一种具有强催化活性的多巴脱羧酶同源物及其制备与应用的制作方法

本发明涉及一种具有强催化活性的多巴脱羧酶同源物(isoform)及其制备与应用，属于分子生物学技术领域。

背景技术：

动物体在经过自然选择持久的压力作用后，逐渐形成了高效的、可以抵御外界病原体对机体本身危害的免疫系统，此系统结构较为复杂，内部联系也十分巧妙。免疫的过程即是动物体借助自身免疫系统的作用来抵御外界病原微生物对机体的入侵，从而达到有效的保护自己，避免各种疾病发生的效果。动物体的免疫系统在与病原体不断抗争的过程中逐渐进化出了较复杂的先天性免疫和获得性免疫两套抗侵染机制。二者各自具有不同的功能和作用，其中先天免疫的反应策略是识别出微生物中普遍存在的具有高保守的共有结构——病原体相关的分子模式，而先天免疫系统中的模式识别受体则是能够识别出这些病原体相关的分子模式的受体。

虽然近年来有部分学者研究发现无脊椎动物在一定范围内具备脊椎动物所特有的适应性免疫现象。但是，目前一般情况下认为，无脊椎动物机体的防御仅依赖于非特异性的先天免疫。一直以来免疫学研究的根本问题就是能否识别出“自己”与“异己”，因此免疫系统的基本功能也是如此。在无脊椎动物中先天免疫的异己识别更为重要。在无脊椎动物中，用来抵御病原体感染时的先天免疫系统主要包括物理防线、细胞免疫和体液免疫三部分。酚氧化酶原活化系统介导的无脊椎动物的体液免疫中的黑化作用是宿主防御病原体入侵的重要免疫形式，在发挥功能的过程中，酚氧化酶原被一系列水解级联反应激活为酚氧化酶，这种酶可以将多巴胺转化为醌类物质，进一步发挥黑化作用。其中，多巴胺是由多巴脱羧酶催化多巴生成的，因此，低等生物体内多巴脱羧酶的活力，直接影响黑化反应的进行。

多巴脱羧酶最先发现于哺乳动物之中，也称芳香族左旋氨基酸脱羧酶，最初发现其分布在哺乳动物的肾脏，深入研究后发现这种酶可以促进肾上腺素的合成。目前研究结果显示：多巴脱羧酶可以参与多种生物学机制，在哺乳动物中参与黑色素的合成，同时，缺乏多巴脱羧酶可以导致发育迟缓、认知障碍、精神紊乱等疾病的发生；在昆虫中参与生长发育以及表皮形成的过程，而且，缺乏多巴脱羧酶会导致体表外骨骼松软无法抵御外界物理及病原的攻击。此外，在植物中参与芳香生物碱的合成。同时，多巴脱羧酶也是合成某些氨基酸过程中的限速酶。

在人体代谢方面，多巴脱羧酶可以通过催化左旋多巴和左旋5-羟色氨酸脱羧，之后合成具有重要生理活性的神经递质多巴胺和5-羟色胺，指导神经系统的信号传递。而且，人体大脑内5-羟色胺含量降低可以导致抑郁、焦虑等问题出现，大脑中多巴胺合成减少还可导致帕金森症的发生。因此，多巴脱羧酶在人体大脑中活力的高低，会影响到人体大脑的健康。因此，开发一个具有良好催化活性的多巴脱羧酶，可以为人体因为大脑中多巴胺、5-羟色胺含量降低而出现的抑郁、焦虑等疾病，甚至帕金森症提供一个潜在的治疗药物。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于提供一种来源于克氏原螯虾(procambarusclarkii)(又称淡水小龙虾)具有强催化活性的多巴脱羧酶同源物(isoform)。本发明的另一目的在于提供所述多巴脱羧酶同源物的制备方法。本发明的再一目的在于提供所述多巴脱羧酶同源物的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种来源于克氏原螯虾新的具有强催化活性的多巴脱羧酶同源物，命名为pc-ddcisoform(简写为pc-ddci)蛋白质，其氨基酸序列如seqidno.1所示，具有481个氨基酸残基。

