一株Surfactin高产菌株及其应用的制作方法

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种高产surfactin的枯草芽孢杆菌菌株及其应用。

背景技术：

surfactin，中文名称表面活性素，是由芽孢杆菌属细菌经非核糖体途径合成的次级代谢产物，基本结构是由1个β-羟基脂肪酸和含7个氨基酸的多肽经内酯键连接而成的环状脂肽，因脂肪酸中碳链长度的不同，会出现分子量上相差一个或几个-ch2的同系物。

surfactin具有表面活性大、乳化和发泡性能良好的突出特性，能显著降低水的表面张力和其他液-液界面张力；另外，surfactin还被证实具有抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗支原体、抗肿瘤等抗微生物活性；同时，由于surfactin是由脂肪酸、多肽链连接而成的环状脂肽，surfactin还具有易生物降解、对环境无污染等优异特性。

正因为环脂肽surfactin具有诸多突出特性，使得surfactin、产surfactin的微生物菌株被开发应用于微生物饲料、饲料添加剂、微生物肥料、植物病害防治、食品加工、医药、化妆品、环保、石油开采等多个领域，备受国内外研究人员、工业开发人员等的青睐。

但是，由于现有微生物菌株的surfactin产率较低，导致surfactin生产成本较高，surfactin价格昂贵，大大限制了surfactin应用范围、规模化生产和商业化开发应用。

技术实现要素：

为了解决目前surfactin产率低、无法满足工业化生产的问题，本发明提供一种高产surfactin的菌株、生产方法及其应用。

本发明提供了一株surfactin高产菌株，该高产菌株为枯草芽孢杆菌lm34s07(bacillussubtilislm34s07)，已于2018年4月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmcc15620，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

本发明所提供的surfactin高产菌株枯草芽孢杆菌lm34s07是由出发菌株枯草芽孢杆菌经亚硝基胍、he-ne激光照射复合诱变选育得到。

枯草芽孢杆菌lm34s07在营养琼脂平板上生长良好，菌落乳白色、不透明，菌落圆形、边缘不整齐；细胞杆状，革兰氏阳性，芽孢中生、椭圆形。

本发明提供的菌株属于是国际上公认的安全菌种，被美国fda和环保署列为可商业上应用的微生物菌种之一，也是我国农业部规定的免做安全鉴定的一级菌种之一。

本发明提供了利用枯草芽孢杆菌lm34s07生产surfactin的方法，包括：挑取菌株lm34s07一环，接入装有30-100ml牛肉膏蛋白胨培养基的250ml三角瓶中，于30-35℃、150-200rpm下摇床培养16-24h，得种子液；将种子液按3-10%(v/v)的接种量接入装有100-200ml发酵培养基的500ml三角瓶中，于30-35℃、150-200rpm下摇床培养28-48h，得发酵液；发酵培养基组成为葡萄糖15-35g、谷氨酸3-8g、酵母膏1-4g、磷酸二氢钾0.7-1.1g、氯化钾0.3-0.6g、七水硫酸镁0.3-0.6g、硫酸铜0.1-0.2mg、七水硫酸亚铁0.1-0.2mg、硫酸锰3-10mg、水1l，ph7.0，115℃灭菌30min。

本发明提供了以枯草芽孢杆菌lm34s07或其发酵产物或含有枯草芽孢杆菌lm34s07的菌剂在饲料领域、农业领域的应用。

本发明提供了以枯草芽孢杆菌lm34s07或其发酵产物或含有枯草芽孢杆菌lm34s07的菌剂在食品、医药、化妆品领域的应用。

本发明提供了以枯草芽孢杆菌lm34s07或其发酵产物或含有枯草芽孢杆菌lm34s07的菌剂在环境保护领域的应用。

本发明的有益效果：

本发明提供了一株高产surfactin的枯草芽孢杆菌lm34s07，该菌株合成surfactin速率快、产量高，发酵40h发酵液surfactin含量高达9.78g/l；利用菌株lm34s07生产surfactin可以大大降低生产成本，提高生产效率，具有巨大的工业化应用前景。

附图说明

图1surfactin标准品hplc图谱；

图2甲醇抽提液样品hplc图谱。

具体实施方式

为了使本发明更加容易理解，以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明、而不用于限制本发明的范围。

