(2)利用特异性引物对Psm240F/Psm434R进行普通PCR扩增
[0025] W桑下香假单胞菌及下香假单胞菌属下其他致病变种W及其他常见细菌性病害 病原菌基因组DNA为模板利用引物对Psm240F/Psm434R(该引物对由上海生工生物公司合 成)进行普通PCR扩增，W检测该引物的特异性。普通PCR反应体系如下：总反应体积25化，包 含化L DNA模板，12.扣L 2XTaq MasterMix(含2.5U Taq F*olymerase/yL，20mM Tris-肥 1， 3mM MgCl2,500yM dNTPaOOmM KC1)，8.5化双蒸水，lOuM引物Psm240F，10uM引物Psm4：MR。 反应程序为:94°C预变性3min，94°C变性30s，50°C退火30s，72°C延伸20s，30个循环，最后72 °C延伸5min。PCR扩增产物在1.5 %琼脂糖凝胶上电泳检测，同时将凝胶产物进行回收，克 隆，测序，将测序获得的数据序列与用于引物设计的模板基因序列化rpZ gene)进行序列比 对，查看二者的序列相似度；
[0026] W不同浓度梯度的桑下香假单胞菌Psml4-7菌株的菌悬液及全基因组DNA为模板 进行普通PCR扩增，W检测该引物对的灵敏性。反应体系和扩增程序如上述所示，PCR扩增模 板为:将桑下香假单胞菌Psml4-7的DNA用DNA提取试剂盒中的Elution Buffer进行十倍梯 度稀释，使其终浓度分别为5.0 X 1〇2叫/化，5.0 X lOVgAiL，5.0 X loVg/化，5.0 X lO-ing/μ L，5.0 X l〇-2ngAiL，5.0 X l〇-3ng/化，5.0 X l〇-4ng/化;将桑下香假单胞菌的菌悬液使用培养 液进行梯度稀释，使其终浓度分别为1.0 X 108cfu/mL 5.0 X 107cfu/mL 1.0 X 107cfu/mL 5.0 X l〇6cfu/血；1.0 X l〇6cfu/血；1.0 X l〇5c化/ιΛ; 1.0 X l〇4cfu/mL 1.0 X l〇3cfu/mL 1.0 X 102c化/mL; 1.0 X lOV化/mL。最后将PCR扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳检测，观察该 引物对的灵敏度。
[0027] (3)利用特异性引物对Psm240F/Psm434R进行巧光定量PCR反应
[002引将桑下香假单胞菌Psml4-7的全基因组DNA用DNA提取试剂盒中的Elution Buffer 进行十倍梯度稀释，使其终浓度分别为6. Ong/化，6.0 X lO-VgAiL，6.0 X 10-2ngAiL，6.0 X 10-3叫/化，6.0 X 10-4叫/化，6.0 X l0-5ng/yL。同时将桑下香假单胞菌的菌悬液使用培养液 进行梯度稀释，使其终浓度分别为 1.0 X l08cfιι/ιΛ; 5.0 X 107cfu/ml^; 1.0 X 107cfu/ml^; 5.0 X l06c化/ιΛ; 1.0 X l06c化/ιΛ; 1.0 X l05c化/ιΛ; 1.0 X l04cfu/mL 1.0 X l03c化/ιΛ; 1.0 X 102c化/mL。W该不同浓度梯度的DNA和菌悬液为模板，在20化巧光定量PCR反应体系中，包 含10化SYBRPremixExTaqΠ(TliR化seHPlus)(2X)，0.祉LPsm240Fα0μM)，0.如L Psm4：MR(10yM)，0.化L R0X Reference Dye(50X)，2.0化模板，6化双蒸水。每个样品进行3 次重复。巧光定量PCR扩增程序为:两步法扩增程序:第一步:95°C预变性lOmin;第二步:95 °C变性15s，60°C延伸31s，反应45个循环。最后分别WDNA和菌悬液的浓度为横坐标，WCT值 为纵坐标绘制绝对定量的标准曲线。
[00巧]实施结果