进一步地，克氏原螯虾体内，所述的多巴脱羧酶同源物基因(命名为pc-ddc-i基因)的开放阅读框对应的核苷酸序列如seqidno.2所示，长1446bp。

一种上述多巴脱羧酶同源物的制备方法，包括如下步骤：

(1)以提取的克氏原螯虾总rna作为模板，以5’-ctactgcaaaagcgggag-3’作为反转录的后引物进行反转录pcr得到cdna。

(2)以步骤(1)获得的cdna作为模板进行pcr扩增获得含上述多巴脱羧酶同源物编码序列(开放阅读框序列)的核苷酸片段，pcr扩增引物如下：

f：5′-nnatggacgccgatcagttcag-3′，

r：5′-nnctactgcaaaagcgggag-3′，

其中，nn由保护碱基和限制性内切酶酶切位点组成，n表示任意碱基，n为自然数，可根据表达载体进行相应的调整。

(3)步骤(2)的扩增产物与原核表达载体通过酶切、连接、转化，构建可表达重组多巴脱羧酶同源物的大肠杆菌工程菌。

(4)步骤(3)构建的大肠杆菌工程菌通过诱导培养，表达出重组多巴脱羧酶同源物。

本发明对多巴脱羧酶同源物在体外催化左旋多巴转化成多巴胺的活性进行了实验，对其在体外影响克氏原螯虾血淋巴中血细胞的包囊作用进行了实验，对其在体外影响小鼠脑组织中多巴胺的含量进行了实验，对其与常见病原菌进行了液体抑菌实验，对其对克氏原螯虾超氧化物歧化酶(sod)、过氧化氢酶(cat)活力的影响进行了实验，结果显示本发明的重组多巴脱羧酶同源物具有良好的催化多巴转化为多巴胺的活性，能够增强血细胞的包囊能力以及增加克氏原螯虾虾体组织的sod活性以及cat活力，并具有很好的抑菌作用。因此，本发明的多巴脱羧酶同源物的应用包括如下方面：在催化左旋多巴转化成多巴胺中的应用；在增强克氏原螯虾血细胞包囊能力中的应用；在增强克氏原螯虾体机体抗氧化能力中的应用；在制备治疗抑郁、焦虑或帕金森症的药物中的应用；在制备增强克氏原螯虾血细胞包囊能力的药物中的应用；在增强克氏原螯虾体机体抗氧化能力的药物中的应用；制备在制备抑菌剂中的应用。

一种药物，包含本发明的多巴脱羧酶同源物，所述药物为下述药物中的任一种：治疗抑郁、焦虑或帕金森症的药物；增强克氏原螯虾血细胞包囊能力的药物；增强克氏原螯虾体机体抗氧化能力的药物；抑菌剂。

本发明的优点和有益效果：本发明的多巴脱羧酶同源物具有强的体外催化多巴转化为多巴胺的活性，具有明显的增强克氏原螯虾血细胞包囊能力及机体抗氧化能力的作用，具有增加小鼠脑组织中多巴胺含量的作用，具有很好的抑菌作用。因此，在开发成为治疗人的抑郁、焦虑等疾病，以及帕金森症的药物方面，具有良好的应用前景。

附图说明

图1是sds-page检测克氏原螯虾重组多巴脱羧酶同源物(rpc-ddci)诱导表达与亲和纯化的结果图。泳道1是诱导前大肠杆菌的菌体总蛋白质，泳道2是iptg诱导后的大肠杆菌的菌体总蛋白质，泳道3是纯化后的rpc-ddci重蛋白质，泳道m是标准的蛋白质分子量。

图2是克氏原螯虾重组多巴脱羧酶同源物体外影响克氏原螯虾血细胞包囊活性的实验结果图。a为1×pbs孵育琼脂糖微球后，血细胞对微球的包囊情况，b为目的重组多巴脱羧酶rpc-ddci蛋白质孵育琼脂糖微球后，血细胞对微球的包囊情况，c组为bsa孵育琼脂糖微球后，血细胞对微球的包囊情况。

