肝癌基因检测方法、检测试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因检测领域，特别是涉及肝癌相关基因的检测试剂盒，该试剂盒在 肝癌诊断中的应用，W及使用该试剂盒进行肝癌相关基因检测的方法。
【背景技术】
[0002] 肝癌严重威胁着我国人民的生命健康。肝癌的诊断，尤其早期诊断是临床诊疗和 预后的关键。肝癌的治疗在过去20年来已取得很大的进展，外科手术切除及肝脏移植属于 "根治性"治疗，仍是肝癌治疗的首要选择。随着肝癌早期诊断水平的提高及肿瘤治疗生物 学概念的改变，肿瘤局部非手术治疗在肝癌治疗中的地位日益提高。经导管动脉内化疗栓 塞（TAC巧已成为不能切除肝癌治疗的首选方法，是中晚期肝癌治疗的重要手段。但目前肝 癌的化疗药物基本沿用其他肿瘤的治疗药物，针对性差，疗效不佳，而死亡的原因主要与其 高度转移特性有关，常常侵犯肝内血管而后全身转移而导致患者死亡。但导致肝癌转移的 分子机制不清楚，尤其决定肿瘤细胞转移的内在变异基因尚没有确定。而确定关键突变基 因将为患者的诊断、分型和祀向治疗奠定坚实基础。
[0003] 经数十年的肿瘤研究表明，肿瘤是遗传性疾病，是基因疾病，是基因组不稳定性疾 病。尤其基因组的结构异常，比如体细胞基因的蛋白编码区突变（包括单碱基突变、插入和 缺失、易位等）是肿瘤形成的重要机制之一。送些体细胞的基因突变既能引起癌基因的活 性增强，比如MYC和RAS基因等；也能够使抑癌基因的活性丧失，比如TP53和APC等。一般 认为，肿瘤的发生是一个包含多种遗传学损伤的多步骤过程。送种损伤可W导致细胞逃避 正常的生长控制，也可W激活某种生存机制的通路。研究发现，肿瘤形成至少需要4-5步的 遗传学突变，突变基因涉及约12类信号通路的失调。众多的证据表明，不同的基因突变与 患者临床特征、预后、治疗反应甚至治疗方法密切相关，比如EGFR和B-RAF发生突变，可W 选择相应的抑制剂进行祀向治疗，获得成功。目前，技术的飞速发展给我们深入研究肿瘤带 来了新的机遇，送些技术可W让我们从全基因组的水平全面理解肿瘤的发生发展的分子机 巧[|，可W更准确地发现更多的肿瘤致病基因，尤其突变基因，将为肿瘤诊断指标、分子分型 W及药物祀标的发现等奠定了很好的基础。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题之一是提供一种肝癌基因检测试剂盒，它可W准确、快 速地捕获肝癌关联基因。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明的肝癌基因检测试剂盒，包括与94个肝癌关联基因 的外显子区域和TERT基因的3个启动子区域相匹配的97个祀向探针。
[0006] 所述的肝癌关联基因为突变频率在4% W上、相同基因在3个W上不同群体出现 且小于等于 1〇化的基因。包括；ADAMT化3、ADCY2、AMPH、APC、AR、ARID1A、ARID1B、ARID2、 ATAD3B、ATM、AXIN1、AXIN2、BAZ2B、BRAF、BRCA2、B畑8、B畑9、BRE、C180RF34、CACNA1C、 CACNA2D4、CCNE1、CD册、CDKN2A、CLIP1、C0L11A1、C0L5A3、CPA2、CSMD3、CTNNB1、DCAF化2、 DISCI、D0CK7、DSE、ELMOl、EPS15、邸RFIl、FAM5C、GJAl、GNAS、GPR126、GX化τι、HDAC9、 HIST1H4B、IGFIR、IGSFIO、IGSF3、IRF2、ITPR2、JAK1、KEAP1、KRAS、LIPI、LRP1B、MLL3、MLL4、 MXRA5、N 阳化 2、OTOP1、PAM、PCDHl 5、PCDHA13、PCDHA7、PCMTD1、PDZRN4、PEG3、PIK3CA、PREX2、 PROKR2、PTEN、RAD IL、RNF43、R0B02、ROCK 1、RPS6KA3、SAMD化、SCN3A、SCN8A、沈NP5、化C1OA1、 SMAD4、SOS1、SPAG17、SYNJ2、TERT、TMEM170A、TMEM51、TP5 3、TT化2、UBR3、USP2 5、WWP1、ZIC3、 ZNF226〇
