引物组合物及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及引物组合物及其用途，更具体的，本发 明涉及引物组合物、构建待测样品目标区域核酸测序文库的方法、确定待测样品目标区域 核酸序列的方法、同时确定多个待测样品的目标区域核酸序列的方法、确定待测样品目标 区域核酸序列的系统W及同时确定多个待测样品的目标区域核酸序列的系统。
【背景技术】
[0002] 目前使用的目标区域富集测序的技术主要采用两种策略：探针杂交捕获和PCR扩 增富集。其中，探针杂交捕获，整个流程大概需要4到7天，通常一个目标区域的成本从几 百到几千元不等，而且探针设计合成的周期通常为6到8周甚至更长时间。基于PCR原理 的目标区域富集技术通常只需要进行PCR和加接头操作就可W上机测序，整个流程一般只 需要1-2天，前期引物设计合成周期一般为2-4周，而且引物设计相对灵活，几十到几千对 都可W，一个样本的成本一般可W低至几十元到几百元，相对于探针杂交捕获具有一定的 优势。
[0003] 然而，目前的PCR扩增富集目标区域的方法仍有待改进。
【发明内容】
[0004] 本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
[0005] 目前的PCR扩增富集目标区域的方法在扩增结束之后都要在产物上再加上一个 接头才能进行后续的测序，需两步PCR反应，且中间还需要加入纯化步骤。因而，步骤较多， 过程仍较复杂，不利于较大样本量W及较多目标区域的PCR扩增富集。
[0006] 本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的 在于，通过不断优化引物设计、PCR反应体系和PCR热循环程序等，提出一种与现有方法相 比，步骤更少，操作更简单，需时更少，样本量和引物数量选择方面更加灵活的PCR扩增富 集目标区域的方法，并且结合高通量芯片实施该方法，即可容易地实现同时对多样本多区 域进行目标区域富集。
[0007] 因而，根据本发明的一个方面，首先本发明提供了一种引物组合物。根据本发明的 实施例，该引物组合物包含；第一引物组，所述第一引物组包含第一正向引物和第一反向引 物，其中，所述第一正向引物由目标区域特异性正向引物和第一核酸序列构成，所述第一核 酸序列位于所述目标区域特异性正向引物的5'端，所述第一反向引物由目标区域特异性 反向引物和第二核酸序列构成，所述第二核酸序列位于所述目标区域特异性反向引物的5' 端，所述第一核酸序列和所述第二核酸序列均为公共序列，且所述第一核酸序列和所述第 二核酸序列不同；第二引物组，所述第二引物组包含第二正向引物和第二反向引物，其中， 所述第二正向引物包含第一核酸序列和第一测序接头，所述第一测序接头位于所述第一核 酸序列的5'端，所述第二反向引物包含第二核酸序列和第二测序接头，所述第二测序接头 位于所述第二核酸序列的5'端。发明人棍奇地发现，利用本发明的引物组合物对待测样 品的包含目标区域的核酸样本进行PCR扩增，一步即能够实现目标区域核酸的富集，并且， PCR扩增产物即富集的目标区域核酸直接构成测序文库，进而无需额外的测序接头连接、连 接产物纯化的步骤，能够直接进行测序，成本低、效率高，并且测序结果准确、可靠，可重复 性好。
[0008] 根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种构建待测样品目标区域核酸测序文 库的方法。根据本发明的实施例，该方法包括；利用前面所述的引物组合物，对待测样品包 含目标区域的核酸样本进行PCR扩增，W便获得扩增产物，所述扩增产物构成所述待测样 品目标区域核酸测序文库。根据本发明的实施例，利用本发明的构建待测样品目标区域核 酸测序文库的方法，一步即能够实现待测样品目标区域核酸的富集及目标区域核酸测序文 库的构建，并且，操作简单，需时少，样本量和引物数量选择方面更加灵活，结合高通量芯片 实施该方法时，能够容易地实现同时对多样本多区域进行目标区域富集。此外，根据本发明 的实施例，利用该方法构建待测样品目标区域核酸测序文库，操作简单、需时少、成本低、效 率高，并且获得的目标区域核酸测序文库，能够直接进行测序，测序结果准确、可靠，可重复 性好。此外，本发明的方法适于微量DNA样本尤其是纳升级样本的目标区域核酸富集和文 库构建。
[0009] 根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种确定待测样品目标区域核酸序列的 方法。根据本发明的实施例，该方法包括W下步骤：根据前面所述的构建待测样品目标区域 核酸测序文库的方法，构建待测样品的目标区域核酸测序文库；对所述待测样品的目标区 域核酸测序文库进行测序，W便获得测序结果；W及基于所述测序结果，确定待测样品目标 区域核酸的序列。发明人发现，利用本发明的方法能够方便地确定待测样品目标区域核酸 序列，并且操作简单，需时少，样本量和引物数量选择方面灵活，测序结果准确、可靠，可重 复性好。