图3是重组克氏原螯虾多巴脱羧酶同源物(rpc-ddci)体外影响小鼠大脑组织多巴胺含量的实验结果图(图中**表示与对照组相比，差异极显著)。

图4是重组克氏原螯虾多巴脱羧酶同源物(rpc-ddci)增强活体克氏原螯虾组织匀浆液sod活力的实验结果图(图中*表示与1×pbs对照组相比，具有显著差异)。

图5是重组克氏原螯虾多巴脱羧酶同源物(rpc-ddci)增强活体克氏原螯虾组织匀浆液cat活力的实验结果图(图中**表示与1×pbs对照组相比，具有极显著差异)。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1重组克氏原螯虾多巴脱羧酶同源物的制备

(1)利用动物总rna提取试剂盒提取克氏原螯虾肝胰腺、鳃、肠3种等质量组织的混合组织样品的总rna，获得克氏原螯虾混合组织的总rna样品。

(2)以步骤(1)获得的克氏原螯虾总rna样品作为模板，以特异引物5’-ctactgcaaaagcgggag-3’作为反转录合成反应的后引物，利用一步法rt-pcr扩增试剂盒进行cdna的反转录合成，获得克氏原螯虾混合组织样品的cdna样品。

(3)设计扩增克氏原螯虾多巴脱羧酶同源物基因pc-ddc-i编码区表达片段(成熟肽)的前后引物pc-ddc-i-f和pc-ddc-i-r：

pc-ddc-i-f：5′-tactcagaattcatggacgccgatcagttcag-3′，

pc-ddc-i-r：5′-tactcactcgagctactgcaaaagcgggag-3′。

以步骤(2)中的克氏原螯虾混合组织的cdna样品作为模板，进行梯度pcr扩增反应，反应的程序为：98℃预变性5min，第一扩增梯度：98℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸60s，循环15圈；第二扩增梯度：98℃变性30s，57℃退火45s，72℃延伸60s，循环15圈；第三扩增梯度：98℃变性30s，61℃退火45s，72℃延伸60s，循环15圈；后延伸10min，获得pcr扩增反应产物。

(4)将步骤(3)获得的pcr扩增反应产物进行回收以及纯化，之后进行ecorⅰ核酸内切酶和xhoⅰ核酸内切酶的双酶切处理，并且与经过ecorⅰ核酸内切酶和xhoⅰ核酸内切酶双酶切处理的大肠杆菌pet-28-a质粒载体连接，转化大肠杆菌bl21(de3)表达菌株感受态细胞之后，利用pc-ddc-i-f和pc-ddc-i-r引物进行菌落pcr反应筛选目的基因的阳性表达菌株，将筛选得到的阳性克隆子送测序公司进行目的基因的序列测定，获得克氏原螯虾多巴脱羧酶同源物基因pc-ddc-i的开放阅读框对应的核苷酸序列(如seqidno.2)。

(5)将步骤(4)获得的目的基因阳性表达菌株进行iptg浓度梯度复合温度梯度式的诱导表达，方法如下：将目的基因阳性表达菌株接入到装有200ml液体lb培养基的1000ml三角瓶中，在37℃、180rpm条件下，摇床避光转培养4h，之后，加入终浓度为0.2mm的iptg，在28℃、180rpm条件下继续摇床避光培养4h，之后，调整iptg终浓度为0.4mm，28℃、180rpm条件下摇床避光继续培养4h，之后，调整iptg终浓度为0.8mm，37℃、180rpm条件下摇床避光继续培养4h，之后，6000rpm条件下离心收集菌体。

(6)将步骤(5)获得的菌体进行不同低温复合超声波的方式进行菌体破碎，首先对菌体进行-20℃条件下的冷冻处理60min，之后在-40℃条件下的冷冻处理60min，之后，利用超声波破碎仪进行细菌菌体破碎60min，然后，再次对菌体进行-20℃条件下的冷冻处理60min，之后，在10000rpm条件下离心收集破碎后的沉淀。

(7)将步骤(6)获得的破碎后的沉淀，利用20ml变性液(0.15mtris-hcl，5mmdtt，6m脲，ph8.0)，在37℃、180rpm条件下摇床避光震荡3h，之后，在12000rpm条件下离心收集上清液，并且，利用截留能力为3.5kda的透析袋进行过夜12h、4℃低温透析处理，透析液配方为0.15mtris-hcl，10mmcysteins，ph8.0。

