一种N-酰基高丝氨酸内酯淬灭菌及其在病害防控中的应用的制作方法

本发明属于生物防治
技术领域：
。更具体地，涉及一种n-酰基高丝氨酸内酯淬灭菌及其在病害防控中的应用。
背景技术：
：胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种（pectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovora,pcc）为植物软腐病病原菌的主要成员（limj,jees,leedh,etal..biocontrolofpectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorumusingbacteriophagepp1[j].journalofmicrobiologyandbiotechnology,2013,23(8):1147-1153.）。pcc不仅可以侵染多种温带、亚热带农作物和观赏性植物，如：农作物白菜、萝卜、番茄、马铃薯、胡萝卜、辣椒、芹菜、花椰菜等；观赏植物君子兰，百合、紫罗兰、水仙、仙人掌等。而且，还可以侵染药用植物独角莲和水飞蓟等。pcc引发的细菌性软腐病发生范围广泛，在多国比如立宛陶、日本、德国、阿根廷、新西兰和中国均有发生并且危害严重，已经成为世界性病害并导致相关作物的减产，引起重大经济损失。针对细菌性软腐病，目前生产中主要使用噻菌酮、噻枯唑、代森铵、硫酸链霉素及中生菌素等化学农药来防治。然而化学农药的大量使用已经带来了众所周知的环境污染、生态平衡破坏、病原菌抗药性和食品安全等一系列严重问题，另外，抗生素的滥用亦引起了微生物耐药性的产生。因此，寻找新的、有效的防治策略迫在眉睫。微生物自身可以产生并分泌一种或多种化学物质，随着微生物群体密度的增大时，环境中化学物质的浓度也在增大，当这些化合物浓度到达一定阈值后，微生物的某些特定基因尤其是很多致病基因开始表达。这种现象被称为群体感应（quorumsensing,qs），这些化学物质被称为群体感应信号分子或自诱导剂（autoinducers,ais）（whiteleym,digglesp,greenbergep.progressinandpromiseofbacterialquorumsensingresearch[j].nature,2017,551(7680):313-320.）。n-酰基高丝氨酸内酯类物质（n-acylhomoserinelactones,ahls）为革兰氏阴性菌特有的群体感应信号，它们大都具有相同的高丝氨酸内酯环状的结构且都具有酰基侧链，但其酰基侧链长度、饱和度存在差异。n-(3-oxohexanoyl)-l-homoserinelactone（ohhl,3oc6hsl）、n-(3-oxooctanoyl)-l-homoserinelactone（oohl,3oc8hsl）、n-(3-oxododecanoyl)-l-homoserinelactone（oddhl,3oc12hsl）均属于ahls，其差别在于酰基侧链长度不同。pcc通过合成和分泌能够降解植物细胞壁的水解酶，如：果胶酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶等，攻击植物的防御体系破坏植物组织结构，获得水分和营养成分以支持自身生长和繁殖，侵染成功后，寄主植物出现软腐病相关症状。pcc也具有群体感应现象，并且调控着与其致病性相关的水解酶的表达。pcc可以合成并向环境分泌一种ahl---ohhl，随着pcc群体密度的增大，环境中ohhl浓度也不断增大，当ohhl达到一定浓度阈值之后，ohhl与luxr家族转录激活蛋白结合，致病因子即编码胞外酶的基因开始表达，与致病性相关的水解酶合成，寄主植物被成功侵染，导致寄主发生软腐病害（piersonlsi,wooddw,piersonea.homoserinelactone-mediatedgeneregulationinplant-associatedbacteria[m].websterrk.annualreviewofphytopathology,1998:207-225.）