一株具有铬耐受和Cr(VI)去除能力的菌株及其在原位修复中轻度铬污染土壤中的应用的制作方法

本发明属于微生物修复污染土壤的
技术领域：
，具体涉及一株具有铬耐受和cr(vi)去除能力的菌株及其在原位修复中轻度铬污染土壤中的应用。
背景技术：
：我国的铬盐行业起步于1958年，目前，我国年铬盐产能超过35万t，已经成为世界上最大的铬盐生产和消费国家。但是，铬盐的生产产生了大量的铬渣，国家发展和改革委员会以及原环境保护总局于2012年统计，全国累计生产铬盐200多万t，产生铬渣600多万t，其中仅有约200万t得到处置，尚有400多万t堆存铬渣没有得到无害化处置。这些未经无害化处置的铬渣长时间堆存，受到自然降雨淋洗后造成铬污染扩散，污染了周边土壤及地下水，对附近生态环境和人民健康构成巨大威胁。尤其是轻度或中度受铬污染的土壤仍然主要承载着农业生产的功能，而且由于土壤重金属污染危害的隐蔽性和滞后性，生产者往往意识不到其危害性，其所带来的粮食安全和环境安全方面的风险甚至高于重度污染土壤。2016年中国国务院印发了《土壤污染防治行动计划》，其中的一项重要内容就是：实施农用地分类管理。轻度和中度污染的农用地属于安全利用类。因此，采用合理的措施，对轻度和中度铬污染农用地进行修复，降低农产品铬超标的风险显得尤其重要。铬在环境中主要以cr(vi)和cr(iii)的形式存在。与cr(iii)相比，cr(vi)具有致畸、致癌、致突变等高毒性。而cr(iii)则易与环境中的有机、无机化合物相结合，形成复杂稳定的难溶化合物，因而迁移性小，生物有效性低，其毒性仅为cr(vi)的千分之一。因此，将高毒性的cr(vi)还原为低毒性的cr(iii)是cr(vi)污染物修复的基本思路。传统的物理化学方法，如：化学沉淀法、物理隔离法、离子交换法等的实施需要消耗大量的化学试剂，昂贵的机件设备费与运行费阻碍了其大范围的推广与实际应用，与此同时，二次污染的控制与处理也成为一项技术瓶颈。生物修复技术因其具有运行成本低，操作简单，可原地处理，不产生二次污染等优势而得到广泛的重视。近年来，已有不同种属的铬还原微生物得以分离和报道，如无色杆菌achromobactersp.ch-1、微杆菌microbacteriumsp.mp30、苍白杆菌ochrobactrumsp.、金黄节杆菌arthrobateraurescenssp.、芽孢杆菌bacillussp.、硫酸盐还原菌、埃希氏菌属、阴沟杆菌、大肠杆菌、假单胞菌属等。然而，有关利用所分离的微生物菌株进行铬污染土壤原位修复且同时不耽误农作物生产的研究却相对较少。而这一点对有效修复中轻度铬污染农用土壤至关重要。因此，本领域迫切需要将所分离获得的cr(vi)还原效率高、耐受能力强的菌株应用于中轻度铬污染土壤的原位修复，从而为中轻度铬污染土壤生物原位修复的实施提供技术支撑。技术实现要素：本发明针对现有技术的不足，提供了一株具有铬耐受和cr(vi)去除能力的菌株及其在原位修复中轻度铬污染土壤中的应用。本发明由如下技术方案实现的：一株具有铬耐受和cr(vi)去除能力的菌株，该菌株为纤维微菌cr8（cellulosimicrobiumsp.），在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的保藏号为cgmccno：16135，保藏日期为：2018年7月19日,具备耐铬和去除六价铬的能力。所述菌株16srdna序列如序列表seqno.1所示。利用所述的具有铬耐受和cr(vi)去除能力的菌株制备的铬污染土壤修复菌剂，该菌剂的制备方法为：cr8菌接入lb液体培养基，30℃,180rpm条件下摇床培养48h，制成处于稳定生长期的菌悬液（有效活菌数4×108cfu/ml），将菌悬液与麦麸按每200g麦麸混合100ml菌液的比例混合均匀，分别按此混合物重量的5%和100%称取壳聚糖和草炭土，并将三者混合均匀即得菌剂。所述修复菌剂进行中轻度铬污染土壤原位修复的方法为：将腐熟有机肥与修复菌剂一起均匀的洒在地表，有机肥使用量为常规种植用量，菌剂使用量为20kg/667m2；然后将有机肥和菌剂翻拌进土壤里，灌含2%的红糖水至田间持水量65%-75%，放置3-10天即可正常栽种。施加菌剂时，若气温低于15℃，则覆膜保持温度；土壤温度低于0℃时，不采用该方法。使用效果：以盆栽实验模拟大田环境。取铬盐厂附近受铬污染的土壤若干，采用hj687-2014（固体废物六价铬的测定-碱消解火焰原子吸收分光光度法）中所述方法测定老化土壤中的cr(vi)浓度为76.4mg/kg。采用hj491-2009（土壤总铬的测定-火焰原子吸收分光光度法）测定该土壤中土总铬含量为1548mg/kg。将该老化土按上述方法与腐熟牛粪和菌剂混匀后装于塑料花盆中，花盆尺寸为：上口径24cm，下口径14cm，盆高17cm。