一种猪瘟病毒抗体检测ELISA诊断试剂盒的制作方法

本发明属于基因工程
技术领域：
，具体涉及一种稳定表达猪瘟e0蛋白的重组细胞系以及猪瘟e0蛋白抗体检测elisa鉴别诊断试剂盒。
背景技术：
：猪瘟(classicalswinefever，csf)是由猪瘟病毒(classicalswinefevervirus，csfv)引起的猪和野猪的一种高传染性疾病。通过严格的净化措施本病已在世界部分养猪国家得以净化，如美国、澳大利亚、加拿大、爱尔兰、新西兰和瑞士等国家已宣布消灭了猪瘟，但在大多数养猪国家(如，中国)仍然是对养猪业危害巨大的重要传染病。目前国际上使用的疫苗主要是中国的猪瘟兔化弱毒疫苗、日本的gpe疫苗和法国的thireval疫苗。我国的猪瘟兔化弱毒疫苗是国际公认的安全有效的弱毒疫苗，亦是国内唯一应用的弱毒疫苗。但这些弱毒疫苗免疫效果受基础抗体的影响很大，且无法区分是疫苗产生的抗体还是自然感染产生的抗体，对猪瘟的净化非常不利。因此，需要另外一种病毒蛋白来进行感染猪的血清学鉴别诊断。目前针对e2的试剂盒主要使用idexx生产的猪瘟e2elisa检测试剂盒，但针对ns2-3的抗体不能用于鉴别诊断。因此，研制能够鉴别诊断疫苗抗体还是自然感染产生的抗体的诊断方法极其重要。技术实现要素：本发明的目的是提供一种稳定表达猪瘟e0蛋白的重组细胞系以及猪瘟e0蛋白抗体检测elisa鉴别诊断试剂盒，从而弥补现有技术的不足。本发明首先提供一种稳定表达猪瘟病毒e0蛋白的中国仓鼠卵巢细胞株cho-e0，于2018年7月19日保藏在位于武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为：cctccno:c2018155，本发明再一个方面提供了一种e0抗体elisa试剂盒，包含有包被猪瘟病毒e0蛋白的elisa板、e0阳性对照血清、e0阴性对照血清、样品稀释液、酶标记结合物、洗涤液、底物溶液a、底物溶液b和终止液。所述的e0阴性对照血清是e0蛋白elisa抗体阴性母猪或e0抗原pcr检测阴性的血清；所述的e0阳性对照血清是用猪瘟活疫苗免疫14～28日龄健康易感猪(e0elisa抗体阴性，e0抗原pcr检测阴性)后获得的血清；洗涤液/样品稀释液：0.01mol/lph7.4的pbst缓冲液。底物溶液a：ph5.0柠檬酸醋酸缓冲液；底物溶液b：ph5.00.01mol/lph5.0tmb-四甲基联苯胺。终止液：2mol/l硫酸溶液。本发明所使用的猪瘟病毒e0蛋白，是用保藏号为：cctccno:c2018155的中国仓鼠卵巢细胞株cho-e0表达制备的。本发明提供了大量制备猪瘟病毒e0蛋白的方法，并提供了以猪瘟病毒e0蛋白为抗原的elisa抗体检测试剂盒，该试剂盒具有较高的灵敏性、特异性、重复性，可以大规模推广应用。附图说明图1：成功包装的猪瘟病毒e0蛋白重组质粒慢病毒图；图2：westernblot检测不同克隆细胞e0蛋白表达的特异性图，其中泳道1为阴性对照，泳道2～6为分别为1～5号cho-e0细胞株表达上清液；图3：不同克隆细胞表达e0蛋白纯度分析图，其中泳道1～5分别为5个cho-e0克隆细胞株表达上清液。具体实施方式实施例1表达猪瘟病毒e0蛋白的重组细胞系的建立1表达猪瘟病毒e0蛋白慢病毒载体的构建1.1引物设计与合成根据“ncbi”上公布的csfvshimen株(genbankaccessionaf092448)的全基因序列和慢病毒过表达载体“pcdh-cmv-mcs-ef1-gfp/puro”，应用primerpremier5设计e0的特异性引物：f：5’-3’：ggaattctgaaaatataactcaatggaacctgagc；r：5’-3’：cgggatccttacttatcgtcgtcatccttgtaatcggcataggcaccaaaccagg。