。群体感应淬灭（quorumquenching,qq）是基于群体感应现象提出的一种新的病害防治新策略，即：通过抑制信号分子的合成、积累、监测，或对信号分子进行酶降解或修饰的机制来干扰群体感应系统，抑制微生物与致病性相关的基因的表达，减弱微生物的致病性，从而达到防治病害的目的。利用群体感应淬灭菌或群体感应淬灭酶（quorumquenchingenzymes）降解微生物信号分子，是目前毒性最小、最为有效的群体感应淬灭途径。群体感应淬灭是通过调控群体感应系统进行来防治病害，所以不会对微生物产生选择压力，理论上细菌不会产生抗药性。群体感应淬灭是一种有效防治植物细菌病害的新途径，具有操作简便、经济实用、环境友好、效率高且周期短等优点。针对不同群体感应信号发展群体淬灭制剂是目前国际范围的研究热点。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供一种新的具有淬灭群体感应信号分子能力的微生物菌种，即中间苍白杆菌（ochrobactrumintermedium），其对多种ahls群体感应信号分子具有显著且快速的降解作用，在防治群体感应信号分子介导的致病菌危害方面有巨大的应用潜力，这为以生物防治替代化学防治且以阻断群体感应为靶标而不引起选择压力的防治策略提供了新的开发途径。本发明的目的是提供中间苍白杆菌（ochrobactrumintermedium）在淬灭微生物群体感应信号分子ahls中的应用，或在制备淬灭降解微生物群体感应信号分子ahls的产品中的应用；以及在防治依赖微生物群体感应信号分子介导致病的植物病害中的应用，或在制备依赖微生物群体感应信号分子致病的致病菌的防治制剂方面的应用。本发明另一目的是提供一种可淬灭降解微生物群体感应信号分子的中间苍白杆菌菌株d-2及其应用。本发明上述目的通过以下技术方案实现：本发明首次研究发现中间苍白杆菌（ochrobactrumintermedium）具有淬灭降解微生物群体感应信号分子的作用，并从采集自河北省电厂的土壤样本，经分离纯化筛选鉴定得到一株高效降解菌，中间苍白杆菌菌株d-2，并于2018年7月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（gdmcc），保藏编号为gdmccno：60409，保藏地址是广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。该菌株d-2的菌落形态特征为：在营养琼脂平板上培养48h，菌落呈白色，圆形，凸起，半透明，边缘整齐。电镜观察菌体的形态特征为：细胞近球形，有鞭毛。该菌株d-2的生理生化特性为：革兰氏阴性菌，生长时好氧，接触酶试验、氧化酶试验反应阳性，明胶液化试验反应阴性。所述菌株d-2对氨苄青霉素的抗性达到400μg·ml-1以上，对卡那霉素的抗性达到350μg·ml-1，对庆大霉素、链霉素的抗性达到40μg·ml-1，对氯霉素的抗性均达到10μg·ml-1，对四环素无抗性。实验结果表明，该中间苍白杆菌菌株d-2对中长链的ahls群体感应信号分子具有淬灭活性，能够显著且快速的降解中长链的ahls。菌株d-2可在浓度高达0.4mm的以群体感应信号分子ohhl为唯一碳源的基础盐培养基中正常生长并在32h内将ohhl完全分解。在防治ahls类群体感应信号分子介导的致病菌危害方面有巨大的应用潜力。因此，以下应用均应在本发明的保护范围之内：中间苍白杆菌在淬灭微生物群体感应信号分子ahls中的应用。中间苍白杆菌在制备淬灭降解微生物群体感应信号分子ahls的产品中的应用。中间苍白杆菌在防治依赖微生物群体感应信号分子介导致病的植物病害中的应用。