[0030]利用本发明设计的特异性检测引物对Psm240F/Psm434R对桑下香假单胞菌及下香 假单胞菌属下其他致病变种W及其它常见细菌性病原菌的PCR扩增结果(附图1)，该结果表 明该引物具有良好的特异性。50°C退火条件下，只有桑下香假单胞菌扩增出19化P大小的产 物，而其他菌株和阴性对照均无相应大小的扩增产物。再者通过琼脂糖凝胶电泳、胶回收、 DNA克隆、DNA测序获得的序列数据与用于引物设计的目的片段进行序列比对相似度为 99.3%，由此证明本发明的引物在桑下香假单胞菌的检测水平上具有特异性。
[0031] 利用该引物对Psm240F/Psm434R对桑下香假单胞菌菌悬液和全基因组DNA检测的 灵敏度结果如图2-1和2-2所示，普通PCR对桑下香假单胞菌菌悬液的最低检测浓度为1.0X 106c化/血，对全基因组DNA的最低检测浓度为6.0Xl〇-2ngAiL。
[0032] 利用该引物对Psm240F/Psm434R设计巧光定量PCR方法对桑下香假单胞菌的全基 因组DNA进行绝对定量检测，其标准曲线如图4a所示，DNA浓度在6.0 X 1 〇-S-6ng/化范围内， 其Log值与Ct值呈良好的线性关系，7 = -2.79612义+15.27236，1?2 = 0.96606。利用引物对 Psm240F/Psm434R设计巧光定量PCR方法对桑下香假单胞菌菌液进行绝对定量检测，其标准 曲线如图4b所示，菌液浓度在10 2~108c化/mL范围内，其Log值与Ct值呈良好的线性关系，y = -4.56215X+46.91167，r2 = 0.98872。
[0033] 巧光定量PCR反应的溶解曲线如图3所示，产物在86.7°C出现单一的峰，说明反应 中无非特异性的扩增或引物二聚体的干扰。
[0034] 实施例2对接种于健康桑树植株中的桑下香假单胞菌进行特异性检测
[0035] 将桑疫病致病菌桑下香假单胞菌Psml4-7菌株在KB液体培养基中进行活化培养， 培养溫度为28°C，培养条件为:在恒溫的震荡培养箱中进行振荡培养，转速为20化pm，使得 菌液浓度达到1.0X10 8c化/mL。然后接种于健康的桑树，W接种无菌水作为空白对照，将接 种过的桑树植株置于溫室玻璃房中，保持高溫高湿。4天后，取接种过的桑树植株不同部位 (上、中、下）的叶片组织、茎干组织、根部组织(表1)，每个处理设置3个重复。然后用无菌的 研鉢进行研磨制备相应的样液，分别取化L的样液进行巧光定量PCR检测。循环结束后，采用 仪器自带的分析软件，分析扩增结果，计算待测样品桑下香假单胞菌的DNA含量。
[0036] 实施结果
[0037] 采用人工接种的桑树样本对巧光定量PCR体系的可靠性和灵敏性进一步进行验 证。结果表明本研究建立的桑疫病病原菌巧光定量PCR检测体系具有高的可靠性及灵敏性， 该检测方法能够检测到的桑下香假单胞菌的最低菌液浓度为100c化/mLW及最低全基因组 DNA浓度为60fgAiL。在该检测方法检测范围内可W准确将其定量。
[0038] 将该检测结果与田间检测结果（表1)相结合，可W建立准确的桑疫病田间预测预 报系统。田间检测结果表明，桑疫病病原菌主要感染桑树顶端的嫩叶组织，而在其他组织部 位菌含量几乎为0,运与之前文献中的报道相吻合。
[0039] 表1巧光定量PCR的CT值和模拟病种样本的菌液浓度
[0040]
[0041 ]该检测方法利用巧光染料(SYBR Premix Ex Taqn)和w桑下香假单胞菌自身特 有的致病基因化rpZ gene)为模板设计的正、反向引物和阳性标准品，建立了实时巧光定量 PCR(q-PCR)反应体系，可W快速、准确地定量检测桑疫病病原菌桑下香假单胞菌，实验结果 表明对桑疫病病原菌DNA的最低检测浓度为60fgAiL，对桑疫病病原菌菌液的最低检测浓度 为10 2cfu/mL。同时，该方法可直接定量检测接种于健康桑树不同组织体内的病原菌，省去 了提取病原菌DNA的步骤，大大节省检测的时间，降低检测难度，并能真实反应植株不同部 位带菌量，为病害的早期预测和预警提供方法和基础。因此，该方法适合作为植物病害诊断 检测方法推广应用。