装盆后灌含2%的红糖水至土壤含水量70%左右，室温（25℃）放置10天后，再次测定土壤中的cr(vi)含量为2.5mg/kg，总铬含量为165.2mg/kg，土壤中cr(vi)去除率达到96.7%，总铬降低率达到89.3%，土壤质量标准达到《gb15618-1995土壤环境质量标准》中规定的二级标准，污染土壤得到有效修复。本发明是国内第一次发现纤维微菌属菌株具有较高的耐铬和去除六价铬能力。菌剂不是直接施入土壤，而是与麦麸、壳聚糖、草炭土一起，有利于菌的成活与快速增殖，红糖水富含各种维生素和生长因子，从而保证功能菌的成功定殖。将腐熟有机肥与菌剂一起使用，一方面更有利于菌的生长和增殖，一方面也有利于六价铬的去除，尤其是应用在受铬污染的农田修复时，施肥与解毒同时进行，操作简便，容易被接受和推广。拉丁文名：cellulosimicrobiumsp.cr8保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号保藏日期：2018年7月19日保藏编号：cgmccno：16135。附图说明图1为cr8菌株在lb培养平板上的菌落特征图；图2为cr8菌株在100×油镜下的显微放大图；图3为cr8菌在不同浓度含铬培养基中的生长曲线图；图4为cr8菌在不同浓度含铬培养基中对cr(vi)的去除率图。具体实施方式实施例1：纤维微菌cr8的分离从山西省晋中市一废弃铬盐厂厂区（n37°34′34.01，e113°43′42.06）采集土壤，将采集的新鲜土壤充分混匀后，采用“选择性培养基+稀释涂布培养”法分离细菌。称取10g土壤于无菌三角瓶中，加入100ml无菌水，震荡30分钟，即得10-1土壤悬液，在超净台里用无菌枪头吸取1ml10-1土壤悬液至9ml无菌水里，即得10-2土壤悬液，依此方法制备直至获得10-8土壤悬液。对-6、-7、-8稀释梯度的土壤悬液分别吸取200μl涂布在含1000μg/mlk2cr2o7的lb培养平板上，30℃黑暗培养3天，获得一株生长较快、菌落较大的菌，划线纯化直至获得纯培养物，挑取单菌落接种于含1000μg/mlk2cr2o7的lb培养基平板上，4℃保存备用。lb培养基配方为：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l,氯化钠10g/l，ph7.2。实施例2：纤维微菌cr8的鉴定形态特征：编号为cr8的菌株在lb培养平板上的菌落特征见图1，为：圆形，黄色，直径约为1mm，中间突起，表面湿润。采用简单染色后观察cr8细胞形态，见图2，发现该菌呈杆状或球杆状，无芽孢。另外，cr8的部分生理生化指标见表1。表1菌株cr8的生理生化指标指标结果指标结果指标结果革兰氏染色+硝酸盐还原+麦芽糖-产iaa实验-木糖醇-半乳糖+纤维素降解-山梨醇-氧化酶实验-明胶液化+蔗糖+接触酶+淀粉水解+葡萄糖-脲酶+分子鉴定：取200μl过夜培养的cr8菌液,12000rpm离心5min,弃上清,于沉淀中加入200μl灭菌超纯水,充分混匀后,置于100℃水浴5min裂解,裂解液作为模板进行pcr反应。pcr引物为通用引物27f和1492r，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列为:27f:agagtttgatcctggctcag和1492r:tacggctaccttgttacgactt。pcr体系为:10xpcrbuffer5μl,dntps1.5μl，上下游引物各0.5μl（10μm/l），模板2μl，rtaq酶1μl，加水补齐至50μl。pcr程序为94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃5min。pcr产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后送往北京华大生物工程技术有限公司测序。序列在ncbi数据库里通过blast比对得出，cr8与纤维微菌属菌株有较高的相似度（相似度>98%）。cr8菌株的16srdna序列如序列表seqno.1所示。综合菌株形态特征、生理生化特征和分子测序结果，鉴定cr8为纤维微菌属。cr8菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏编号为:cgmccno:16135,保藏日期为:2018年7月19日,保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,邮政编码为100101。实施例3：纤维微菌cr8耐铬能力测定：测定方法：挑取cr8单菌落，接入lb液体培养基，在30℃,180rpm条件下摇床培养24h，制成种子液。