中间苍白杆菌在制备依赖微生物群体感应信号分子致病的致病菌的防治制剂方面的应用。优选地，上述任一所述的应用中，所述中间苍白杆菌为本发明分离得到的中间苍白杆菌菌株d-2。另外具体地，所述微生物群体感应信号分子为n-酰基高丝氨酸内酯类物质（n-acylhomoserinelactones,ahls）。优选地，所述微生物群体感应信号分子为中长链的ahls。更优选地，所述微生物群体感应信号分子为ahls信号分子ohhl、oohl和/或oddhl。优选地，所述依赖微生物群体感应信号分子致病的病原菌为：迪卡氏菌（dickeyasp.）、果胶杆菌（pectobacteriumsp.）或绿脓杆菌（pseudomonasaeruginosa）。所述植物病害包括软腐病，如马铃薯软腐病或胡萝卜肉质根软腐病。更具体是由果胶杆菌（如z3-3）引起的软腐病。另外，一种防治依赖ahls群体感应信号分子致病的致病菌病害的方法，具体是利用中间苍白杆菌的菌液对作物进行接种处理，以防治依赖微生物群体感应信号分子致病的病原菌侵染和病害，也应在本发明的保护范围之内。优选地，所述处理的方式为对作物进行接种处理。优选地，应用时，所述的中间苍白杆菌淬灭ahls的最适ph为6.5，最适温度为30℃。另外，利用中间苍白杆菌可以制成一系列的功能菌剂，如一种含有中间苍白杆菌和/或其菌液的可淬灭微生物群体感应信号分子的淬灭菌剂，一种含有中间苍白杆菌和/或其菌液的依赖微生物群体感应信号分子致病的病原菌的生防制剂，也都应在本发明的额保护范围之内。优选地，所述含有中间苍白杆菌为本发明筛选的菌株d-2。本发明同时还提供了所述菌株d-2菌液的制备方法：具体是将菌株d-2划线于lb固体培养基平板上，30℃下培养24h，挑取单菌落接种于lb液体培养基中预培养至对数期，得到菌株d-2菌液。菌液的浓度不做严格限制，具体可根据实际病害程度和应用效果进行调整。优选地，所述lb培养基为：胰蛋白胨10.0g·l-1，酵母提取物5.0g·l-1，氯化钠10.0g·l-1，ph6.8~7.2，121℃灭菌20min。lb固体培养基配方是在液体培养基中加入1.5%（w/ν）的琼脂。本发明具有以下有益效果：本发明研究发现，中间苍白杆菌（ochrobactrumintermedium）对多种ahls群体感应信号分子具有淬灭活性，能够快速且显著地降解多种ahls群体感应信号分子，包括ohhl、oohl和oddhl等，在防治ahls介导致病的致病菌危害方面有巨大的应用潜力，这为以生物防治替代化学防治且以阻断群体感应为靶标而不引起选择压力的治疗策略提供了新的开发途径。同时，本发明筛选获得了一株中间苍白杆菌d-2，可在浓度高达0.4mm的ohhl为唯一碳源的培养基中正常生长，在32h内可完全降解群体感应信号分子ohhl，该菌株具有显著的生物降解效果，可防治依赖ahls致病的细菌性软腐病等病害，如对依赖ahls致病的病原菌胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种（pectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovora,pcc）引起的病害，具有显著的生防作用。依据本发明，由于菌株d-2具有稳定高效降解植物病原菌中群体感应ahls信号分子的特性，因此，菌株d-2可应用于自然环境中ahls介导致病的致病菌的防治，既可以减少农药滥用问题，又给病害防治带来了新思维、新途径和新方法。附图说明图1为本发明的菌株d-2在lb培养基上的菌落形态图。图2为本发明的菌株d-2的扫描电镜图。图3为本发明的菌株d-2的系统进化树分析图。图4为本发明的菌株d-2在不同抗生素中的生长情况图。图5为本发明的菌株d-2对不同ahls淬灭活性结果图（e.coli为阴性对照，b23为阳性对照），(a)为ohhl，(b)为oohl，(c)为oddhl。图6为本发明的菌株d-2以ohhl为唯一碳源时的生长曲线和降解曲线图。图7为本发明的菌株d-2、e.coli、b23分别与z3-3共同接种于马铃薯块茎24h后的发病情况。图8为本发明的菌株d-2、e.coli、b23分别与z3-3共同接种于胡萝卜切片24h后的发病情况。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本
