液0～200μmol/l梯度浓度与griess试剂反应，no2^-的浓度为横坐标，540nm处吸光度值为纵坐标，绘制曲线)，计算出细胞上清液中no的释放量以及多糖样品对no释放的抑制率。

细胞因子释放量测定羧甲基茯苓多糖cmp33对lps刺激诱导的raw264.7细胞白介素-6(il-6)、肿瘤坏死因子-α(tnf-α)及白介素-1β(il-1β)释放量采用mousetnf-αelisakit、mouseil-6elisakit及mouseil-1βelisakit测定，按照说明书进行操作。

小鼠体内抗炎实验

急性肠炎模型的建立小鼠在动物房饲养1周，实验开始前24h，不禁水禁食。次日上午，按小鼠体重值随机分为4组：正常组normal；模型组model；给药cmp33组；阳性药物柳氮磺胺吡啶治疗组sasp,200mg/kg；每组16只小鼠，体重约20g左右。各小鼠称重记录，计算出对应给药体积(3.5％水合氯醛12ml/kg；tnbs乙醇溶液6ml/kg)。

小鼠3.5％水合氯醛腹腔注射麻醉后，使用12#灌胃针从小鼠肛门通入长度约4cm深度进行通肠操作(减少药物被粪便吸收的量)；操作完成后，吸取相应体积的tnbs/乙醇溶液，经小鼠肛门缓慢注入结肠内造模，其中normal组以等量生理盐水灌肠。灌注完成后将小鼠倒悬位持续3min左右，以防止造模药物流出。

给药本实验持续7天，造模6h后即开始第一次灌胃给药，cmp33组和sasp组，按照10ml/kg剂量灌胃给药，normal组和model组以等量蒸馏水灌胃，连续给药共6天。至第7天，小鼠眼眶取血，脱颈椎处死冰上解剖取材。

疾病活动指数评分造模后，每日记录小鼠饮食和体重，观察小鼠毛发光泽、活动状况、精神状况、大便性状，取小鼠粪便按照hemoccultsensaslides试纸说明书操作，根据试纸蓝色显色程度记录便隐血情况；采用体重变化、大便性状及便隐血数据三项指标，根据表1对各只小鼠进行dai评分，dai分值为体重下降分数、大便性状分数和便血分数的总和，计算出各组平均dai评分，以此评估ibd小鼠和给药治疗小鼠的疾病活动情况。

表1dai评分标准

结肠宏观评分肉眼观察各组小鼠的结肠溃疡、坏死程度、结肠粘连程度，游标卡尺量度结肠部分最大厚度，并以此三个指标建立宏观评分系统，具体评分标准如表2，宏观病理评分为三个指标分值之和，得出各组小鼠平均宏观病理评分，以此评估结肠组织病变部位的病理变化情况。

表2结肠宏观评分

表2结肠宏观评分(续)

结肠组织学评分根据表3对结肠组织炎症状态进行评价，其中炎症程度根据炎性细胞浸润数量和浸润深度判断。每组取6只小鼠，由两位病理医生采用双盲法读片并评分，结果取其平均值。

表3结肠显微病理评分

结肠组织mpo测定称取结肠组织，置于已预冷的ep管中，冰上剪碎，重量体积比1:19加入依测试盒中说明配制的试剂二为匀浆介质制备成5％的结肠组织匀浆；取5％的结肠组织匀浆0.9ml加入测试盒中3号试剂0.1ml，充分混匀于37℃水浴15min，取出待测；参照测试盒说明书操作表比例配制溶液混和均匀，60℃水浴锅中反应10min，460nm波长下立即测定吸光度值，计算公式：

式中，g为结肠组织量。

结肠组织mda测定冰上剪取结肠组织，置于已预冷的ep管中，加入组织匀浆液匀浆30s(冰上操作)，4℃3000r/min离心15min，取上清液，制备成10％的结肠组织匀浆液；参照测mda试盒说明书操作表比例配制溶液，旋涡混匀器混匀后，95℃水浴40min，然后4000r/min离心10min，取上清液在532nm波长下测定各管的吸光度值，计算公式如下：

式中，mda含量单位nmol/mg.pro；标准品浓度10nmol/ml；待测样本蛋白浓度单位mg.pro/ml。

结肠组织和血液中细胞因子含量测定根据elisa试剂盒说明书操作，并绘制标准曲线，计算出样品浓度除以相应蛋白质含量，得出各组结肠组织和血液中测定细胞因子含量(单位为pg/mg.pro)。

