一种用于NOSLAP基因分型的ARMS-qPCR检测试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种用于N0SLAP基因分型的ARMS-qPCR检 测试剂盒，本发明还涉及一种N0SLAP基因分型ARMS-qPCR检测方法。
【背景技术】
[0002] 粹死是指自然发生、出乎意料的突然死亡，也叫急死，即看来貌似健康的人或病情 经治疗后已稳定或正在好转的患者，在很短时间发生意想不到的非创伤性死亡。中国必脏 性粹死年龄分布为18-80岁（均值43. 8岁），其中18-39岁的青年和40-59岁的中年粹死 比较常见（43%和39%)，而60-80岁老年粹死较少见（17. 9%)。男女比例为4.3 : 1。有 数据显示，我国每年死于必脏性粹死的人数多达55万。也就是说，每天至少有1000多人粹 死。而根据媒体报道，1998年北京室120转运救治的中青年粹死者80多名，但到了 2011年 送一数字上升为270多名（巩江等，2013)。
[0003] 粹死的原因很多，临床上W必血管疾病所引起的粹死最为常见而重要，称为必脏 性粹死。其中冠必病、急性必肌梗死患者最为多见。急性必肌梗死可W迅速出现休克、昏迷， W致粹死（潘俊宏，2013)。
[0004] 基因的缺陷是必脏性粹死最重要的原因。通过对15842名研究对象采取必电图检 查W及基因组关联分析后发现，Noslap基因的突变可W改变必脏肌肉的收缩时间即QT间 期，进而导致粹死危险上升（Arking et al.2006)。
[0005] Noslap位于第一号染色体的q23. 3,编码一个一氧化氮合成酶连接蛋白，连接一 氧化氮合成酶及其底物化ao et al. 2009)。近年来，有研究陆续报道此基因的变异体会影 响 QT 间期（Post et al.2007，Lehtinen et al.2008，Eijgelsheim et al.2009),会造成粹 死率提高（Raitakari et al.2009)。对于我们中国人来说，基因型为Noslap rsl0918859G/ A+AA型的人罹患粹死的风险远大于rsl0918859GG型的人（Huang et al. 2013)，因 此，Noslap rsl0918859位置不同的基因型是预测粹死风险的极好标志物，检测Noslap rsl0918859基因型对于提前预防粹死，提高疾病防护风险具有重要的意义。
[0006] 可用于Noslap rsl0918859分型的技术很多，包括如DNA直接测序法、杂交芯片 法、焦磯酸测序法W及变性高效液相色谱法等。其中，DNA测序法为基因分型的金标准，该方 法存在如下缺点；检测的灵敏度不高，只有大于15%的突变才能检测到；费时，操作复杂， 对操作人员要求高；非闭管操作，涉及PCR扩增后的操作，因此易被污染，造成结果的不理 想；通量太小，一次最多只能做24个，很难大规模开展。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题是针对技术现状提供一种灵敏度高、特异性强的用于 N0SLAP基因分型的ARMS-qPCR检测试剂盒。
[0008] 本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种N0SLAP基因分型的ARMS-qPCR检 测方法，该检测方法灵敏度高、特异性强，而且操作简单。
[0009] 本发明解决上述第一个技术问题所采用的技术方案为；一种用于N0SLAP基因分 型的ARMS-qPCR检测试剂盒，包括qPCR反应体系，所述qPCR反应体系包括qPCR混合反应 液、参照引物、ARMS引物和阳极对照样品；所述qPCR混合反应液包括PCR缓冲液、dNTP、 MgC!2、Tag酶、PCR下游引物和TaqMan探针；
[0010] 所述qPCR反应体系中，各组分的终浓度分别为；PCR缓冲液为IX ;dNTP为0. 1~ 1.5mM;MgCl2 为 0. 5 ~5mM;Tag 酶为 0. 05 ~0. lU/μ 1 ;PCR 下游引物为 0. 1~luM;TaqMan 探针为0. 1~1 μ Μ ;参照引物为0. 5 μ Μ ;ARMS引物为0. 5 μ Μ ;阳性对照样品为1~lOng/ μ 1。
[0011] 所述PCR下游引物的序列如NOSLAP-R所示；
[0012] 所述TaqMan探针的序列如NOSLAP-TaqMan所示；
[001引所述参照引物的序列如N0SLAP-C所示，能够扩增所有不同N0SLAP基因型；
[0014] 所述ARMS引物为两种上游引物中的任意一种，分别对应N0SLAP rsl0918859GG、 rsl0918859AA型基因型，送两种上游引物的序列如N0SLAP-F1、N0SLAP-F2所示；送两种 ARMS引物分别在3'末端与不同的基因型碱基匹配，同时在其3'末端倒数第2、3位增加一 个或者两个碱基错配，W增加其特异性；用于特异性扩增的N0SLAP rsl0918859位基因型 为 GG/AA/GA ;
[0015] 所述阳极对照样品分别为N0SLAP不同基因型碱基置换的质粒基因组DNA。
[0016] 其中，所述 Tag 酶为 Takara Tag 酶或 Goldstar Best Tag 酶。
[0017] 各引物序列如下：