(8)将步骤(7)透析完毕的液体，进行10000rpm条件下的离心处理，并且收集上清液，即为目的重组蛋白质的变性-复性液，并且，利用预装5ml的his-tag凝胶柱进行纯化，首先，用30ml1×pbs缓冲液冲洗his-tag凝胶柱1次，之后，将获得的目的重组蛋白质的变性-复性液20ml缓慢流通his-tag凝胶柱3次，再用10ml洗脱液(500mm咪唑，20mmtris-hcl，ph8.0)洗脱柱子，并且收集洗脱液，利用截留能力为3.5kda的透析袋在1×pbs缓冲液中进行4℃低温12h透析处理，次日，利用聚乙二醇8000进行浓缩处理，使目的重组蛋白rpc-ddci的终浓度为200μg·ml^-1。

重组克氏原螯虾多巴脱羧酶同源物rpc-ddci的诱导表达与亲和纯化结果见图1。图1显示，与诱导前大肠杆菌菌体总蛋白相比较，iptg诱导之后，重组蛋白质有明显的表达量；而且，亲和纯化之后获得了组分单一、浓度较高的目的rpc-ddci重组蛋白质，泳道3的蛋白质条带的位置接近标准蛋白质分子量的66.2kda条带，与理论预期的58.5kda相一致，说明表达正确。

实施例2重组克氏原螯虾多巴脱羧酶同源物rpc-ddci的体外催化活性的实验

将实施例1获得的浓度为200μg·ml^-1的目的重组蛋白rpc-ddci在体外进行催化左旋多巴转化为多巴胺的实验。首先，制作多巴胺浓度的标准曲线：配制一组浓度为1000、333.33、111.11、37.04、12.35pg/ml的多巴胺标准溶液，利用酶标仪450nm波长进行吸光度的测定。之后，以吸光度的数值作为横坐标，浓度数值的对数作为纵坐标，作吸光度对多巴胺浓度的标准曲线。之后，进行目的重组蛋白rpc-ddci催化左旋多巴的实验：①取左旋多巴0.591g、磷酸吡哆醛0.0106g，溶于100mlpbs中。②用盐酸调节ph至6.0左右，直到左旋多巴完全溶解，作为母液。③取500μl母液加入到1.5ml灭菌的离心管中，再加入50μl的rpc-ddci重组蛋白溶液，对照组加50μl1×pbs缓冲液。之后，37℃反应1h，在冰上冷却10min来终止反应。④利用酶标仪450nm波长进行吸光度的测定。之后，利用多巴胺标准曲线对应的方程，计算反应液中生成的多巴胺的量。并且，实验结果与zhouetal(2011)发表的论文中关于栉孔扇贝多巴脱羧酶体外催化能力进行比较分析(zhouz，etal，adopadecarboxylasemodulatingtheimmuneresponseofscallopchlamysfarreri.plosone.2011；6(4):e18596.)。

实验结果显示：测得重组蛋白质rpc-ddci的体外催化反应液的吸光度为0.432，计算出反应液中多巴胺浓度为1140pg/ml。也就是50μlrpc-ddci重组蛋白溶液在1h内催化左旋多巴生成多巴胺的量为627pg，即1mg重组蛋白在1h内能催化35ng多巴胺生成。而zhouetal(2011)公开发表的论文中，栉孔扇贝多巴脱羧酶体外催化能力为1.65±0.22ng·h^-1·mg^-1，即1mg栉孔扇贝多巴脱羧酶重组蛋白在1h内能够催化1.65ng多巴胺的生成。本发明中的重组克氏原螯虾多巴脱羧酶同源物rpc-ddci的催化能力为：1mg重组蛋白在1h内能够催化35ng多巴胺生成，其催化效果远远优于栉孔扇贝的多巴脱羧酶。

