桑黄护肝多糖PPB-2及其制备方法与流程

本发明涉及多糖制备技术领域，尤其涉及了桑黄护肝多糖ppb-2及其制备方法。

背景技术：

桑黄主要寄生于桑树、杨树、暴马丁香、松树、白桦等树干上，是一类药用真菌的总称。桑黄作为一种重要药用菌有着非常广泛的药理作用，主要表现在以下几个方面：抗突变作用；增强机体的免疫力；抗肿瘤作用；抗纤维化和脂质过氧化作用。我国是野生药用真菌出口大国，但目前对桑黄菌的研究还处于初步阶段，技术尚未成熟。由于我国有限的桑黄资源被过分采集，导致桑黄野生资源濒临枯竭，难以成为稳定的工业产品来源，远远不能满足市场的需求。因而，利用人工栽培技术来生产桑黄子实体来代替野生桑黄是克服利用野生资源生物量受限的最佳途径。桑黄子实体一般不能直接食用，或者若直接食用不易达到保健治疗效果，只有将有效成分浓缩或纯化，才能提高其功效。

真菌多糖作为一类重要的生物活性物质，国内外对真菌多糖的制备、结构、合成、药理学、临床学等方面做了很多工作，其多方面的生物学活性已经得到了开发和应用，如云芝多糖、猪苓多糖、香菇多糖、茯苓多糖等多种真菌制剂已经取得了良好的临床效果。但是，由于目前分离到的大都是一些杂多糖，加之生长环境，提取分离技术的不同造成多糖结构或活性的差异，这都给其进一步的研究带来困难，使在分子水平上阐明它们的药理作用和作用机制收到了限制。

另外，虽然不少真菌多糖已经应用于临床，但由于结构不明确，质量难以控制，造成药效重复性较差，不符合国际规范，因而难于在医药领域占主要地位。因此，真菌多糖的分离纯化和结构分析，是真菌多糖进行研究和开发的基础。

技术实现要素：

本发明针对现有技术中存在的上述缺点，提供了桑黄护肝多糖ppb-2及其制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决：

桑黄护肝多糖ppb-2的制备方法，包括以下步骤：

(1)桑黄子实体于60℃烘干至恒重，超微粉碎后，得到桑黄粉；

(2)桑黄粉用石油醚脱脂和体积浓度为90％乙醇去除苷类和生物碱后得到桑黄残渣；

3)桑黄残渣中加入含质量浓度为0.1％nacl的聚乙二醇400水溶液提取桑黄粗多糖，得到桑黄粗多糖提取液，桑黄粗多糖提取液用无水乙醇沉淀得到桑黄粗多糖；

(4)桑黄粗多糖经sevag法除去蛋白质，经透析后用乙醇沉淀得到预制品；

(5)预制品经deae-52离子交换层析柱洗脱后，苯酚-硫酸法检测，收集有显色反应的洗脱液，得到3个多糖组分，取第2个组分经葡聚糖g100层析柱洗脱后，苯酚-硫酸法检测，收集有显色反应的洗脱液，得到桑黄护肝多糖ppb-2；

步骤(5)中，预制品经deae-52离子交换层析柱洗脱的具体步骤为：预制品用蒸馏水溶解配制成20mg/ml溶液，离心，取上清液过0.45μm滤膜，上deae-52离子交换层析柱，用蒸馏水、0.1mol/lnacl水溶液、0.2mol/lnacl水溶液和0.4mol/lnacl水溶液以2.0ml/min流速逐级进行梯度洗脱，洗脱液用自动收集器收集，经苯酚-硫酸法检测，收集有显色反应的洗脱液，减压浓缩后，-50℃下真空干燥，得到3个多糖组分。

作为优选，步骤(2)中脱脂和苷类和生物碱的具体步骤为：桑黄粉中按w:v为1:2加入石油醚，在60℃下回流脱脂1h，重复2次，抽滤；残渣中按w:v为1:5加入体积浓度为90％乙醇在95℃下回流1h，除去苷类和生物碱，重复3次，抽滤，残渣在60℃条件下烘干至恒重，得到桑黄残渣。