离心弃上清液后，加lb液体培养基调节其od值至0.5，按0.5%的接种量加入含k2cr2o7的lb液体培养基中，k2cr2o7浓度设0、300、500和1000μg/ml4个梯度，在30℃，180rpm条件下摇床培养2h、4h、8h、12h、24h、48h和72h时，在波长600nm处测定其od值，见图3。从图3可以看出，cr8在含铬培养基中可以很好的生长，在含铬和不含铬的培养基中，均在培养12h时进入对数生长期，培养48h时进入稳定生长期。低浓度铬（300μg/ml）对cr8的生长有一定的抑制作用，进入稳定期的od值低于不含铬的对照处理。高浓度的铬（500μg/ml和1000μg/ml）对cr8生长有促进作用，在这两个高浓度含铬培养基中，进入稳定期的od值均高于不含铬的对照处理。所以，cr8具有极强的耐铬能力。实施例4：纤维微菌cr8去除cr(vi)能力测定cr8菌接入lb液体培养基，在30℃,180rpm条件下摇床培养24h，制成种子液。离心弃上清液后，加lb液体培养基调节其od值至0.5，按0.5%的接种量分别加入浓度为300μg/ml、500μg/ml和1000μg/mlk2cr2o7的lb液体培养基中，在30℃，180rpm条件下摇床培养12h、24h、48h和72h时取培养液，采用二苯碳酰二肼分光光度法方法测定培养液中的cr(vi)含量【参考文献：gb7467-1987水质六价铬的测定二苯碳酰二肼分光光度法】。以含有同等浓度k2cr2o7但不加菌液的处理为空白对照，按公式[（对照cr(vi)残留量-处理cr(vi)残留量）/对照cr(vi)残留量]*100%计算菌株对cr(vi)的去除能力。结果见图4，由图4可见，在三个k2cr207浓度下，cr8菌对cr(vi)都有一定的去除能力，且随着培养时间的延长，去除能力逐渐升高，尤其在培养72h后，在500μg/mlk2cr207浓度下，cr8菌对cr(vi)的去除能力达到95.8%；在300μg/mlk2cr207浓度下，cr8菌对cr(vi)的去除能力达到85.6%；在1000μg/mlk2cr207浓度下，cr8菌对cr(vi)的去除能力达到61.2%。另外，结合生长曲线图和铬去除率图可以看出，cr8菌对cr(vi)的去除能力与菌体本身的生长并不完全一致。在1000μg/mlk2cr207浓度下，cr8菌在培养48h时生长进入稳定期，od值为8.2左右，但图4中显示cr8菌在培养48h时对cr(vi)的去除能力与12h和24h时的去除率相差无几，在培养72h时cr(vi)去除能力才得到大幅提高，达61.2%。总之，cr8菌在300μg/ml、500μg/ml和1000μg/mlk2cr2o7浓度条件下，培养72h后对cr(vi)具有较强的去除能力。实施例5：含纤维微菌cr8的铬污染土壤修复菌剂的制备方法：cr8菌接入lb液体培养基，在30℃,180rpm条件下摇床培养48h，制成处于稳定生长期的菌悬液（有效活菌数4×108cfu/ml），将菌悬液与麦麸按每200g麦麸混合100ml菌液的比例混合均匀，分别按此混合物重量的5%和100%称取壳聚糖和草炭土，并将三者混合均匀即得菌剂。该制备顺序不能变。麦麸最先与菌混合，因为麦麸内的纤维素、淀粉的羟基具有亲水性，能够给菌株提供生长必需的水分。麦麸既含有碳元素，又含有氮元素，能够提供给微生物生长所需的养料。壳聚糖具有吸附性，能够吸附土壤中的金属离子。铬被吸附过来，菌株与铬才能够充分接触，有利于菌对铬的高效转化，这也是固定化微生物修复技术中微生物固定化载体选择必须要考虑的因素之一。最后再与草炭土混合，草炭土具有疏水性，它最大的特点就是松软。草炭土在土壤里起到增大土壤空隙度，即增大空气含量的作用。cr8菌为好氧菌，氧含量越大越有利于菌的生长。实施例6：含纤维微菌cr8的铬污染土壤修复菌剂使用方法将腐熟有机肥与上述菌剂一起均匀的洒在地表，有机肥使用量参照农民种植习惯，菌剂使用量为20kg/667m2。然后将有机肥和菌剂翻进土壤里，灌含2%的红糖水至田间持水量70%左右，放置3-10天即可正常栽种。若气温低于15度，则覆膜保持温度。当土壤温度低于0度时，不适宜采用该方法。使用效果：以盆栽实验模拟大田环境。取铬盐厂附近受铬污染的土壤若干，采用hj687-2014（固体废物六价铬的测定-碱消解火焰原子吸收分光光度法）中所述方法测定老化土壤中的cr(vi)浓度为76.4mg/kg。采用hj491-2009（土壤总铬的测定-火焰原子吸收分光光度法）测定该土壤中土总铬含量为1548mg/kg。将该老化土按上述方法与腐熟牛粪和菌剂混匀后装于塑料花盆中，花盆尺寸为：上口径24cm，下口径14cm，盆高17cm。