5’、3’端分别添加酶切位点bamhⅰ和ecorⅰ，并在下游引物中加入“flag”标签，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。1.2目的基因的扩增以csfvshimen株全长质粒“pbluescriptⅱsk-csfvshimen”为模板，扩增e0基因。反应体系50μl：10×pfubufferwithmgso45.0μl，dntpmix2mmol/l各5.0μl，forwardprimer1.0μl，reverseprimer1.0μl，templatedna2.0μl，pfudnapolymerase0.5μl，ddh2o35.5μl。按上述比例配制好混合液后，进行pcr反应。结束后，加入5.0μl10×loadingbuffer，混匀，将样品依次加入凝胶孔中，120v，30min。电泳结束后，使用凝胶成像系统观察电泳结果，切取目的片段，使用axyprepdna凝胶回收试剂盒进行胶回收得到目的基因dna。1.3目的基因片段和慢病毒载体的双酶切将目的基因胶回收产物和慢病毒载体pcd513b(pcdh-cmv-mcs-ef1-gfp/puro)分别用bamhⅰ和ecorⅰ进行双酶切，20.0μl酶切体系：目的基因/慢病毒载体12.0μl，10×kbuffer2.0μl，bamhⅰ1.0μl，ecorⅰ1.0μl，ddh2o4.0μl。37℃酶切过夜。1.4目的基因片段的克隆(1)连接与转化利用t4dna连接酶，在反应体系为：空载体dna100ng，各回收产物500ng，t4dna连接酶0.5μl，t4buffer1μl，灭菌水补至10μl，4℃连接过夜。将连接产物加入dh5α感受态细胞中，冰上反应30min后，42℃热激60s，置于摇床37℃、160r/min培养45min后均匀涂于lb平板(氨苄抗性)，37℃培养12h，挑取阳性克隆至6mllb培养基(氨苄抗性)中扩大培养。(2)质粒提取与鉴定：将上述经pcr鉴定为阳性的菌液进行保菌并提取质粒。双酶切鉴定：将重组质粒用bamhⅰ和ecorⅰ酶切鉴定，10μl酶切体系：重组质粒5.0μl，10×kbuffer1.0μl，bamhⅰ0.5μl，ecorⅰ0.5μl，ddh2o3.0μl。37℃酶切过夜。加入1.0μl10×loadingbuffer终止酶切反应，20g/l琼脂糖凝胶电泳检测。将经双酶切鉴定条带大小正确的重组质粒送至金唯智生物科技有限公司测序。经测序正确(氨基酸无缺失、无突变)的质粒用于下游试验。2过表达csfve0蛋白的慢病毒载体的包装2.1细胞培养液氮罐中取出冻存的cho细胞，放入37℃水浴锅使其迅速融化。待冻存管内培养基完全融化，1000r/min离心2min，去除上清。加入1ml10％fbsdmem培养基重悬细胞，并将细胞移入60mm培养皿中，添加培养基至4ml，放入37℃、5％co2培养箱培养。2.2慢病毒包装待复苏后的cho细胞生长状态良好，胰蛋白酶消化，将其均匀接种于六孔板中，放入37℃、5％co2培养箱中培养。待每孔cho细胞密度达到80％时，即可用于慢病毒包装。取5个1.5mlep管，分别加入100μlopti-mem培养基，各管加入辅助质粒gag/pol、rev和vsvg各0.5μg，分别加入重组质粒(pcd513b-e0-flag)或空载体pcd513b各1.5μg，每管再加入6μlturbofect转染试剂，混匀，室温静置20min。