技术领域：
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。实施例1中间苍白杆菌菌株d-2的获取与鉴定1、菌株d-2的分离、筛选（1）土样采集：采集自河北省电厂的土壤样本作为微生物源土样分离于2017年8月9日从河北省电厂内，进行取样、装袋、保存作为微生物源带回学校进行菌株分离。（2）菌株的富集培养：制备基础盐（msm）培养基，将20mlmsm培养基装到250ml锥形瓶中灭菌，冷却后在无菌条件下加入ohhl母液（乙腈为溶剂），使ohhl的最终浓度为5μm，同时加入5g土壤样本，在30℃、200rpm条件下培养7d后，按10%的接种量转接到第二批含10μm的ohhl的msm培养基中。相同条件培养7d后，再按10%的接种量转接到含20μm的ohhl的msm培养基中，继续培养7d。以此类推，不断增加ohhl的浓度。其中，所述基础盐（msm）培养基的配方为：硫酸铵2g；七水合硫酸镁0.2g·l-1；二水合氯化钙0.01g·l-1；七水合硫酸亚铁0.001g·l-1；十二水合磷酸氢二钠1.5g·l-1；磷酸二氢钠1.5g·l-1；ph6.5。（3）菌株分离与纯化：采用稀释、平板涂布法进行分离。取1ml终msm培养基发酵液用无菌水将其稀释成浓度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8的梯度浓度发酵液，然后吸取100μl各个浓度的发酵液均匀地涂布在lb固体平板上，30℃培养，挑取菌落形态不同的单菌落，在lb固体平板反复划线培养纯化，直至分离出单菌株。将单菌株-80℃保存，待进一步实验测定对ahls的降解效果。（4）菌株筛选：利用报告菌株cf11（agrobacteriumtumefaciensnt1）对从土样中分离得到的菌株进行筛选。将保存于-80℃的待筛选菌株划线于lb平板上，30℃培养，进行菌株的活化。挑取单菌落接种至液体lb培养基，在30℃，200rpm条件下过夜培养，得到菌液。取一定体积（v=1/od600）的菌液以4000rpm、10min的条件进行离心，弃上清，得到一个od600值的菌体。将1个od600值的菌体，接种至1ml以ohhl作为唯一碳源的msm培养基中，msm培养基中ohhl的终浓度为20μm。将反应混合物放置于2ml离心管中，在30℃，200rpm的条件下培养24h。24h后，取5μl反应混合物点样至1cm宽的mm琼脂条顶端，然后在下方点一排可以检测ahls的报告菌株cf11（agrobacteriumtumefaciensnt1）。其中mm琼脂条的ph值为6.5，琼脂条中含有40μg·ml-1的x-gal。将mm琼脂条放置在28℃培养箱，避光培养24h后观察实验结果。其中，所述基础（mm）培养基的配方为：硫酸铵2g·l-1；七水合硫酸镁0.2g·l-1；无水氯化钙0.01g·l-1；硫酸亚铁0.005g·l-1；氯化锰0.002g·l-1；磷酸氢二钾10.5g·l-1；磷酸二氢钾4.5g·l-1；ph6.5。（5）结果分析：当报告菌株cf11（agrobacteriumtumefaciensnt1）检测到琼脂条中含有ahls时，其β-半乳糖苷酶的相关基因开始表达，cf11向环境中分泌β-半乳糖甘酶。β-半乳糖甘酶可以将mm琼脂条中含有的无色化合物x-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-半乳糖苷）酶解为半乳糖和深蓝色物质5-溴-4-靛蓝，5-溴-4-靛蓝可使整个报告菌株的菌落变成蓝色。