作为优选，步骤(3)中，桑黄残渣采用微波提取法提取桑黄粗多糖，得到桑黄粗多糖提取液，微波功率为300～500w，微波时间为5～10min。

微波提取有助于高分子多糖分解成低分子多糖，同时，既可以增加多糖的溶解度和降低多糖的粘稠度，也有助于增加多糖的活性。

作为优选，聚乙二醇400水溶液的体积浓度为20％～40％，含0.1％nacl的聚乙二醇400水溶液与桑黄残渣的体积质量比为20～40:1。

聚乙二醇400是一种绿色，无毒的有机试剂，它能够增加多糖的溶解性，改变溶液的消耗因数，加速微波能量转移，从而大大提高桑黄粗多糖的提取效率；同时，本发明在聚乙二醇400水溶液中加入0.1％nacl作为提取介质，能够促进微波加热和能量的传递，提高桑黄粗多糖的提取效率。

作为优选，步骤(4)中，sevag法除蛋白质的具体步骤为：桑黄粗多糖溶于去离子水配成10mg/ml的溶液，与sevag试剂混合除去蛋白质10次，减压浓缩除去sevag试剂，sevag试剂为体积比为4:1的氯仿和正丁醇。

作为优选，步骤(4)中，透析时间为48h，透析所用透析袋的截留量为3000kda。

作为优选，步骤(3)和(4)中，无水乙醇沉淀的具体步骤为：在桑黄粗多糖提取液或透析后的桑黄粗多糖中加入无水乙醇，使乙醇质量浓度达到80％，搅拌后，4℃冰箱中过夜，4000r/min离心15min后，收集沉淀，冷冻干燥后得到桑黄粗多糖或预制品。

作为优选，步骤(5)中，第2个组分经葡聚糖g100层析柱洗脱的具体步骤为：取第2个组分用蒸馏水溶液配制成10mg/ml溶液，过0.45μm滤膜，上葡聚糖g100层析柱，用蒸馏水以1.0-1.2ml/min流速洗脱，洗脱液用自动收集器收集，经苯酚-硫酸法检测后，收集有显色反应的洗脱液，减压浓缩后，冷冻干燥得到桑黄护肝多糖ppb-2。

由上述制备方法制备得到的桑黄护肝多糖ppb-2。

作为优选，桑黄护肝多糖ppb-2包括海藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖及甘露糖，采用多角度激光散射法测定桑黄护肝多糖ppb-2的分子量，得到桑黄护肝多糖ppb-2的数均分子量为1.949×10⁴da，重均分子量为2.060×10⁴da，桑黄护肝多糖ppb-2是一种高度聚合的大分子多糖。

本发明由于采用了以上技术方案，具有显著的技术效果：

本发明制备得到的桑黄护肝活性多糖ppb-2，纯度均一，对四氯化碳引起的小鼠急性肝损伤有很好的保护作用，可用于护肝产品的开发，这对于提升桑黄药用价值，具有积极的社会效益和经济效益。

附图说明

图1是本发明的桑黄护肝活性多糖ppb-2的单糖组成图，其中，1为木糖，2为阿拉伯糖，3为半乳糖，4为葡萄糖，5为海藻糖，6为甘露糖。

图2是本发明的桑黄护肝活性多糖ppb-2的分子量分布图。

图3是本发明的桑黄护肝活性多糖ppb-2的红外光谱图。

图4是本发明的桑黄护肝活性多糖ppb-2的核磁共振氢谱图。

图5是本发明的桑黄护肝活性多糖ppb-2的扫描电镜图，其中(a)为放大500倍的多糖扫描电镜图；(b)为放大1000倍的多糖扫描电镜图。

图6是实施例1的小鼠肝脏病理切片图，其中：a为空白对照组的小鼠肝脏病理切片图；b为模型对照组的小鼠肝脏病理切片图；c为ppb-2低剂量组的小鼠肝脏病理切片图；d为ppb-2高剂量组的小鼠肝脏病理切片图；e为阳性对照组的小鼠肝脏病理切片图。