取出待转染的六孔板细胞，将ep管中的混合液分别逐滴加入六孔板，摇匀，做好标记，放入培养箱中培养。16h后，弃去六孔板中的培养基，换为2ml含有2％fbs、4μmol/lglu、0.01mmol/l胆固醇、0.01mmol/l蛋黄卵磷脂和1×chemicallydefinedlipidconcentrate的advanceddmem培养基。48h后，将上清吸入2ml离心管中，1500r/min离心15min，吸取上清并分装，上清液即为包装好的猪瘟病毒e0蛋白重组质粒慢病毒颗粒(如图1)，置―80℃冻存备用。2.3病毒滴度测定取生长状态良好的cho细胞，胰蛋白酶消化，将其接种于96孔板，放入培养箱中培养。当细胞密度达到30％时，可用于病毒滴度测定。将10％fbs的cdoptichotm培养基与6μg/mlpolybrene按比例配好备用。取8个1.5ml无菌ep管，分别加入900μl配制好的培养基，并做好标记。加入100μl的病毒液到第1管中，用涡旋仪振荡使其充分混匀。吸取第1管中100μl液体到第2管中，混匀，如此依次倍比稀释至第8管。将96孔板中的培养基弃去，依次加入稀释好的慢病毒毒液，每个浓度做8个重复。同时，设置含10％fbs的cdoptichotm培养基的细胞作为空白对照。放入培养箱中培养8h后，去除病毒液，加入10％fbs的cdoptichotm培养基，48h后，在倒置荧光显微镜下观察发绿色荧光的阳性细胞数，从而计算出病毒滴度(tu/ml)。病毒滴度(tu/ml)＝平均绿色荧光阳性细胞数×稀释倍数/接种病毒液的体积(图1)。3cho-e0工程细胞细胞系的建立与鉴定3.1表达e0蛋白的慢病毒感染cho-k1细胞从37℃培养箱中取出细胞(10cm细胞培养皿)，弃去上清培养基，用预温的8mlpbs洗细胞一次，并弃去pbs。每个10cm细胞培养皿加入1-2ml0.25％trypsin-edta，室温消化2min左右，显微镜下观察细胞皱缩变圆，并呈单个细胞。加入4mldmem/f12(含10％血清，1％双抗)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。将消化好的细胞转移至15ml离心管中，常温离心，200g，5min。用dmem/f12(含10％血清，1％双抗)重新悬浮细胞，计数。稀释细胞至2×105个/ml，取2ml混匀的细胞加入到六孔板，六孔板放置到37℃，5％co2细胞培养箱中孵育过夜。取出上述细胞培养皿，观察细胞状态：当细胞交汇度达到80％-90％时即可开始转染，转染前将培养基换成无抗生素无血清的dmem/f12，2ml/孔。稀释质粒：用opti-mem稀释质粒，125μlopti-mem中加入2.5μg质粒，然后加入2.5μlplus，混匀，室温静置5min。稀释lipofectamineltx：125μlopti-mem中加入9μllipofectamineltx，然后加入2.5μlplus，轻轻混匀，室温静置5min。将稀释后的质粒和lipofectamineltx混合物轻轻混匀。室温放置5min，然后逐滴加入六孔板中均匀分布。将六孔板置于37℃，5％co2细胞培养箱中培养4-6h。换液：弃掉上清培养基，加入2mldmem/f12(含10％血清1％双抗)，将六孔板置于37℃，5％co2细胞培养箱中培养。3.2加压筛选转染后24h开始加压：从37℃培养箱中取出六孔板细胞，弃去上清培养基，加入2mldmem/f12(含10％血清+25μmmsx)，加压7d，中间观察细胞，死细胞多换液。3.3单克隆筛选(1)加压筛选至阴性对照细胞基本死光时，约7days，开始单克隆筛选。