用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0025] 需要说明的是，术语"第一"、"第二"仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相 对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有"第一"、"第二"的特征可 W明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说 明，"多个"的含义是两个或两个W上。
[002引引物组合物
[0027] 根据本发明的一个方面，本发明提供了一种引物组合物。根据本发明的实施例，该 引物组合物包含；第一引物组和第二引物组。具体地，参照图1，所述第一引物组包含第一 正向引物和第一反向引物，其中，所述第一正向引物由目标区域特异性正向引物和第一核 酸序列构成，所述第一核酸序列位于所述目标区域特异性正向引物的5'端，所述第一反向 引物由目标区域特异性反向引物和第二核酸序列构成，所述第二核酸序列位于所述目标区 域特异性反向引物的5'端，所述第一核酸序列和所述第二核酸序列均为公共序列，且所述 第一核酸序列和所述第二核酸序列不同。所述第二引物组包含第二正向引物和第二反向引 物，其中，所述第二正向引物包含第一核酸序列和第一测序接头，所述第一测序接头位于所 述第一核酸序列的5'端，所述第二反向引物包含第二核酸序列和第二测序接头，所述第二 测序接头位于所述第二核酸序列的5'端。根据本发明的实施例，利用本发明的引物组合物 对待测样品的包含目标区域的核酸样本进行PCR扩增，一步即能够实现目标区域核酸的富 集，并且，PCR扩增产物即富集的目标区域核酸直接构成测序文库，进而无需额外的测序接 头连接、连接产物纯化的步骤，能够直接进行测序，成本低、效率高，并且测序结果准确、可 靠，可重复性好。
[002引根据本发明的实施例，所述目标区域特异性正向引物和所述目标区域特异性反向 引物的长度均为18-25nt。由此，引物特异性高，扩增效果好。
[0029] 根据本发明的实施例，所述第一核酸序列为；5' -ACACTGACGACATGGTTCTACA-3'（SE Q ID N0;1)，所述第二核酸序列为；5' -TACGGTAGCAGAGACTTGGTCT-3'（SEQ ID N0;2)。
[0030] 根据本发明的实施例，所述第二正向引物的第一核酸序列和第一测序接头之间， 和/或所述第二反向引物的第二核酸序列和第二测序接头之间，进一步包含标签序列。由 此，能够在进行PCR扩增后，将多个样本的PCR产物进行混合测序，进而基于标签序列的不 同，对各序列的样本来源进行区分。
[0031] 根据本发明的一些实施例，所述标签序列的长度为6-1 Int。
[0032] 根据本发明的一些实施例，所述第一测序接头和所述第二测序接头分别为 11 lumina测序平台的P5测序接头和P7测序接头。其中，根据本发明的一些具体示例，当所 述第一测序接头和所述第二测序接头分别为Illumina测序平台的P5测序接头和P7测序 接头时，在所述标签序列和所述第一测序接头P5之间进一步包含长度为4nt的第Η核酸序 列，优选所述第Η核酸序列为；5' -ACAC-3'。由此，能够显著提高测序成功率，且测序结果 准确、可靠，测序效率高。
[0033] 根据本发明的另一些实施例，所述第一测序接头和所述第二测序接头分别为Ion Torrent测序平台的A测序接头和P测序接头。
[0034] 根据本发明的一个具体示例，所述目标区域W及所述目标区域对应的目标区域特 异性正/反向引物序列，如下表所示：
[0035]
[0036]
[0037] 用途
[0038] 根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种构建待测样品目标区域核酸测序文 库的方法。根据本发明的实施例，该方法包括；利用前面所述的引物组合物，对待测样品包 含目标区域的核酸样本进行PCR扩增，W便获得扩增产物，所述扩增产物构成所述待测样 品目标区域核酸测序文库。
[0039] 根据本发明的实施例，所述第一引物组与所述第二引物组的终浓度比为1 ;6-10， 优选1 ;8。由此，PCR扩增效果好，扩增产物直接用于测序后，测序效率高、结果准确。
[0040] 根据本发明的实施例，按照lOOnl反应体系计算，所述PCR扩增的反应体系包含： lOnl Sng/μ 1 ~20ng/ul 的模板DNA ;50nl 2X PCR master mix ;10nl 4μΜ 的第二正向引 物；1化1 4μΜ的第二反向引物；1化1 500nM第一正向引物；1化1 500nM第一反向引物。由 此，PCR扩增效果好，扩增产物直接用于测序后，测序效率高、结果准确。
[0041] 根据本发明的实施例，所述PCR扩增的反应程序为：
[0042]
[004引由此，PCR扩增效果化效率高，扩增产物能够直接用于测序。
[0044] 根据本发明的一些具体示例，本发明的构建待测样品目标区域核酸测序文库的方 法还可W包括W下步骤：