[0007] 所述的 TERT 基因的启动子区域为 c虹5 :1253287-1253843,1295104-1295162, 1295162-1300162。
[0008] 本发明要解决的技术问题之二是提供上述试剂盒在肝癌诊断中的应用。
[0009] 本发明要解决的技术问题之Η是提供使用上述试剂盒检测肝癌基因的方法，其步 骤包括：
[0010] 1)采集患者的肝脏组织样本，进行样本DNA抽提、纯化、质检；
[0011] 2)对样本DNA进行酶切、杂交、捕获、连接、洗脱、扩增，构建测序样本文库；捕获采 用权利要求1至4任一项所述的试剂盒；
[0012] 3)检测样本文库的浓度、大小和纯度；
[0013] 4)测序，数据分析，确定发生突变的基因及突变频率。
[0014] 步骤4)中的数据分析包括；测序结果mapping、单样本SNV分析、单样本Small InDel分析、样本间SNV差异分析、样本间Small InDel差异分析。
[0015] 较佳的，在步骤4)的数据分析之后，还可W对数据分析结果进行二次抽取分析， 对该肝癌病人的肝癌组织和癌旁组织存在的亚克隆群体进行分类及病理分级。分类及病理 分级的方法是：将每个样本参加测序的基因组总量与100个细胞的预测基因组量A比较，推 巧Ij 100个细胞应有的测序数据量a ;从总的测序数据中随机抽取10次a,将该10次抽调出 来的数据a做相关性分析，再将最终得到的突变基因突变频率做聚类分析，得出组织中可 能存在的克隆群体及其所占比例。
[0016] 本发明针对肝癌相关基因开发用于祀向捕获基因测序的试剂盒，并将其应用在肝 癌的诊断上，使肝癌的临床诊断更加准确、快速，从而有助于临床医生更好地选择肝癌的个 性化治疗方案。
【附图说明】
[0017] 图1是本发明的肝癌基因检测试剂盒的设计及应用流程图。
[001引图2~图5是本发明实施例1的测序样本文库的浓度及片段大小的质控结果。
[0019] 图6是本发明实施例1的样本富集统计图，覆盖深度都在5000倍W上。
【具体实施方式】
[0020] W下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件，即Agilent公司和Illumina公司指定的操作流程和 条件。
[0021] 实施例1两例肝癌病人的祀向捕获测序
[0022] 测序方法包括W下步骤：
[0023] 1.采集两例肝癌手术病人的癌旁组织和癌组织共4个组织样本ΤΙ、PI、Τ2、P2灯 代表癌组织，P代表癌旁正常组织，-8(TC冰箱保存，样本来源于南京市江苏省人民医院肝胆 外科），进行组织DNA抽提。本实验采用DNeasy Blood&Tissue Kit(Qiagen，69506)试剂 盒，并且根据生产厂商提供的标准操作流程，进行样本的DM抽提及纯化。DM经Nano化op? ND-1000分光光度计和0. 8 %琼脂糖凝胶电泳质检合格后备用，DM质检结果见表1。
[0024] 表1两对样本灯1/PUT2/P2)中抽提DNA后的质量评价结果
[00 巧]
[002引 2.按照 Agilent 公司 HaloPlex Target Enrichment System for IIlumina 化ired-End Sequencing Library对基因组DNA进行酶切、杂交、捕获、连接、洗脱、扩增等步 骤，完成测序样本文库构建。
[0027] 肝癌关联候选基因的筛选方法如下：
[0028] 第一步，整合现有针对肝细胞癌病例样本测序的文献和报道，对每篇文献中提及 的体细胞突变基因进行整合；
[0029] 第二步，归总，将各个文献中整合出的优先筛选基因整合到一起，分别将基因的突 变频数和样本数叠加后统计突变频率，再删除重复基因，将送批基因作为优先候选基因；
[0030] 第Η步，将对各个文献中单独整合的其他基因序列进行再次整合。首先对送些基 因的突变频数进行重新统计，方法同第二步，额外添加两个筛选条件：1、同一基因出现在Η 个W上样本群体中，即有Η个W上不同研究小组都检测到该突变基因；2、在第1个