(2)取出六孔板，弃掉培养基，pbs洗一次，然后加入300μl0.25％trypsin-edta，室温消化2min左右，加入2mldmem/f12(含10％血清+25μmmsx)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。(3)将消化好的细胞转移至15ml离心管中，常温离心，200g，5min。(4)用dmem/f12(含10％血清+25μmmsx)重新悬浮细胞，计数。(5)铺板：稀释细胞至5个/ml，取200μl混匀的细胞加入到96孔板中，放置到37℃，5％co2细胞培养箱中孵育4-6h。(6)记录单个细胞的孔。(7)待96孔板中单个细胞的孔长起来时，弃掉培养基，pbs洗一次，加入100μl0.25％trypsin-edta，室温消化2min左右，加入2mldmem/f12(含10％血清+25μmmsx)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。将细胞液转移至12孔板，待12孔板长满时，取上清，westernblot检测克隆是否为阳性，高效表达的阳性克隆继续扩大培养、冻存。(8)经过筛选，共收获5株cho-e0工程细胞。3.4e0蛋白表达鉴定收集细胞培养液，4℃，8,000g离心30min，取上清，进行westernblot。结果表明筛选得到克隆细胞均能检测到约23kda的条带，而阴性对照(对照载体重组cho-k1细胞培养上清)在该位置没有相应条带。克隆细胞成功表达csfve0蛋白(图2)，其中，5号细胞克隆表达e0蛋白特异性最好。3.5e0蛋白的纯度检验收集的细胞上清液，经sds-page蛋白电泳后，用伯乐ez成像仪的imagelab软件分析e0蛋白的纯度。详见表1、图3。imagelab软件分析表明筛选得到的5个克隆表达e0蛋白纯度在65.6％～91.8％之间，其中5号克隆e0蛋白纯度最好。表1：不同克隆株细胞表达液中e0蛋白纯度检测结果工程细胞克隆株1#2#3#4#5#e0蛋白纯度(％)68.088.787.966.991.83.6e0蛋白的表达量检测收集的细胞上清液，经bradford蛋白检测试剂盒检测细胞上清液中总蛋白的含量，再通过3.5得到的e0蛋白的纯度计算出e0蛋白的表达量(详见表2)。结果表明筛选得到的5个克隆表达e0蛋白含量在157.8μg/ml～333.4μg/ml之间，其中5号克隆e0蛋白含量最高。表2：不同克隆株细胞表达液中e0蛋白表达量检测结果工程细胞克隆株1#2#3#4#5#e0蛋白含量(μg/ml)157.8232.2247.3216.6333.4将5号克隆命名为e0蛋白的中国仓鼠卵巢细胞株cho-e0，于2018年7月19日保藏在位于武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为cctccno:c2018155，实施例2猪瘟病毒e0蛋白elisa抗体检测试剂盒的制备和使用方法1制备方法1.1包被板的制备：将纯化的e0蛋白抗原用包被液(ph9.50.05mol/l碳酸盐缓冲液)稀释至12.5μg/ml，100μl/孔，置2～8℃吸附12～16小时。用包被用洗涤液(0.01mol/lph7.4的pbst缓冲液)150μl/孔，洗板，甩干，加包被用封闭液(5％脱脂奶粉)150μl/孔，置2～8℃封闭24小时。甩去封闭液，拍干至无水印为止，自然干燥。1.2酶标记结合物的制备：用酶标记结合物稀释液(0.01mol/lph7.4的pbst缓冲液)将酶标记结合物(购于美国bethyl公司)作1:16000倍稀释。用0.22μm滤膜过滤除菌，加入1％的硫柳汞至终浓度为0.01％，充分混合，分装置2～8℃保存。