应用实施例1

羧甲基茯苓粗多糖180mg溶于5ml超纯水中上deae-52纤维素离子交换层析柱纯化(图1)，用0.1mol/lnacl溶液洗脱，流速为0.45ml/min，12min/管收集，苯酚-硫酸法进行跟踪检测，收集洗脱峰，真空浓缩，透析后冷冻干燥，制得羧甲基茯苓多糖cmp3。再将cmp380mg溶于2ml超纯水中上saphadex-g200和saphadex-g150层析柱进一步纯化(图2)，0.1mol/lnacl溶液洗脱，流速为0.3ml/min，10min/管收集，真空浓缩，透析后冷冻干燥，制得羧甲基茯苓多糖cmp33。结构鉴定结果表明(图3，图4，图5a，图5b，图6a，图6b，图7a，图7b，图7c，图7d，图7e，图8)，cmp33是一种分子量为15.23×10⁴da的(1→3)-β-d-葡聚糖，含少量(1→6)和(1→2)糖苷键，单糖组成为d-葡萄糖，具有三螺旋结构。

应用实施例2

选取cmp33样品(0.2-10mg/ml)和阳性对照vc溶液(0.005-0.5mg/ml)进行体外抗氧化实验。结果表明，cmp33具有还原能力，并对dpph自由基(dpph·)、abts自由基(abts+)、羟基自由基(·oh)及超氧阴离子自由基(·o2-)均表现出清除活性，呈剂量依赖性，其中对dpph、·abts+、·oh的ec50值分别为3.62mg/ml、3.55mg/ml、2.31mg/ml。

应用实施例3

选取浓度为31.25-1000μg/ml的浓度梯度cmp33样品和阳性药物5-氟尿嘧啶(5-fu)进行体外抗肿瘤实验。结果表明(表4-5)，cmp33在31.25-1000μg/ml浓度范围内对结肠癌细胞ht-29、肝癌细胞hepg-2、乳腺癌细胞mcf-7、胃癌细胞sgc-7901以及肺癌细胞a549细胞增殖体现出抑制作用，ic50值分别为113.3、282.7、385.8、79.56、204.1μg/ml。表中a-f代表不同浓度之间的显著性差异p，按照字母表顺序由大到小排列，相邻字母间为p＜0.05，差异显著。

表4cmp33对五种癌细胞的抑制效果(n＝5)(％)

表55-氟尿嘧啶(阳性对照)对五种癌细胞的抑制效果(n＝5)(％)

应用实施例4

选取31.25-1000μg/ml浓度梯度的cmp33样品进行体外抗炎实验。结果表明(图9a，图9b，图10a，图10b，表6)，cmp33能显著抑制脂多糖(lps)诱导的小鼠单核巨噬细胞raw264.7释放一氧化氮(no)、白介素-6(il-6)、肿瘤坏死因子-α(tnf-α)及白介素-1β(il-1β)，31.25～1000μg/ml浓度范围内，对lps诱导的no、il-6、tnf-α及il-1β生成的抑制率分别达到52.31％、47.96％、79.68％及51.80％，具有抗炎活性；无lps诱导时cmp33可激活raw264.7细胞分泌no、il-6、tnf-α及il-1β，31.25-1000μg/ml浓度范围内对其分泌量最大值分别是control组的5.05倍、12.28倍、2.40倍及6.55倍，具有免疫调节作用。

表6cmp33对raw264.7细胞分泌细胞因子的影响(n＝5)