[0018] N0SLAP-R ; 5 ' -CACACACACACACGCAATCC-3 '
[0019] NOSLAP-TaqMan ;5' -FAM-GGTTTCTGTG GTTTGCACAA-3'
[0020] N0SLAP-C ;5, -AGCTGGCTGA AGCCCATGTC-3'
[0021] N0SLAP-F1 ;5, -TCTAAAACTT TCTGAGGGGCG-3'
[0022] N0SLAP-F2 ;5, -TCTAAAACTT TCTGAGGGGCA-3'
[0023] 本发明解决上述第二个技术问题所采用的技术方案为；基于上述试剂盒的 N0SLAP基因分型ARMS-qPCR检测方法，该方法先是针对N0SLAP基因设计一对参照引物、 化qMan探针，针对rsl0918859位点的不同基因型设计ARMS引物，反应体系中加入qPCR混 合反应液，参照引物或者ARMS引物、TaqMan引物和待测模板DNA进行英光定量PCR的检测， 具体包括如下步骤：
[0024] (1)设计并筛选含有N0SLAP基因 rsl0918859位不同基因型通用的参照引物、 TaqMan探针及两种ARMS引物；
[002引 似从细胞体系或血液中提取到基因组DNA作为模板DNA ;
[0026] (3)进行实时英光定量PCR扩增，每个样本的检测分3管进行，每个管加入相同的 qPCR混合反应液，化qMan探针和模板DNA，每管分别加入参照引物和两种ARMS引物中的一 种，进行N0SLAP基因 rsl0918859位基因分型的qPCR检测；
[0027] (4)结果判读：
[002引参照引物管扩增曲线阳性，N0SLAP-F1管扩增曲线阳性，N0SLAP-F2管扩增曲线阴 性或者其与参照引物管的扩增曲线Δ CT > 10,该样本结果判定为rsl0918859GG基因型；
[0029] 参照引物管扩增曲线阳性，NOSLAP-Fl管扩增曲线阳性，N0SLAP-F2管扩增曲线阳 性，该样本结果判定为rsl0918859G/A基因型；
[0030] 参照引物管扩增曲线阳性，N0SLAP-F1管扩增曲线阴性或者其与参照引物管的扩 增曲线ACT > 10, N0SLAP-F2管扩增曲线阳性，该样本结果判定为rsl0918859AA基因型；
[0031] 参照引物管扩增曲线阴性，提示该样本提取失败，需要重新进行提取。
[0032] 所述步骤（2)中，模板DNA选自人体血液基因组DNA或者口腔黏膜脱落细胞或头 发。
[0033] 所述步骤（3)中，进行PCR扩增反应的条件为，95°C预变性2min，95°C变性15s， 60°C延伸lmin，46个循环。
[0034] 上述技术方案中所提及的qPCR的英文全名是Real-time如antitative PCR Detecting System。即实时英光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增英光检测 系统，简称qPCR。
[0035] 与现有技术相比，本发明的优点在于：
[0036] 本发明提供了一种N0SLAP基因分型的ARMS-qPCR检测试剂盒，W解决现有基因分 型检测技术中费时、程序繁琐W及易污染等问题。本试剂盒可W快速、准确、便宜、高通量给 N0SLAP基因进行分型，其灵敏度高，特异性强，适用于常见样本比如血液、口腔黏膜W及头 发等。
[0037] 本发明能够快速、低廉、准确，高通量地检测检测人体血液或者其他组织细胞中 N0SLAP基因不同的类型，对于分型技术而言，是目前性价比最好的方法。便于临床或者健康 检测大规模的推行。
[0038] 本发明所用的 ARMS (amplification refractoiy mutation system)即扩增阻碍突 变系统，用于对已知突变基因进行检测。该法通过设计两个5'端引物，一个与正常DNA互 补，一个与突变DNA互补，对于纯合性突变，分别加入送两种引物及3'端引物进行两个平行 PCR，吸有与突变DNA完互补的引物才可延伸并得到PCR扩增产物。如果错配位于引物的3' 端则导致PCR不能延伸，则称为ARMS。
[0039] ARMS检测的灵敏度依赖于ARMS引物的特异性W及反应条件如反应液中Mg化的 浓度，加不加 DMS0等的优化。为了增加引物的特异性，减少引物与祀向DNA有错配时的错 配延伸，可通过在引物3'端的第2、3个碱基引入另外一个或者两个错配碱基，使之与模板 之间形成多重错配W阻值错误延伸。
[0040] 本发明所用的探针为5'端FAM标记的化qMan探针，探针两端分别标记英光报告 基团（时和英光浑灭基团怕)。在探针完整时，即在随机状态和无 PCR产物杂交状态时，报 告基团发出的英光被浑灭基团吸收，检测不到英光的存在。在ARMS-qPCR扩增过程中，当特 异的PCR产物与化qMan探针发生杂交反应时，Goldstar Best Tag酶的5'端外切酶活性 也把化qMan探针的碱基逐个剪切，报告基团所释放出的英光就可W被内置到PCR仪中的英 光计检测到。PCR经过一个循环，英光信号也和目的片段一样，有一个同步指数扩增的过程， 英光信号的强弱就代表模板DNA拷贝数的多少。因此本发明是个很好的基因分型的工具。
[0041] 综合了 ARMS引物W及实时英光定量PCR的优点，与直接测序等基因分型的技术相 比较，本发明用于N0SLAP基因分型基因检测具有如下优势：
[0042] 1/特异性强；