实施例3重组克氏原螯虾多巴脱羧酶同源物rpc-ddci的体外促进血细胞包囊活性的实验

将实施例1获得的浓度为200μg·ml^-1的目的重组蛋白rpc-ddci在体外进行影响克氏原螯虾血细胞包囊活性的检测实验。第一步，进行琼脂糖微球的处理：从his-tag凝胶柱中吸取200μl琼脂糖微球至1.5ml灭菌的离心管中，再加入1ml1×pbs，之后，上下颠倒或旋涡震荡洗涤5-10min，然后，1500rpm条件下离心1min。重复4次上述步骤。第二步，进行琼脂糖微球的稀释：用1ml1×pbs重新悬起处理过的琼脂糖微球，取一滴重旋后的微球液体置于载玻片上，在40倍显微镜下观察微球浓度，若微球浓度过高则再用1×pbs进行稀释，直到显微镜视野范围内微球不叠加在一起即可。第三步，进行重组蛋白质溶液与微球溶液的孵育：取3个1.5ml灭菌的离心管，每个离心管中加入稀释后的微球溶液100μl，再分别加入400μl的rpc-ddci重组蛋白溶液、牛血清白蛋白(bsa)溶液(200μg·ml^-1)或1×pbs缓冲液，室温下孵育3h。第四步，进行血淋巴的收集：在5ml无菌注射器中吸入1ml抗凝剂，之后分别从3只活的克氏原螯虾的第二腹节共计抽取血淋巴1ml左右，使血淋巴与抗凝剂比例大约为1:1。第五步，血淋巴与上述第三步孵育液的孵育：分别取第三步中孵育好的微球100μl加入到1.5ml灭菌的离心管中，再分别加入第四步采集的血淋巴与抗凝剂的混合液400μl，4℃条件下孵育30min之后，分别取一滴孵育液置于载玻片上，盖上盖玻片，在显微镜下观察微球及克氏原螯虾血淋巴中血细胞的作用情况。

实验结果(图2)显示：与1×pbs缓冲液以及bsa溶液相比较，加入目的重组蛋白rpc-ddci蛋白质溶液之后，克氏原螯虾血淋巴中血细胞对琼脂糖微球有明显的包囊作用。说明rpc-ddci具有增强宿主细胞对外源微小颗粒型侵染物质的包裹作用，即在增强宿主的抗细菌、抗病毒能力方面有着重要的应用价值。

实施例4重组克氏原螯虾多巴脱羧酶同源物rpc-ddci体外增加小鼠大脑组织多巴胺含量的实验

将实施例1获得的浓度为200μg·ml^-1的目的重组蛋白rpc-ddc在体外进行影响小鼠脑组织匀浆液多巴胺含量的实验。第一步，制作多巴胺浓度的标准曲线：配制一组浓度为1000、333.33、111.11、37.04、12.35pg/ml的多巴胺标准溶液，利用酶标仪450nm波长进行吸光度的测定。之后，以吸光度的数值作为横坐标，浓度数值的对数作为纵坐标，作吸光度对多巴胺浓度的标准曲线。第二步，制备小鼠大脑组织匀浆液：在超净工作台中，取3只体重在25g左右的小白鼠，采用脊椎脱臼法处死，之后，解剖各取脑组织1g，混合后转移至干净的5ml匀浆器中，再加入1ml1×pbs在冰浴上进行快速匀浆，最后将匀浆液转移到1.5ml的灭菌的离心管中，置于冰浴上待用。第三步，进行目的重组多巴脱羧酶同源物rpc-ddci蛋白质对小鼠大脑组织匀浆液中多巴胺含量的影响作用的检测：取100μl的rpc-ddci重组蛋白质溶液置于1.5ml的灭菌的离心管中，再加入400μl制备的小鼠大脑组织匀浆液，混合均匀之后，在37℃条件下反应1h，最后在冰上冷却10min来终止反应，对照组分别为什么也不加入的正常小鼠大脑组织匀浆液、加入100μl1×pbs缓冲液的小鼠大脑组织匀浆液、加入200μg·ml^-1的牛血清白蛋白(bsa)溶液的小鼠大脑组织匀浆液。第四步，利用酶标仪450nm波长进行吸光度的测定：实验组与对照组的反应混合液，各取100μl置于一次性酶标板的孔中，利用酶标仪450nm波长进行吸光度的测定。之后，利用多巴胺标准曲线对应的方程，计算反应液中生成的多巴胺的量。