具体实施方式

下面结合附图与实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1

桑黄子实体由浙江省杭州市淳安县千岛湖桑都食用菌生产合作社栽培。

桑黄护肝多糖ppb-2的制备方法，包括以下步骤：

(1)桑黄子实体于60℃烘干至恒重，超微粉碎后，得到桑黄粉。

(2)桑黄粉用石油醚脱脂和体积浓度为90％乙醇去除苷类和生物碱后得到桑黄残渣。

步骤(2)中脱脂和苷类和生物碱的具体步骤为：桑黄粉中按w:v为1:2加入石油醚，在60℃下回流脱脂1h，重复2次，抽滤；残渣中按w:v为1:5加入体积浓度为90％乙醇在95℃下回流1h，除去苷类和生物碱，重复3次，抽滤，残渣在60℃条件下烘干至恒重，得到桑黄残渣。

(3)桑黄残渣中加入含质量浓度为0.1％nacl的聚乙二醇400水溶液提取桑黄粗多糖，得到桑黄粗多糖提取液，桑黄粗多糖提取液用无水乙醇沉淀得到桑黄粗多糖；

步骤(3)中，桑黄残渣采用微波提取法提取桑黄粗多糖，得到桑黄粗多糖提取液，微波功率为300w，微波时间为5min。

聚乙二醇400水溶液的体积浓度为20％，含0.1％nacl的聚乙二醇400水溶液与桑黄残渣的体积质量比为20:1。

步骤(3)中，无水乙醇沉淀的具体步骤为：在桑黄粗多糖提取液中加入无水乙醇，使乙醇质量浓度达到80％，搅拌后，4℃冰箱中过夜，4000r/min离心15min后，收集沉淀，冷冻干燥后得到桑黄粗多糖，桑黄粗多糖的得率为4.2％。

(4)桑黄粗多糖提取液经sevag法除去蛋白质，经透析后用乙醇沉淀得到预制品；

步骤(4)中，sevag法除蛋白质的具体步骤为：桑黄粗多糖溶于去离子水配成10mg/ml的溶液，与sevag试剂混合除去蛋白质10次，减压浓缩除去sevag试剂，sevag试剂为体积比为4:1的氯仿和正丁醇。

步骤(4)中，透析时间为48h，透析所用透析袋的截留量为3000kda。

步骤(4)中，无水乙醇沉淀的具体步骤为：在透析后的桑黄粗多糖中加入无水乙醇，使乙醇质量浓度达到80％，搅拌后，4℃冰箱中过夜，4000r/min离心15min后，收集沉淀，冷冻干燥后得到预制品。

(5)预制品经deae-52离子交换层析柱洗脱后，苯酚-硫酸法检测，收集有显色反应的洗脱液，得到3个多糖组分，取第2个组分经葡聚糖g100层析柱洗脱后，苯酚-硫酸法检测，收集有显色反应的洗脱液，得到桑黄护肝多糖ppb-2。

步骤(5)中，预制品经deae-52离子交换层析柱洗脱的具体步骤为：预制品用蒸馏水溶解配制成20mg/ml溶液，离心，取上清液过0.45μm滤膜，上deae-52离子交换层析柱，用洗脱剂以2.0ml/min流速洗脱，用蒸馏水、0.1mol/lnacl水溶液、0.2mol/lnacl水溶液和0.4mol/lnacl水溶液以2.0ml/min流速逐级进行梯度洗脱，洗脱液用自动收集器收集，经苯酚-硫酸法检测，收集有显色反应的洗脱液，减压浓缩后，-50℃下真空干燥，得到3个多糖组分。

步骤(5)中，第2个组分经葡聚糖g100层析柱洗脱的具体步骤为：取第2个组分用蒸馏水溶液配制成10mg/ml溶液，过0.45μm滤膜，上葡聚糖g100层析柱，用蒸馏水以1.0ml/min流速洗脱，洗脱液用自动收集器收集，经苯酚-硫酸法检测后，收集有显色反应的洗脱液，减压浓缩后，冷冻干燥得到桑黄护肝多糖ppb-2。