[0045] (1)针对每一个目标区域，均设计适用于该目标区域核酸扩增的目标区域特异性 正反向引物，并分别在其5'端添加公共序列：第一核酸序列和第二核酸序列，进行合成，W 便获得第一正向引物和第一反向引物，即第一引物组（在本文中有时也称为"内引物"）。
[0046] (2)合成包含第一核酸序列和第一测序接头的第二正向引物，W及包含第二核酸 序列和第二测序接头的第二反向引物，W便获得第二引物组（在本文中有时也称为"外引 物"）。
[0047] (3)使用第一引物组进行PCR扩增W及凝胶电泳检测，W验证第一引物组是否符 合要求，其中W是否能扩增出符合设计大小的单一条带为判定标准。经验证合格后，将第一 引物组和第二引物组按照终浓度比1 ;6-10,优选1 ;8混合，进行预PCR反应及凝胶电泳检 巧1|，W确定是否能够对目标区域进行有效、特异性的扩增。
[0048] (4)将待测基因组DNA样本进行稀释（一般稀释至long/ μ L)。
[0049] (5)通过与芯片配套的微量加样仪器，将经过预PCR验证合格的第一引物组和第 二引物组，W及样本和PCR反应试剂加样至芯片中，并进行相应的PCR反应。其中加样前， 先将第一引物组和一部分PCR反应试剂混合在一起，称为检测位点试剂预混液；而将样本、 该样本唯一对应的带有标签序列的第二引物组W及另一部分PCR反应试剂混在一起，称为 样本预混液。加样时，首先在芯片上的每个微孔中都加上样本预混液，此步骤可W将芯片 分成若干个区域，并在每一个已有样本预混液的微孔中再加入其对应的检测位点试剂预混 液。由此，每一个微孔里都有一对内引物、一对带有样本对应的标签序列的外引物、样本和 PCR试剂，即形成有完整的PCR反应体系，进而待PCR结束后，通过将芯片倒置即可容易地将 PCR产物混合离必回收到离必管中。
[0050] (6)然后，将回收的各样本混合的PCR产物，进行一定比例（0. 8-1倍）的Ampure XP磁珠纯化，纯化产物即为核酸文库。
[0051] (7)将上述构建好的核酸文库进行文库质量检测，可W使用例如 Agilent2100Bioanalyzer 或 Caliper Bioanalyzer， W 及 ABI StepOnerPlus Real-Time PCR System进行质量浓度、片段大小分布和摩尔浓度的检测。经检测合格后，即可上机测 序。
[0052] 根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种确定待测样品目标区域核酸序列的 方法。根据本发明的实施例，参照图2,该方法包括W下步骤：
[0053] S101 ;构建待测样品的目标区域核酸测序文库
[0054] 根据前面所述的构建待测样品目标区域核酸测序文库的方法，构建待测样品的目 标区域核酸测序文库。
[005引 S102 ;对目标区域核酸测序文库进行测序
[0056] 对所述待测样品的目标区域核酸测序文库进行测序，W便获得测序结果。
[0057] 其中，根据本发明的实施例，测序接头应根据欲采用的测序平台进行选择。根据本 发明的一些实施例，当所述第一测序接头和所述第二测序接头分别为Illumina测序平台 的P5测序接头和P7测序接头时，利用Illumina测序平台进行所述测序。根据本发明的另 一些实施例，当所述第一测序接头和所述第二测序接头分别为Ion Torrent测序平台的A 测序接头和P测序接头时，利用Ion Torrent测序平台进行所述测序。由此，获得的PCR产 物即核酸文库能够直接用于测序，且测序结果准确、可靠，可重复性好。
[005引 S103 ;确定待测样品目标区域核酸序列
[0059] 基于所述测序结果，确定待测样品目标区域核酸的序列。
[0060] 发明人棍奇地发现，利用该方法确定待测样品目标区域核酸序列，操作简单，需时 少，样本量和引物数量选择灵活，能够容易地实现同时对多样本多区域进行目标区域富集， 且测序结果准确、可靠，可重复性好。
[0061] 根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种同时确定多个待测样品的目标区域 核酸序列的方法。发明人发现，利用该方法能够容易地实现同时对多样本多区域进行目标 区域富集及测序，且操作简单，需时少，测序结果准确、可靠，可重复性好。
[0062] 根据本发明的一些具体示例，参照图3，本发明的同时确定多个待测样品的目标区 域核酸序列的方法可W包括W下步骤：
[0063] S201 ;分别独立地构建多个待测样品中的每一个的目标区域核酸测序文库
[0064] 针对所述多个待测样品中的每一个，分别独立地根据前面所述的构建待测样品目 标区域核酸测序文库的方法，构建待测样品的目标区域核酸测序文库，其中，所述第二正向 引物的第一核酸序列和第一测序接头之间，和/或所述第二反向引物的第二核酸序列和第 二测序接头之间，进一步包含标签序列，且所述多个待测样品的标签序列相互不同，所述多 个为至少2个。
[0065] 根据本发明的实施例，于多孔板中同时对所述多