实施例1：surfactin高产菌株复合诱变选育

挑取出发菌株一环接入装有10ml牛肉膏蛋白胨培养基的50ml三角瓶中，于33℃、175r/min摇床培养16h后，于4℃、8000r/min下离心15min，收集菌体，菌体用ph7.0磷酸缓冲液洗涤3次，加入一定量ph7.0磷酸缓冲液悬浮菌体，得到用于复合诱变的菌悬液(10⁸cfu/ml)；将1ml菌悬液、1ml浓度180ug/ml的亚硝基胍溶液于小试管中混合均匀，置于33℃水浴，期间采用he-ne激光器照射(外腔式准单模he-ne激光，波长632.8nm，照射功率为12mw)，每次照射持续2min，照射3次，水浴处理12min后，将上述混合液倒入48ml无菌生理盐水中，终止反应；然后，采用梯度稀释法将各稀释液涂布于血平板上，于33℃下恒温培养36h，挑取溶血圈大的菌落，转接保存，采用hplc法检测突变株发酵液surfactin产量，最终筛选得到surfactin高产突变株lm34s07。

实施例2：surfactin含量检测

将发酵液于4℃、12000rpm下离心20min，收集上清液，用浓盐酸调节上清液ph至2.0，4℃静置过夜后于4℃、12000rpm下离心20min，收集沉淀；向沉淀中加入5ml甲醇，于磁力搅拌器上搅拌30min后，放入4℃冰箱内静置抽提12h，抽提结束后于4℃、12000rpm离心20min，收集甲醇抽提液；按上述方法重复抽提3次，合并甲醇抽提液，经0.22um无菌微孔滤膜过滤后，4℃保存备用。

采用hplc进行surfactin含量检测；色谱柱zorbaxsb-c18(5μm，4.6×250mm)，柱温35℃，进样量20μl，波长205nm，流速0.8ml/min，流动相a纯水(含0.1%tfa)，流动相b乙腈(含0.1%tfa)；梯度洗脱条件为：0~9min，40%流动相a和60%流动相b；9~20min，7%流动相a和流动相b；由hplc图谱显示，甲醇抽提液样品hplc出峰时间（图2）与surfactin标准品出峰时间（图1）基本相同，surfactin标准品标准曲线回归方程为y=0.08132x-41.76，相关系数r²=0.9937，将甲醇抽提液样品hplc峰面积带入回归方程计算得到surfactin浓度，进而换算出发酵液中surfactin含量。

实施例3：surfactin发酵

发酵培养基组成为葡萄糖20g、谷氨酸5g、酵母膏4g、磷酸二氢钾1g、氯化钾0.5g、七水硫酸镁0.5g、硫酸铜0.16mg、七水硫酸亚铁0.15mg、硫酸锰5mg、水1l，ph7.0，115℃灭菌30min。

挑取菌株lm34s07一环，接入装有50ml牛肉膏蛋白胨培养基的250ml三角瓶中，于33℃、175rpm下摇床培养18h，得种子液；将种子液按7%(v/v)的接种量接入装有150ml发酵培养基的500ml三角瓶中，于33℃、175rpm下摇床培养40h，得发酵液；经检测，发酵液surfactin含量为9.78g/l。

实施例4：surfactin发酵

发酵培养基组成为葡萄糖35g、谷氨酸3g、酵母膏1g、磷酸二氢钾1.1g、氯化钾0.3g、七水硫酸镁0.6g、硫酸铜0.2mg、七水硫酸亚铁0.2mg、硫酸锰3mg、水1l，ph7.0，115℃灭菌30min。

挑取菌株lm34s07一环，接入装有100ml牛肉膏蛋白胨培养基的250ml三角瓶中，于35℃、200rpm下摇床培养24h，得种子液；将种子液按5%(v/v)的接种量接入装有200ml发酵培养基的500ml三角瓶中，于35℃、200rpm下摇床培养48h，得发酵液；经检测，发酵液surfactin含量为9.71g/l。

实施例5：surfactin发酵

发酵培养基组成为葡萄糖15g、谷氨酸8g、酵母膏4g、磷酸二氢钾0.7g、氯化钾0.6g、七水硫酸镁0.3g、硫酸铜0.1mg、七水硫酸亚铁0.1mg、硫酸锰10mg、水1l，ph7.0，115℃灭菌30min。

挑取菌株lm34s07一环，接入装有30ml牛肉膏蛋白胨培养基的250ml三角瓶中，于30℃、150rpm下摇床培养16h，得种子液；将种子液按10%(v/v)的接种量接入装有100ml发酵培养基的500ml三角瓶中，于30℃、150rpm下摇床培养28h，得发酵液；经检测，发酵液surfactin含量为9.66g/l。

本发明不受上述发明的实施方式及实施例的说明的任何限定。本发明中也包含在不偏离所要保护的范围的情况下在本领域技术人员可以容易地想到的范围内的各种变形方式。