实验结果(图3)显示：与1×pbs缓冲液以及bsa溶液相比较，加入目的重组多巴脱羧酶同源物rpc-ddci蛋白质溶液之后，小鼠大脑组织匀浆液中的多巴胺含量明显增加，而且，差异极显著，说明目的重组多巴脱羧酶同源物rpc-ddci蛋白质具有较强的催化脑组织中左旋多巴转化成多巴胺的能力。

实施例5重组克氏原螯虾多巴脱羧酶同源物rpc-ddci体外抑制细菌增殖的实验

将实施例1获得的浓度为200μg·ml^-1的目的重组蛋白rpc-ddci溶液进行常见病原菌的液体抑菌实验，首先金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、藤黄微球菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、白色念珠菌、毕赤酵母作为病原菌进行常规过夜培养，次日，将利用1×pbs缓冲液进行2倍梯度稀释的100μl的重组rpc-ddci蛋白质溶液分别与100μl目标病原菌菌液混合后，置于清洁的一次性96孔酶标板的点样孔之中进行孵育，同时，bsa蛋白作为对照组，并且，每一个点样孔中再加入100μl液体lb培养基(1％胰蛋白胨，1％酵母提取物，质量体积比为0.5％的nacl，ph为7.0)。之后，28℃条件下，静置培养12h之后，期间，利用分光光度计540nm波长测定各个细菌混合液中病原菌的生长情况，确定目的重组蛋白质对各种病原菌的最小抑菌浓度。

实验结果显示：重组蛋白rpc-ddci可以有效地抑制金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌、哈维氏弧菌、绿脓杆菌的生长繁殖，对于大肠杆菌、毕赤酵母、白色念珠菌的生长繁殖也有一定程度的抑制作用(表1)。

表1重组蛋白rpc-ddci对不同病原菌的最小抑菌浓度

实施例6重组克氏原螯虾多巴脱羧酶同源物rpc-ddci增强活体克氏原螯虾的组织匀浆液中超氧化物歧化酶(sod)、过氧化氢酶(cat)活力的实验

购买60只体重在15-20g的活力较好的克氏原螯虾，并且随机分成3组(目的重组蛋白组、1×pbs组、bsa组)，每组20只，在实验室用蒸馏水预养两周左右之后进行以下实验，期间每天喂养克氏原螯虾人工饲料2次。将实施例1获得的浓度为200μg·ml^-1的目的重组蛋白rpc-ddci溶液、1×pbs缓冲液、浓度为200μg·ml^-1的牛血清白蛋白(bsa)溶液分别从克氏原螯虾腹部第三体节注射进入三组虾的虾体之内，48h之后分别从三组克氏原螯虾中筛选活的个体，每组选择5只，并且利用洁净的剪刀与镊子摘取克氏原螯虾腹部第一体节至第五体节的虾体组织(除去虾体外壳)，每组内部进行组织混合之后利用匀浆器进行匀浆处理，室温条件下6000rpm低速离心之后，取上清液，即为虾体组织匀浆液。之后，利用超氧化物歧化酶(sod)活力测定试剂盒、过氧化氢酶(cat)活力测定试剂盒分别测定每组克氏原螯虾的虾体组织匀浆液的sod、cat活力。全部实验重复三次，并且进行统计分析差异的显著性。

实验结果显示：与1×pbs缓冲液组、浓度为200μg·ml^-1的牛血清白蛋白(bsa)溶液组相比较，目的重组蛋白rpc-ddci注射活体克氏原螯虾48h之后，能够明显增加克氏原螯虾虾体组织的sod活性以及cat活力；而且，与1×pbs缓冲液组相比较，目的重组蛋白rpc-ddci组的sod活力的增加具有显著差异，cat活力的增加具有极显著差异。因为sod、cat都是生物体重要的抗氧化酶系成员，因此，说明目的重组蛋白rpc-ddci具有增强宿主机体抗氧化作用的功能。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>内蒙古科技大学

<120>一种具有强催化活性的多巴脱羧酶同源物及其制备与应用

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

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