注：与control组相比较，#p＜0.05，##p＜0.01；与lps组相比较，*p＜0.05，**p＜0.01。

应用实施例5

按前面所述方法，使用低剂量治疗组cmp33(l),100mg/kg和高剂量治疗组cmp33(h),300mg/kg进行小鼠体内抗炎实验，实验结束计算疾病活动指数dai(图11)，图11中横坐标从左到右分别为正常组，模型组，给药cmp33(l)组，给药cmp33(h)组，阳性药sasp组，纵坐标为dai，着dai分值为体重下降分数、大便性状分数和便血分数的总和；结肠宏观评分和结肠显微病理评分(如图12，图13a，图13b，图14，图15a～图15f)；检测结肠组织mpo和mda(图16-17)，以及结肠组织和血液中细胞因子含量(如图18a～图18f，图19a～图19f，图20a～图21c)。图13a中，横坐标从左到右分别为正常组，模型组，给药cmp33(l)组，给药cmp33(h)组，阳性药sasp组，纵坐标为结肠长度(cm)；图13b中，(横坐标从左到右分别为正常组，模型组，给药cmp33(l)组，给药cmp33(h)组，阳性药sasp组，纵坐标为结肠厚度(mm)。图14中横坐标从左到右分别为正常组，模型组，给药cmp33(l)组，给药cmp33(h)组，阳性药sasp组，纵坐标为病理宏观评分。图15f中，横坐标从左到右分别为正常组，模型组，给药cmp33(l)组，给药cmp33(h)组，阳性药sasp组，纵坐标为组织学评分。图16中，横坐标从左到右分别为正常组，模型组，给药cmp33(l)组，给药cmp33(h)组，阳性药sasp组，纵坐标过氧化物酶活性。图17中，横坐标从左到右分别为正常组，模型组，给药cmp33(l)组，给药cmp33(h)组，阳性药sasp组，纵坐标为丙二醛含量(nmol/mg)。图18a中，横坐标从左到右分别为正常组，模型组，给药cmp33(l)组，给药cmp33(h)组，阳性药sasp组，纵坐标为细胞因子ifn-γ含量pg/mg.pro。图18b～图18f中纵坐标分别为细胞因子il-1β含量(pg/mg.pro)、细胞因子il-6含量(pg/mg.pro)、细胞因子il-12含量(pg/mg.pro)、纵坐标为细胞因子il-17含量(pg/mg.pro)、细胞因子tnf-α含量(pg/mg.pro)。图19a中，横坐标从左到右分别为正常组，模型组，给药cmp33(l)组，给药cmp33(h)组，阳性药sasp组，纵坐标为细胞因子ifn-γ含量(pg/mg.pro)，图19b～图19f中纵坐标分别为细胞因子il-1β含量(pg/mg.pro)、细胞因子il-6含量(pg/mg.pro)、细胞因子il-12含量(pg/mg.pro)、细胞因子il-17含量(pg/mg.pro)、细胞因子tnf-α含量(pg/mg.pro)。

图20a中横坐标从左到右分别为正常组，模型组，给药cmp33(l)组，给药cmp33(h)组，阳性药sasp组，纵坐标为细胞因子il-2含量(pg/mg.pro)。

实例结果如下：

(1)根据小鼠体重下降比例(％)、大便性状以及便潜血三个指标进行dai评分，得出normal组小鼠为0.23±0.17，model组小鼠为6.06±0.98，与normal组比较差异及显著(p＜0.01)；阳性药sasp组dai评分为4.34±0.86，显著低于model组(p＜0.01)；给药cmp33(l)和cmp33(h)组dai评分分别为3.84±0.95和3.09±0.75，与model组比较差异显著(p＜0.01)。因此，说明羧甲基茯苓多糖给药与阳性药sasp均可不同程度的改善由tnbs诱导的小鼠急性ibd症状，具有一定的疗效。

(2)tnbs诱导的ibd动物模型的主要病变部位为结肠组织部分，以结肠长度、最大厚度、粘连及坏死程度等作为参数指标，宏观评价造模后各组小鼠的结肠病变部位的病变情况。肉眼观察各组小鼠结肠外观，normal组小鼠结肠组织正常，结肠长度10.52±1.38cm，厚度0.22±0.06mm。model组小鼠结肠长度缩短为7.26±1.01cm，与normal组相比具显著性差异(p＜0.01)；肠壁水肿增厚明显1.15±0.26mm，与normal组相比具显著性差异(p＜0.01)；结肠宏观病理评分为5.53±0.95，与normal组评分0.36±0.25比较显著升高，具极显著差异(p＜0.01)。sasp组小鼠结肠长度与model组无显著性差异(p＞0.05)，与model组比较结肠厚度显著减少(p＜0.01)，小鼠结肠宏观病理评分为3.39±0.58，与model组比较具显著性差异(p＜0.01)。给药cmp33(l)组小鼠结肠长度与model组比较差异不显著(p＞0.05)，结肠厚度与model组比较差异显著(p＜0.01)，小鼠结肠宏观病理评分为3.56±0.91，与model组比较具显著性差异(p＜0.01)。给药cmp33(h)组小鼠结肠长度与厚度与model组比较差异显著(p＜0.01)，小鼠结肠宏观病理评分为3.09±0.79，与model组比较具显著性差异(p＜0.01)。结肠组织宏观病理改变观察结果表明，阳性药和cmp33灌胃给药处理均可有效改善tnbs诱导的ibd小鼠的宏观表现，其中以cmp33(h)给药组小鼠改善程度最为明显，进一步证明多糖给药处理对ibd小鼠具有明显的治疗效果。

