检测桑丁香假单胞菌的引物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明为一种检测桑下香假单胞菌的引物及其应用，专用于检测桑下香假单胞 菌，属于农作物病害诊断与防治技术领域。
【背景技术】
[0002] 下香假单胞菌细菌性病害(Pseudomonas syringae pathovars)是世界上分布最 广、危害最严重且最难防治的重大细菌性病害，于2012年被列为十大细菌性病害之首 (Mansfield, J.et al ,2012,13(6) ,614-629)。此病广泛流行于热带、亚热带及溫带地区，有 40多个类型的致病变种，可对包括草本、灌木和乔本在内的200多种植物造成危害 (Rudolph，K.W，1995，1,47-138)。该病害可造成农作物最高减产90%，每年在全球范围内造 成直接经济损失高达350亿美元，引起了人们的广泛关注。
[0003] 桑疫病（mulberry bacterial blight)是由桑下香假单胞菌（Pseudomonas syringae pv.mori)引起的，桑下香假单胞菌属于下香假单胞菌的一个致病变种。桑疫病的 发生主要是其病原菌通过植株叶片气孔进入植株体内，并在植物维管束中进行大量繁殖， 导致导管阻塞，植物水分运输受阻，同时致病菌还不断合成分泌大量的毒素蛋白破坏植株 组织结构，使得植株最终表现出萎缩及腐烂症状，而植株的病变部位主要出现在植株的顶 端或者嫩梢，故桑疫病又称"烂头病"。该病因发病周期短，蔓延态势严峻，已成为制约蚕桑 产业可持续发展的重要因素。桑疫病一旦发生，很难进行有效的根治，而处在潜伏期的植物 组织从外观上很难与正常组织分开，因此，快速有效的早期诊断对于控制桑疫病的蔓延和 避免重大损失的发生具有重要意义。
[0004] 快速、精确的早期病原菌检测手段是提高病害检测效率的基础，也是降低生物防 治成本的前提。对于下香假单胞菌的检测，目前最主要的有选择性培养基和分子生物学的 方法。选择性培养基最早是由Mohan, S.K.等于1987年报道利用一种改良的KBC琼脂培养基 平板法快速检测紫下香和菜豆致病变种的下香假单胞菌。GoszczynskaJ.等在前人的基础 上作出改进，于1998年指出利用MT培养基可W进行下香假单胞菌与其他病原菌的区分，从 而达到检测下香假单胞菌的目的。目前使用的分离筛选下香假单胞菌的培养基大多也是基 于W上几种培养基或改良而来的。指示植物检测法是检测病原菌的方法之一，但由于周期 长，并且受季节性限制，因此该法不能广泛应用于快速检测下香假单胞菌。
[0005] 分子生物学方法主要包括普通PCR法及巧光定量PCR法。2005年，Zaccardelli，M. 等根据番茄下香假单胞菌的致病基因 hrpZ为目的片段设计特异性引物利用PCR扩增对番茄 下香假单胞菌进行快速检测。Rees Geo巧e，J.等于2010年依据16S-23S rDNA序列的间隔区 设计出特异性的引物对雜猴桃下香假单胞菌进行PCR检测。随着病原菌检测手段的不断提 高，2014年，Gal lei 1 i，A.等在普通PCR检测方法的基础上进行改进，利用巧光定量PCR方法 对雜猴桃下香假单胞菌进行快速检测。巧光定量PCR方法近年来凭借其灵敏度高、可靠性 强、稳健性好的Ξ大优点而广泛应用于食物病原菌及部分植物病原菌的快速检测，具有良 好的应用前景。然而，截止目前为止，尚未有文献报道关于应用巧光定量PCR方法进行桑疫 病病原菌的快速检测。
[0006] 因此本发明尝试使用巧光定量PCR方法对桑疫病病原菌进行绝对定量，不但提高 了检测的特异性和灵敏度，而且可避免生产上对桑树病害的误判，同时也降低了病原菌检 测所需的时间，为桑疫病的早期诊断和及早防治打下了基础。
【发明内容】
[0007] 解决的技术问题:本发明通过设计用于检测桑下香假单胞致病菌的特异性引物而 建立一种灵敏、可靠、稳定的检测桑下香假单胞菌的引物及其应用，从而克服桑疫病病原菌 传统检测方法和半定量PCR检测方法的不足。