装盆后灌含2%的红糖水至土壤含水量70%左右，室温（25℃）放置10天后，再次测定土壤中的cr(vi)含量为2.5mg/kg，总铬含量为165.2mg/kg，土壤中cr(vi)去除率达到96.7%，总铬降低率达到89.3%，土壤质量标准达到《gb15618-1995土壤环境质量标准》中规定的二级标准，污染土壤得到有效修复。序列表<110>山西省农业科学院果树研究所，山西省农业科学院农业资源与经济研究所，山西省农业科学院农业环境与资源研究所，山西省农业科学院生物技术研究中心<120>一株具有铬耐受和cr(vi)去除能力的菌株及其在原位修复中轻度铬污染土壤中的应用<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1449<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1tagagtttggaacctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcttaacacatgcaagtcga60acgatgatgcccagcttgctgggtggattagtggcgaacgggtgagtaacacgtgagtaa120cctgcccttgacttcgggataactccgggaaaccggggctaataccggatatgagccgcc180ttcgcatgggggtggttggaaagtttttcggtcagggatgggctcgcggcctatcagctt240gttggtggggtgatggcctaccaaggcgacgacgggtagcskrscygrsmkgrmgassgs300smacmsyrssactgrrmyrmgkcmcrkmcymswmyskrmggmagcagyrgtgggaatatt360gcacaatgggcgaaagcctgatgcagcgacgcccgcgtgagggatgarssyckksgggtt420gtaaacctctttcagcagggaagaagcgcaagtgacggtacctgcagaagaagcgccggc480taactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggcgcaagcgttgtccggaattattgg540gcgtaaagagctcgtaggcggtttgtcgcgtctggtgtgaaaactcgaggctcaacctcg600agcttgcatcgggtacgggcagactagagtgcggtaggggagactggaattcctggtgta660gcggtggaatgcgcagatatcaggaggaacaccgatggcgaaggcaggtctctgggccgc720aactgacgctgaggagcgaaagcatggggagcgaacaggattagataccctggtagtcca780tgccgtaaacgttgggcactaggtgtggggctcattccacgagttccgtgccgcagcaaa840cgcattaagtgccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaaggaattgacg900ggggcccgcacaagcggcggagcatgcggattaattcgatgcaacgcgaagaaccttacc960aaggcttgacatgcacgagaagccaccagagatggtggtctctttggacactcgtgcaca1020ggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgag1080cgcaaccctcgtcccatgttgccagcgggttatgccggggactcatgggagactgccggg1140gtcaactcggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgtcttgggctt1200cacgcatgctacaatggccggtacaaagggctgcgataccgtaaggtggagcgaatccca1260aaaagccggtctcagttcggattggggtctgcaactcgaccccatgaagtcggagtcgct1320agtaatcgcagatcagcaacgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgccc1380gtcaagtcacgaaagtcggtaacacccgaagcccatggcccaaccgttcgcggggggagt1440ggtcgaagg1449当前第1页12