(3)通过常规he染色，观察小鼠结肠溃疡和炎性细胞浸润等病理改变情况，结果表明，normal组小鼠结肠组织基本正常，病理切片组织学评分为0.72±0.16。model组小鼠的评分为8.72±0.87，显著高于normal组(p＜0.01)。sasp组小鼠结肠病理切片组织学评分为6.85±0.99，显著低于model组(p＜0.01)。给药cmp33(l)组小鼠结肠病理切片组织学评分6.55±0.95，显著低于model组(p＜0.01)。给药cmp33(h)组小鼠结肠病理切片组织学评分为5.56±0.48，显著低于model组及sasp组(p＜0.01)。因此说明给药cmp33(l)组、cmp33(h)组及sasp组均可起到抑制tnbs诱导的ibd小鼠的结肠组织炎症变化，其中给药cmp33(h)组抑制炎症及缓解病变效果最为显著。

(4)采用试剂盒测定造模后各组小鼠结肠组织mpo和mda含量的变化。model组小鼠结肠mpo活性为2.32±0.30u/g，明显高于normal组的0.51±0.24u/g(p＜0.01)，cmp33与sasp给药处理后，各组小鼠的结肠组织mpo活性与model组比较明显降低，均具有显著性差异(p＜0.01)。model组小鼠结肠mda含量为7.50±0.40nmol/mg·pro与normal组2.19±0.33nmol/mg·pro比较显著上升(p＜0.01)，各组给药处理后小鼠的结肠组织mda含量与model组比较明显降低，均具有显著性差异(p＜0.01)。结果表明，各组给药处理均可降低小鼠结肠组织mpo活性和mda的含量，减少结肠组织中中性粒细胞的浸润程度和膜受损害的程度，与组织学结果相同，不同程度的缓解tnbs诱导的ibd小鼠的炎症症状，体现抗ibd活性，以给药cmp33(h)组抑制效果最为显著。

(5)采用elisa试剂盒测定造模后各组小鼠结肠组织和血液中细胞因子水平变化情况。model组小鼠结肠组织和血液中ifn-γ、il-1β、il-6、tnf-α和il-2的含量与正常normal组比较均显著升高(p＜0.01)；与model组比较，给药治疗的各组造模小鼠各细胞因子含量显著下调(p＜0.01)。model组小鼠结肠组织和血液中il-12的含量明显升高(p＜0.01)；而与model组比较，给药治疗后il-12含量下调，但结肠组织中其降低程度无统计学意义(p＞0.05)；血液中体现出显著性差异(p＜0.01)。model组小鼠结肠组织内和血液中细胞因子il-17含量与normal组比较均显著升高(p＜0.01)。给药各组小鼠结肠组织和血液中il-17含量与model组比较降低，其在cmp(l)组结肠组织内下降无显著差异(p＞0.05)，cmp(h)组和sasp组差异显著(p＜0.05)；给药各组小鼠血液中il-17含量只有下降趋势均未体现出显著性差异(p＞0.05)。与normal组比较，model组小鼠结肠组织和血液中il-4含量水平下调；各治疗组小鼠结肠组织和血液中il-4含量均有不同程度的增加，其中以结肠组织内sasp治疗组和血液中cmp33(l)治疗组表现出显著性差异(p＜0.05)。model组小鼠结肠组织内和血液中细胞因子il-10含量水平与normal组比较均明显降低(p＜0.01)；而给药治疗各组小鼠结肠组织和血液中il-10含量水平均高于model组(p＜0.01)。结果表明，cmp33对tnbs造模小鼠结肠组织和血液中多种炎症相关细胞因子的分泌表达均表现出一定的调节作用，下调与th1细胞相关的il-1β、il-2、ifn-γ、il-12、tnf-α，th2细胞相关的il-6，th17细胞相关的il-17的分泌水平，上调th2细胞相关的il-4、il-10的分泌水平。