ahls可以在琼脂条上扩散，而且扩散距离与其浓度成正比。综上所述，根据琼脂条上报告菌株自顶端变蓝的距离分析原样本中ahls含量，自顶端变蓝的距离越短则对应菌株降解效果越好。最终根据实验结果筛选出对ahls降解效果最好的菌株，命名为菌株d-2。2、菌株d-2的鉴定及系统进化分析（1）菌落形态特征（如图1所示）：在营养琼脂平板上培养48h，菌落呈白色，圆形，凸起，半透明，边缘整齐。（2）菌体形态特征：电镜观察如图2所示，细胞近球形，有鞭毛。（3）生理生化特性：革兰氏阴性菌，生长时好氧，接触酶试验、氧化酶试验反应阳性，明胶液化试验反应阴性。其生理生化鉴定结果如表1所示。表1菌株d-2生理生化鉴定结果生理生化特征结果生理生化特征结果革兰氏染色－接触酶＋厌氧生长－氧化酶＋明胶液化－注：－：阴性反应；＋：阳性反应。（4）16srdna序列及系统进化分析：菌株d-2的16srdna基因序列长度为1396bp，与ncbi数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行比对，发现所述菌株d-2与ochrobactrumintermedium具有很好的同源性（>99%），其系统进化树如图3所示。（5）biolog微生物自动分析系统鉴定：biolog微生物自动分析是指通过确定微生物对糖、胺、醋、酸、醇和大分子聚合物等多种碳源的利用情况来鉴定微生物的属种。鉴定时会使用一种96孔鉴定板，板上含有多种脱水碳源。微生物在利用碳源进行呼吸作用时，可以将四唑类氧化还原染色剂还原为紫色，在鉴定板上形成该微生物特征性反应模式或“指纹”。仪器采集该微生物的“指纹”之后与数据库匹配，迅速得出鉴定结果。本发明菌株d-2的biolog微生物自动分析系统鉴定结果显示，d-2与中间苍白杆菌(ochrobactrumintermedium)最为相似。菌株d-2碳源利用结果如表2所示。表2菌株d-2碳源利用鉴定结果碳源利用结果碳源利用结果阴性对照－糊精－d-麦芽糖＋d-纤维二糖＋龙胆二糖＋蔗糖＋d-松二糖＋水苏糖－d-蜜三糖－α-d-乳糖－d-蜜二糖－β-甲酰-d-葡糖苷－d-水杨苷±n-乙酰-d-葡糖胺＋n-乙酰-β-d-甘露糖胺－n-乙酰-d-半乳糖胺±n-乙酰神经氨酸－α-d-葡萄糖＋d-甘露糖＋d-果糖＋d-半乳糖＋3-甲酰葡萄糖－d-果糖＋l-果糖＋l-鼠李糖＋肌苷±d-山梨醇＋d-甘露醇－d-阿拉伯醇±肌醇±甘油－d-葡萄糖-6-磷酸－d-果糖-6-磷酸－d-天冬氨酸－d-丝氨酸±明胶－氨基乙酰-l-脯氨酸±l-丙氨酸±l-精氨酸±l-天冬氨酸±l-谷氨酸＋l-组胺＋l-焦谷氨酸－l-丝氨酸＋d-半乳糖醛酸＋l-半乳糖醛酸内酯＋d-葡萄糖酸±d-葡萄糖醛酸＋葡萄糖醛酰胺±粘酸－奎宁酸－糖质酸－p-羟基-苯乙酸－丙酮酸甲酯±d-乳酸甲酯－l-乳酸±α-酮-戊二酸＋d-苹果酸＋l-苹果酸＋溴-丁二酸±吐温40－γ-氨基-丁酸±α-羟基-丁酸±β-羟基-d，l-丁酸±α-酮-丁酸±丙酸±乙酸＋甲酸－阳性对照＋ph5－1%nacl＋4%nacl－8%nacl－乳酸钠＋梭链孢酸±d-丝氨酸－醋竹桃霉素±利福霉素＋二甲胺四环素－林肯霉素＋盐酸胍＋万古霉素＋四唑紫＋四唑蓝＋萘啶酮酸±氯化锂±亚碲酸钾＋氨曲南＋丁酸钠＋溴酸钠±注：“－”表示为阴性反应或不利用；“＋”表示阳性反应或利用；“±”表示阳弱反应。综上所述，通过对菌株d-2的16srdna序列、形态学特征、生理生化特性及biolog微生物自动分析系统结果进行分析，将菌株d-2鉴定为中间苍白杆菌（ochrobactrumintermedium），并于2018年7月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（gdmcc），保藏编号为gdmccno：60409，保藏地址是广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。