[000引技术方案：检测桑下香假单胞菌的引物，正义引物Psm240F序列为：5'-AAGGTAACGGGGCTAAT-3 '，反义引物Psm4：MR序列为:5 ' -GCTGTTGACCGATGATAT-3 '。
[0009] 所述的引物在巧光定量PCR检测中的应用，包括W下步骤:1)利用KB液体培养基培 养病原菌，制备病原菌菌悬液，同时采用Biospin细菌全基因组DNA提取试剂盒（Bioer Technology Co.，Ltd.)提取病原菌总DNA，制备菌液和DM标准样品；2)特异性引物设计，对 致病性的桑下香假单胞菌设计了其特异性的引物对Psm240F/Psm434R，所述引物对为:正义 引物口3111240尸序列为：5'-4466了44〔6666(：了441'-3'，反义引物口31114341?序列为：5'-GCTGTTGACCGATGATAT-3 ' ； 3)实时巧光定量PCR检测方法反应体系为:2化L反应体系中，包含 ΙΟμΙ SYBR Premix Ex TaqiHTli R 化 seH Plus)(2X)，0.8yL Psm240F ΙΟμΜ,Ο.如 L Psm434R 10μΜ，0.4化ROX Reference Dye(50X)，2.0化模板为标准病原菌菌悬液和DNA稀 释液或待测样品的菌悬液，6化双蒸水;4)实时巧光定量PCR检测方法扩增程序为:两步法扩 增程序:第一步：95°C预变性lOmin;第二步:95°C变性15s，60°C延伸31S，反应共计45个循 环，PCR完成后，按0.1°C/s升溫速率从72°C升至95°C进行融解曲线的分析验证;5)取步骤1) 中得到的病原菌菌悬液经平板计数法定量并进行梯度稀释，稀释成9个不同的浓度梯度：1 X l〇8cfu/mL，5 X lO^cfu/mL，1 X l〇7cfu/mL，5 X l〇6cfu/mL，1 X l〇6cfu/mL，1 X l〇5cfu/mL，1 X 104cfu/mL，1 X 103c化/血，1 X 102cfu/mL，同时，取步骤1)中病原菌的全基因组DNA经ND-1000V3.7.1 (Thermo SCIENTIFIC,USA)定量并10倍梯度稀释，稀释成6个不同的浓度梯度： 6. Ong/yL，6.0 X l〇-ingAiL，6.0 X 1〇-2〇邑/化，6.0 X l〇-3ngAiL，6.0 X l〇-4ngAiL，6.0 X 10- 5ngAiL，W不同浓度梯度的菌悬液和DNA为模板按照上述PCR反应体系和扩增程序进行扩 增;反应结束后，根据各个浓度梯度的循环阔值(Ct)采用计算机自动绘制巧光定量PCR标准 曲线。
[0010] 桑树桑疫病的动态监测试剂盒，含有上述的引物。
[0011] 桑树植株带菌及带菌量的检测试剂盒，含有上述的引物。
[0012]有益效果
[0013]本发明基于桑下香假单胞菌区别于其他下香假单胞菌致病变种的特异性致病基 因片段化巧Z gene)设计和筛选了一对特异性引物对Psm240F/Psm434R，同时利用该引物对 建立一种桑疫病病原菌的巧光定量PCR检测方法，具有特异性好、灵敏度高的特点，且大大 缩短了检测所需时间，从样品处理至得出结果只需4~化。因此该方法适用于桑疫病的早期 诊断。
【附图说明】
[0014] 图1是引物对Psm240F/Psm434R特异性检测PCR扩增结果，其中泳道1为阴性对照； 泳道2、3模板为桑下香假单胞菌Psml4-7 (保藏编号为:CGMCC NO. 11139)和M4-13 (保藏编号 为CGMCC NO. 3621)的全基因组DNA;泳道4、5、6模板为紫下香假单胞菌（ICMP3189)、紫下香 假单胞菌(BCCM-LMG5083)、番茄DC3000下香假单胞菌(ATCC10862)的全基因组DNA;泳道Τι? 的模板分别为恶臭假单胞菌 (PSY12-1)、食树脂假单胞菌 (PS-N)、替实假单胞菌 (R-PS-2)、黄毛格假单胞菌(PS-K)、巧光假单胞菌(A.S.31)、魔氏假单胞菌(BQM5)、蒙氏假单胞菌 (LY107)、变形假单胞菌(PS-L)、嗜麦芽寡养单胞菌(PS-E)、大肠杆菌化Η5α)、洋葱伯克霍尔 德氏（ATCC 25416)的全基因组DNA;M为lOObp DNA Ladder;