对本实施例制备得到的桑黄护肝多糖ppb-2进行单糖分析，如图1所示，其中，1为木糖，2为阿拉伯糖，3为半乳糖，4为葡萄糖，5为海藻糖，6为甘露糖，因此，该ppb-2主要由海藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖及甘露糖组成；采用多角度激光散射法测定桑黄护肝多糖ppb-2的分子量，由图2可知：得到桑黄护肝多糖ppb-2的数均分子量为1.949×10⁴da，重均分子量为2.060×10⁴da，桑黄护肝多糖ppb-2是一种高度聚合的大分子多糖。

红外光谱是用来定性的分析高分子中如o-h、n-h和c＝o等官能团，测试本实施例制备得到的桑黄护肝多糖ppb-2的红外光谱。由图3可知：该ppb-2在3439.63cm^-1的振动显示氢键的存在及o-h键伸缩震动的强吸收，峰值在2394.77cm^-1的吸收表明c-h键的存在，在1032.27cm^-1和1069.76cm^-1的吸收表明多糖结构中吡喃环的存在，350-600cm^-1处的吸收预示此多糖为吡喃多糖。

核磁共振是分析有机物结构的有力手段。本实施例制备得到的桑黄护肝多糖ppb-2的¹hnmr(核磁共振氢谱)图(图4)显示：共振峰主要集中在3～5ppm之间，确定了多糖的存在。化学位移4.98ppm和5.10ppm显示了α和β-型糖苷异头碳结构的存在。3.3ppm～4.2ppm的信号峰的预示了吡喃糖的存在。3.14ppm～3.45ppm是基团o-ch3的信号。

对本实施例制备得到的桑黄护肝多糖ppb-2进行电镜扫描，如图5所示，该ppb-2在放大500倍时呈现片状和蜂窝状结构(图(a))，在放大1000倍时呈现不规则的结构及大小不一的块状结构(图(b))。

对本实施例制备得到的桑黄护肝多糖ppb-2进行护肝实验：

雄性icr小鼠(6-7周龄)，体重20-22g，由杭州师范大学动物中心提供。饲喂灭菌饲料和饮水，室内温度24±1℃，湿度为50±10％。动物适应7d后，开始实验。

(1)分组和给药

雄性icr小鼠按体重随机分5组，每组10只。实验设正常组、模型组、阳性对照组、低剂量组和高剂量组。低剂量组每日灌胃剂量为200mg/kg小鼠体重的桑黄护肝多糖ppb-2，高剂量组每日灌胃剂量为400mg/kg小鼠体重的桑黄护肝多糖ppb-2；正常组和模型组每只每日灌胃剂量为0.4ml的生理盐水；阳性对照组每日灌胃剂量为100mg/kg小鼠体重的的水飞蓟素。实验期间5组雄性icr小鼠均自由饮食、饮水。

给药2周后按以下方法制备肝损伤模型。

(2)肝损伤模型

末次给药1h后，正常组腹腔注射0.2ml的橄榄油，其余各组均腹腔注射0.01ml/g小鼠体重的ccl4的橄榄油溶液(v:v；0.2％)，禁食不禁饮，16h后将小鼠眼球摘除取血，静置半小时后，3000r/min离心10min，分离血清，装于1.5mlep管中4℃冷藏；同时，将小鼠脱颈椎处死，取肝脏，将肝脏放于冷生理盐水中漂洗去除积血，拭净剪碎后加入9倍组织重量的生理盐水，研磨充分匀浆，制成质量浓度为10％的匀浆，5000r/min离心10min后，取上清液，用于各种指标的测定。测定所需要的试剂盒由南京建成生物科技有限公司生产。