[0042] 上述实施方式仅为说明本发明专利，但不能W此来限定本发明的保护范围。本领 域的技术人员在本发明基础上所做的任何非实质性的变化和替换均属于本发明所要求保 护的范围。
[0043]
【主权项】
1. 检测桑丁香假单胞菌的引物，其特征在于正义引物Psm240F序列为：5'_ AAGGTAACGGGGCTAAT-3 '，反义引物Psm434R序列为:5 ' -GCTGTTGACCGATGATAT-3 '。2. 权利要求1所述的引物在荧光定量PCR检测中的应用，其特征在于包括以下步骤： 1) 利用KB液体培养基培养病原菌，制备病原菌菌悬液，同时采用Biospin细菌全基因组 DNA提取试剂盒提取病原菌总DNA，制备菌液和DNA标准样品； 2) 特异性引物设计，对致病性的桑丁香假单胞菌设计了其特异性的引物对Psm240F/ Psm434R，所述引物对为：正义引物Psm240F序列为：5 ' -AAGGTAACGGGGCTAAT-3 '，反义引物 Psm434R序列为：5 ' -GCTGTTGACCGATGATAT-3 ' ； 3) 实时荧光定量PCR检测方法反应体系为：20yL反应体系中，包含10yL SYBR Premix Ex Taqn(Tli RNaseH Plus)(2X),0.8yL Psm240F 10yM,0.8yL Psm434R 10yM,0.4yL ROX Reference Dye(50X )，2.0yL模板为标准病原菌菌悬液和DNA稀释液或待测样品的菌 悬液，6yL双蒸水； 4) 实时荧光定量PCR检测方法扩增程序为：两步法扩增程序：第一步：95°C预变性 lOmin;第二步:95°C变性15s，60°C延伸31s，反应共计45个循环，PCR完成后，按0. l°C/s升温 速率从72°C升至95°C进行融解曲线的分析验证； 5) 取步骤1)中得到的病原菌菌悬液经平板计数法定量并进行梯度稀释，稀释成9个不 同的浓度梯度：1 X 108cfu/mL，5 X 107cfu/mL，1 X 107cfu/mL，5 X 106cfu/mL，1 X 106cfu/mL，1 X 105cfu/mL，1 X 104cfu/mL，1 X 103cfu/mL，1 X 102cfu/mL，同时，取步骤1)中病原菌的全基 因组DNA经ND-1000V3.7.1定量并10倍梯度稀释，稀释成6个不同的浓度梯度:6.0ngAxL，6.0 X 10-Vg/yL，6 · 0 X 10-2ng/yL，6 · 0 X 10-3ng/yL，6 · 0 X 10-4ng/yL，6 · 0 X 10-5ng/yL，以不同浓 度梯度的菌悬液和DNA为模板按照上述PCR反应体系和扩增程序进行扩增;反应结束后，根 据各个浓度梯度的循环阈值(Ct)采用计算机自动绘制荧光定量PCR标准曲线。3. 桑树桑疫病的动态监测试剂盒，其特征在于含有权利要求1所述的引物。4. 桑树植株带菌及带菌量的检测试剂盒，其特征在于含有权利要求1所述的引物。
【专利摘要】本发明公开了一种检测桑丁香假单胞菌的引物及其应用，其正义引物Psm240F序列为：5ˊ-AAGGTAACGGGGCTAAT-3ˊ，反义引物Psm434R序列为：5ˊ-GCTGTTGACCGATGATAT-3ˊ。本发明基于桑丁香假单胞菌区别于其他丁香假单胞菌致病变种的特异性致病基因片段(hrpZ？gene)设计和筛选了一对特异性引物对Psm240F/Psm434R，同时利用该引物对建立一种桑丁香假单胞菌的荧光定量PCR检测方法，具有特异性好、灵敏度高的特点，且大大缩短了检测所需时间，从样品处理至得出结果只需4～5h。因此该方法适用于桑疫病的早期诊断。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105506072
【申请号】CN201510844991
【发明人】吴福安, 包奇, 周雨, 曹梦琪, 王俊, 盛晟
【申请人】江苏科技大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年11月27日