[0015] 图2-1是普通PCR灵敏性扩增结果，其中泳道1-9的模板为阳性标准品，反应体系中 菌液的浓度分别为：1 X l〇8cfu/mL，5 X l〇7cfu/mL，1 X l〇7cfu/mL，5 X l〇6cfu/mL，1 X l〇6cfu/ mL，1 X l〇5c化/mL，1 X l〇4cfu/mL，1 X l〇3c化/mL，1 X l〇2cfu/mL 10为空白对照；11为阴性对 照;Μ为lOObp DNA Ladder;
[0016] 图2-2是普通PCR灵敏性扩增结果，其中泳道2-7的模板为阳性标准品，反应体系中 DNA浓度分别为：6. Ong/yL，6.0 X lO-ing/yL，6.0 X l〇-2ngAiL，6.0 X l〇-3ngAiL，6.0 X l〇-4ng/ yL，6.0X l〇-5ng/化；1 为空白对照;M为lOObp DNA Ladder;
[0017] 图3是实施例1巧光定量PCR引物特异性扩增溶解曲线，纵轴为Derivative;横轴为 Temperature,反应体系中菌液浓度分别为 1 X 108cfu/mL，5 X 107cfu/mL，1 X 107cfu/mL，5 X l〇6cfu/mL，1 X l〇6cfu/血，1 X l〇5cfu/mL，1 X l〇4cfu/mL，1 X 1〇3。化/血，1 X l〇2cfu/mL，特异 性产物的化值为86.7°C。
[001引图4a W CT值为纵坐标，DNA浓度的Log值为横坐标绘制的巧光绝对定量标准曲线 图：DNA浓度在6.0-6.0X10-5ng/化范围内，其Log值与Ct值呈良好的线性关系，y = -2.79612X+15.27236，r2 = 0.96606。
[0019] 图4b WCT值为纵坐标，菌液浓度的Log值为横坐标绘制的巧光绝对定量标准曲线 图：菌液浓度在102-10 8cfu/mL范围内，其Log值与Ct值呈良好的线性关系，y = -4.56215x+ 46.91167,R^ = 0.98872ο
[0020] 图5是实施例2田间爆发桑疫病桑树发病叶片中的病原菌和阳性对照菌株巧光定 量PCR扩增的溶解曲线，纵轴为导数（Derivative);横轴为溫度（Temperature),引物为 Psm240F/Psm434R，特异性产物的 Tm 值为 86.7°C。
【具体实施方式】
[0021] 实施例1桑下香假单胞菌的特异性引物检测
[0022] (1)参试菌株的培养和DNA提取
[0023] 参试的18株菌株包括2株分离于桑疫病爆发的桑园的桑下香假单胞菌Psml4-7(保 藏编号为:CGMCC No. 11139)和M4-13(保藏编号为CGMCC No.3621),3株其他致病变种的下 香假单胞菌包括紫下香假单胞菌（ICMP3189)、紫下香假单胞菌（BCCM-LMG5083)、番茄 DC3000下香假单胞菌(ATCC10862)，其他13株非下香假单胞菌属的菌株包括恶臭假单胞菌 (PSY12-1)、食树脂假单胞菌(PS-N)、替实假单胞菌(R-PS-2)、黄毛格假单胞菌(PS-K)、巧光 假单胞菌(A. S. 31)、魔氏假单胞菌(BQM5)、蒙氏假单胞菌化Y107)、变形假单胞菌(PS-L)、嗜 麦芽寡养单胞菌(PS-E)、大肠杆菌(DH5a)、洋葱伯克霍尔德氏(ATCC 25416)、桑青枯菌(RS-5)、桑肠杆菌(LGD8)。将菌株接种到邸液体培养基中（膜蛋白腺20g，屯水合硫酸儀1.5g，Ξ 水合憐酸氨二钟1.5g，甘油lOmL，蒸馈水10001^，9^.2±0.2)，28°(3，在转速为200巧111的恒 溫振荡培养箱中过夜培养，使用Biospin Genomic DNA Extraction Kit提取参试菌株的全 基因组DM。
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