由表1可知，本实施例制备得到的桑黄护肝多糖ppb-2能够降低ccl4引起的小鼠血清中谷草转氨酶和谷丙转氨酶的活性及总胆固醇、甘油三酯和总胆红素的含量；由表2可知，ppb-2能够抑制ccl4引起的小鼠肝组织中的脂质过氧化反应(mda(丙二醛)含量)及提高肝组织中sod(超氧化物歧化酶)和cat(过氧化氢酶)活性，并提高肝组织中gsh(谷胱甘肽)含量。

因此，采用ccl4护肝模型研究发现，ppb-2对ccl4引起的急性肝损伤具有很好的保护作用。

表1桑黄护肝多糖ppb-2对ccl4引起的小鼠血清中谷草转氨酶和谷丙转氨酶的影响

*与模型组相比较差异显著

**与模型组相比差异极显著

表2桑黄护肝多糖ppb-2对ccl4引起的小鼠肝脏中mda含量及sod，cat和gsh活性的影响

*与模型组相比较差异显著

**与模型组相比差异极显著

另取一部分肝组织进行固定和组织切片观察。

切片制作过程如下：

1)固定：用体积浓度为10％的甲醛水溶液固定肝组织；

2)冲洗：将肝组织从固定液中取出，修理后置组织盒中，流水冲洗24h，水流流速以不激动组织盒内的肝组织为宜；

3)脱水、透明、浸蜡：将冲洗完毕的肝组织放入leicatp1020自动脱水机上进行，脱水的酒精浓度依次为30％、50％、80％、90％、95％、100％，然后依次转入50％酒精的二甲苯溶液(v:v；1:1)、石蜡i、石蜡ii依次透明与浸蜡；

4)包埋：在leicaeg1060组织包埋仪上按实验要求进行；

5)切片：稍修理包埋有肝组织的石蜡样周围的石蜡，置其于leicarm2135旋转切片机的载物台上，固定，顺时针匀速转动手轮，切片厚度为5μm；

6)展开和烤片：切好的蜡带即转入41℃水槽中，完全展开后用玻片直接捞取蜡带，并使其置于中间。在leicahi1220烤片机上41℃恒温烤片24h以上；

7)染色：h.e染色，将烤好的肝组织玻片放入leicaautostainbrxl染色机上自动进行染色；

8)封片：取出染色完毕的切片，用二甲苯透明3-5min，然后在切片边缘滴一滴树胶(树酯加少许二甲苯配制而成)，并轻轻加盖玻片，防止产生气泡；

9)显微镜观察，并在leicaqwin图象分析软件上处理显微镜图片。

由图6可知：正常组的小鼠肝细胞在显微镜下肝细胞索排列整齐，肝细胞无水肿，无脂肪变性(图(a))；模型组的小鼠肝细胞有明显的大范围脂肪变性，细胞内形成大量脂滴，胞脂质疏松，呈气球样变，局部可见点状坏死灶，炎症细胞浸润明显(图(b))；低剂量组肝细胞仍可见明显气球样变，其程度和范围均较模型组有所减轻(图(c))；高剂量组肝细胞内有小脂滴形成，未见明显的气球样变和核固缩(图(d))；阳性对照组也未见明显的气球样变和核固缩(图(e))。由此可见，桑黄护肝多糖ppb-2对ccl4引起的肝损伤具有保护作用。

实施例2

桑黄护肝多糖ppb-2的制备方法同实施例1，所不同的是：

步骤(3)中，桑黄残渣采用微波提取法提取桑黄粗多糖，得到桑黄粗多糖提取液，微波功率为400w，微波时间为7min，桑黄粗多糖的得率为5.6％。

聚乙二醇400水溶液的体积浓度为30％，含0.1％nacl的聚乙二醇400水溶液与桑黄残渣的体积质量比为30:1。

实施例3

桑黄护肝多糖ppb-2的制备方法同实施例1，所不同的是：

步骤(3)中，桑黄残渣采用微波提取法提取桑黄粗多糖，得到桑黄粗多糖提取液，微波功率为500w，微波时间为10min，桑黄粗多糖的得率为5.9％。

聚乙二醇400水溶液的体积浓度为40％，含0.1％nacl的聚乙二醇400水溶液与桑黄残渣的体积质量比为40:1。

总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。