实施例2菌株d-2的抗生素敏感性分析为了能够更好地研究实施例1获得的菌株d-2的生防潜力，我们对该菌株的生物学特性进行了深入的研究。实验研究了菌株d-2对不同抗生素的敏感性，具体如图4所示。实验结果表明：该菌株d-2对氨苄青霉素的抗性达到400μg·ml-1以上，对卡那霉素的抗性达到350μg·ml-1，对庆大霉素、链霉素的抗性达到40μg·ml-1，对氯霉素的抗性均达到10μg·ml-1，对四环素无抗性。这一结果利于后续研究中选取合适的抗生素作为参考。实施例3菌株d-2底物谱分析1、菌株培养与样品采集：30℃条件下，将菌株d-2在lb固体平板上进行活化。挑取单菌落接种至lb液体培养基，以30℃，200rpm条件过夜培养得到菌液。取一定体积（v=1/od600）的菌液以4000rpm、10min的条件进行离心，弃上清，得到一个od600值的菌体。将1个od600值的菌体，接种至1ml分别以不同ahls作为唯一碳源的msm无机盐培养基中。将反应混合物分别放置于2ml离心管中，使离心管在30℃，200rpm的条件下培养24h。24h后，取5μl反应混合物点样至1cm宽的mm琼脂条顶端，然后在下方点报告菌株cf11（agrobacteriumtumefaciensnt1）菌液。然后将已经好反应混合物和报告菌株的琼脂条放置于28℃培养箱，避光培养24h后观察实验结果。其中，琼脂条为含有浓度为40μg·ml-1x-gal的mm板切条所得。根据琼脂条上报告菌株自顶端变蓝的距离可以判断出样本中酰基高丝氨酸内酯（ahls）含量的多少。从而确定菌株d-2对不同ahls是否具有淬灭活性。在试验中，以已知能够淬灭多种ahls的苏云金芽孢杆菌以色列亚种（bacillusthuringiensissubsp.israelensis）b23为阳性对照（dongy,xuj,lix,etal.aiia,anenzymethatinactivatestheacylhomoserinelactonequorum-sensingsignalandattenuatesthevirulenceoferwiniacarotovora[j].procnatlacadsciusa,2000,97(7):3526-3531.），以不具备淬灭ahls活性的大肠杆菌（escherichiacoli）作为阴性对照。2、试验结果显示：在ohhl（图5a）、oohl（图5b）、oddhl（图5c）试验组中，ck与阴性对照e.coli的ahls扩散距离一致，即两者反应混合物中ahls含量相近；阳性对照b23与实验组d-2的琼脂条上的报告菌株均未变蓝，两者的反应混合物中不含有ahls，ahls已经被菌株d-2降解完全。表明菌株d-2对ahls信号分子ohhl、oohl、oddhl均具有淬灭活性。实施例4菌株d-2生长和降解ohhl关系曲线的测定1、挑取菌株d-2单菌落接种于lb培养基中预培养至对数期取一定体积（v=1/od600）的菌液以4000rpm、10min的条件进行离心，弃上清，得到一个od600值的菌体。将菌体接种至20mlmsm培养基中，并添加ohhl母液，使其最终浓度为0.4mm，30℃，200rpm下培养定时取样。采集不同时间点的样品并测定od600值表示菌株d-2的生长情况，利用hplc测定ohhl的残留量表示菌株d-2对ohhl的降解情况。2、hplc测定方法hplc：waters2695。色谱柱：kinetexevoc18反相色谱柱（250μm×4.6mm×5μm）。流速：0.5ml·min-1。柱温：30℃。流动相：乙腈：水=30：70（v：v）。检测波长：210nm。进样量：20μl。3、结果分析：hplc检测结果如图6所示，在32h时，ohhl已经被降解完全。综上所述，3oc6hsl的降解与菌株d-2生长呈正相关，在ohhl的存在下，菌株生长没有滞留期，迅速进入生长对数期。该菌株在0~24h时对ohhl的降解最快，菌株培养至32h，ohhl完全分解。