1.3洗涤液/样品稀释液的制备：0.01mol/lph7.4的pbst缓冲1.4底物溶液a的制备：配制ph5.0柠檬酸醋酸缓冲液1.5底物溶液b的制备：配制ph5.00.01mol/lph5.0tmb-四甲基联苯胺。1.6终止液的制备：配制2mol/l硫酸溶液。1.7阳性对照血清和阴性对照血清的制备：e0阴性对照血清：将母猪(elisa抗体阴性，pcr检测阴性)所产的仔猪剥离胎衣，进行人工饲养至50日龄采血，分离血清，作为猪瘟e0蛋白抗体检测elisa诊断试剂盒的阴性对照血清e0阳性对照血清：以14～28日龄健康易感猪(elisa抗体阴性，pcr检测阴性)作为免疫对象，用表达的猪瘟e0蛋白制备的疫苗进行免疫，制备高免血清，当elisa抗体检测不低于1.0时，分离血清，作为猪瘟e0蛋白抗体检测elisa诊断试剂盒的阳性对照血清。2使用方法(1)使用前将试剂盒恢复至室温(20～25℃)，避免阳光直射。(2)用血清稀释液将待检血清做1:400稀释(取血清5μl+95μl样品稀释液，混匀后取5μl+95μl样品稀释液)。(3)加100μl未稀释的e0阴性对照血清，每次检测加两孔。(4)加100μl未稀释的e0阳性对照血清，每次检测加两孔。(5)在相应孔中加100μl稀释好的待检血清。(6)轻摇包被板混匀，装入密封袋，37℃放置30分钟。(7)弃去板内液体，在吸水纸上拍干，用洗涤液洗涤各孔，50μl/孔，静置30-60s，然后弃去洗涤液，每孔再加入300μl蒸馏水反复洗涤5次，最后一次在吸水纸上拍干。(8)加入酶标记结合物100μl，装入密封袋，37℃放置30分钟。(9)重复步骤(7)。(10)加入底物溶液a100μl，底物溶液b50μl，轻轻摇匀，37℃避光反应10分钟。(11)加入终止液100μl，终止反应。(12)将包被板置于酶标仪上，读取450nm波长下的光吸收值。3结果判定(1)实验有效性阳性对照血清od450nm平均值应≥0.50，且2份阳性对照血清od450nm值相差应≤0.20；阴性对照血清od450nm平均值应＜0.10，实验成立，否则无效。(2)计算方法s/p值＝(待检样本od450nm值-阴性对照od450nm均值)/(阳性对照od450nm均值-阴性对照od450nm均值)。(3)结果判定s/p≥2.0判为阳性；1.5＜s/p＜2.0判为可疑；s/p≤1.5判为阴性。实施例3猪瘟病毒e0蛋白抗体elisa检测试剂盒的特异性、敏感性检测效果1特异性试验：为检测试剂盒对猪瘟病毒的特异性，用3批试剂盒分别检测猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒等12种单因子阳性血清，结果猪瘟病毒阳性血清为阳性，其他阳性血清和猪瘟阴性血清均为阴性(表3)，表明试剂盒具有良好的特异性。表33批试剂盒检测特异性试验结果注：1为猪繁殖与呼吸综合征阳性血清；2为猪圆环病毒阳性血清；3为猪伪狂犬阳性血清；4为猪口蹄疫阳性血清；5为猪水泡性口炎阳性血清；6为猪细小病毒阳性血清；7为猪胸膜肺炎阳性血清；8为副猪嗜血杆菌阳性血清；9为猪流行性腹泻阳性血清；10为猪衣原体阳性血清；11为猪瘟病毒阳性血清；12为猪瘟阴性血清。2敏感性试验：本研究研制的易邦试剂盒和idexx的猪瘟检测试剂盒对3份猪瘟阳性血清的检出滴度分别为1:25600和1:12800，试验结果表明，研制的试剂盒比idexx试剂盒的灵敏性高。结果详见表4。表4试剂盒敏感性试验结果注：idexx试剂盒的判定标准为：阻断率≥40％时，判为阳性；30％＜阻断率＜40％时判为可疑；阻断率≤30％时判为阴性。上述结果表明本发明所提供的试剂盒具有很好的特异性和检测灵敏性。当前第1页12