[0010] 根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种同时确定多个待测样品的目标区域 核酸序列的方法。根据本发明的实施例，该方法包括W下步骤：针对所述多个待测样品中的 每一个，分别独立地根据前面所述的构建待测样品目标区域核酸测序文库的方法，构建待 测样品的目标区域核酸测序文库，其中，所述第二正向引物的第一核酸序列和第一测序接 头之间，和/或所述第二反向引物的第二核酸序列和第二测序接头之间，进一步包含标签 序列，且所述多个待测样品的标签序列相互不同，所述多个为至少2个；将所述多个待测样 品的目标区域核酸测序文库混合，W便获得混合文库；对所述混合文库进行测序，W便获得 测序结果，所述测序结果包括所述多个待测样品的目标区域核酸测序文库的序列和所述标 签序列；W及基于所述标签序列对所述多个待测样品的目标区域核酸测序文库的序列进行 区分，并确定所述多个待测样品的每一个的目标区域核酸序列。发明人发现，利用本发明的 方法能够同时确定多个待测样品的目标区域核酸序列，并且操作简单，需时少，样本量和引 物数量选择方面灵活，并且测序结果准确、可靠，可重复性好。
[0011] 根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种确定待测样品目标区域核酸序列的 系统。根据本发明的实施例，该系统包括：文库构建装置，所述文库构建装置中设置有前面 所述的引物组合物，用于根据前面所述的构建待测样品目标区域核酸测序文库的方法，构 建待测样品的目标区域核酸测序文库；第一测序装置，所述第一测序装置与所述文库构建 装置相连，用于对所述待测样品的目标区域核酸测序文库进行测序，W便获得测序结果；W 及第一核酸序列确定装置，所述第一核酸序列确定装置与所述第一测序装置相连，用于基 于所述测序结果，确定待测样品目标区域核酸的序列。根据本发明的实施例，利用本发明的 系统，能够方便、快捷地确定待测样品目标区域核酸序列，并且样本量和引物数量选择方面 灵活，测序结果准确、可靠，可重复性好。
[0012] 根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种同时确定多个待测样品的目标区域 核酸序列的系统。根据本发明的实施例，该系统包括；文库构建及混合装置，所述文库构建 及混合装置用于针对所述多个待测样品中的每一个，分别独立地根据前面所述的构建待测 样品目标区域核酸测序文库的方法，构建待测样品的目标区域核酸测序文库，并将所述多 个待测样品的目标区域核酸测序文库混合，W便获得混合文库，其中，所述第二正向引物的 第一核酸序列和第一测序接头之间，和/或所述第二反向引物的第二核酸序列和第二测序 接头之间，进一步包含标签序列，所述多个待测样品的标签序列相互不同，所述多个为至少 2个；第二测序装置，所述第二测序装置与所述文库构建及混合装置相连，用于对所述混合 文库进行测序，W便获得测序结果，其中所述测序结果包括所述多个待测样品的目标区域 核酸测序文库的序列和所述标签序列；W及第二核酸序列确定装置，所述第二核酸确定装 置与所述第二测序装置相连，用于基于所述标签序列对所述多个待测样品的目标区域测序 文库的核酸序列进行区分，并确定所述多个待测样品的每一个的目标区域核酸序列。根据 本发明的实施例，利用本发明的方法能够同时确定多个待测样品的目标区域核酸序列，样 本量和引物数量选择方面灵活，并且操作简单，需时少，测序结果准确、可靠，可重复性好。
[0013] 此外，需要说明的是，本发明通过优化引物设计、PCR反应体系和PCR热循环程序， 采用的是一次PCR的方式，可W在单管W及高通量芯片上实现目标区域富集，无需另外的 加接头操作，也省去了两步PCR步骤中间的纯化，更重要的是可W多样本多区域进行捕获， 捕获之后只需要一步纯化就可W进行高通量测序，与现有技术的两次PCR完成建库的方法 相比，步骤更少，样本量和引物数量选择方面更加灵活。
[0014] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变 得明显，或通过本发明的实践了解到。
【附图说明】
[0015] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变 得明显和容易理解，其中：
[0016] 图1显示了根据本发明一个实施例的引物组合物的第一正向引物、第一反向引 物、第二正向引物和第二反向引物的结构示意图；
[0017] 图2显示了根据本发明一个实施例的确定待测样品目标区域核酸序列的方法的 流程示意图；
[0018] 图3显示了根据本发明一个实施例的同时确定多个待测样品的目标区域核酸序 列的方法的流程示意图；
[0019] 图4显示了根据本发明一个实施例的确定待测样品目标区域核酸序列的系统的 结构示意图；
[0020] 图5显示了根据本发明一个实施例的同时确定多个待测样品的目标区域核酸序 列的系统的结构示意图；
[002。 图6显示了根据本发明一个实施例，63个SNP位点的内外引物同时使用的电泳检 测结果。
[002引图7显示了根据本发明一个实施例，24个样本的41个SNP位点检测的覆盖度睛 况。
[002引图8显示了根据本发明一个实施例，24个样本的41个SNP位点检测的捕获特异性 结果。
【具体实施方式】
[0024] 下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