对照中ohhl24h内的自然降解率不到40%。结果表明，中间苍白杆菌d-2对ohhl有显著且快速的降解作用，在防治ohhl介导的致病菌危害方面有巨大的应用潜力。实施例5菌株d-2对马铃薯软腐病的的生防效果研究本实施例以引起马铃薯软腐病的病原菌胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种（pectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovora,pcc）z3-3（刘春妍，郭松，艾力·吐热克，等.不动杆菌属中aide基因编码高丝氨酸内酯酶[j].生物工程学报，2017，33(9)：1625-1639.）为例，研究菌株d-2对依赖ahls致病的致病菌的生防效果。接种试验中，淬灭菌d-2、大肠杆菌e.coli、苏云金芽孢杆菌b23均为安全不致病的菌种。1、苏云金芽孢杆菌b23、大肠杆菌e.coli、菌株d-2、胡萝卜软腐果胶杆菌z3-3划线于lb固体平板上，30℃培养。分别挑取平板上的单菌落，接种至液体lb培养基中，以30℃、200rpm的条件过夜培养，得到菌液。用液体lb将b23、e.coli、菌株d-2和致病菌z3-3的菌液调整至1.0×107cfu·ml-1。将z3-3分别与b23、e.coli、d-2和液体lb培养基以一定比例混合，并将5μl混合菌液分别接种至马铃薯上。即分别设置lb+z3-3、z3-3+e.coli、z3-3+b23、z3-3+d-2，四个实验组。将接种好的马铃薯放置在28℃生化培养箱，24h后观察其发病情况并拍照。2、结果如图7所示，z3-3+lb和z3-3+e.coli实验组的马铃薯块茎病斑面积较z3-3+b23和z3-3+d2实验组的马铃薯发病面积明显较大，发病较为严重。即淬灭菌d-2与致病菌共同接种较单独接种致病菌时软腐病病害症状明显减轻。实验结果表明，菌株d-2对果胶杆菌z3-3引起的马铃薯软腐病具有较好的生物防治效果。实施例6菌株d-2对胡萝卜软腐病的的生防效果研究本实施例以引起胡萝卜软腐病的病原菌胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种（pectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovora,pcc）z3-3（刘春妍，郭松，艾力·吐热克，等.不动杆菌属中aide基因编码高丝氨酸内酯酶[j].生物工程学报，2017，33(9)：1625-1639.）为例，研究菌株d-2对依赖ahls致病的致病菌的生防效果。1、苏云金芽孢杆菌b23、大肠杆菌e.coli、菌株d-2、胡萝卜软腐果胶杆菌z3-3划线于lb固体平板上，30℃培养。分别挑取平板上的单菌落，接种至液体lb培养基中，以30℃、200rpm的条件过夜培养，得到菌液。用液体lb将b23、e.coli、菌株d-2和致病菌z3-3的菌液调整至1.0×107cfu·ml-1。将z3-3分别与b23、e.coli、d-2和液体lb培养基以一定比例混合，并将5μl混合菌液分别接种至胡萝卜肉质根切片上。即分别设置lb+z3-3、z3-3+e.coli、z3-3+b23、z3-3+d-2，四个实验组。将接种好的胡萝卜切片放置在28℃生化培养箱，24h后观察其发病情况并拍照。2、结果如图8所示，z3-3+lb和z3-3+e.coli实验组的胡萝卜肉质根的植物组织已经腐烂，而z3-3+b23和z3-3+d2实验组的胡萝卜肉质根只出现水渍状病斑，未出现植物组织腐烂的症状，即淬灭菌d-2与致病菌z3-3共同接种较单独接种致病菌z3-3时胡萝卜软腐病病害症状明显减轻。实验结果表明，淬灭菌d-2对果胶杆菌z3-3引起的胡萝卜肉质根软腐病具有较好的生物防治效果。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12