一种高毒力蝗绿僵菌工程菌株及其构建方法与流程

本发明属于基因工程
技术领域：
，具体涉及利用基因工程方法改良获得一种高毒力蝗绿僵菌工程菌株。
背景技术：
：昆虫病原真菌是最重要的杀虫微生物类群，具有专一性、安全性、不会使昆虫产生抗性等优点，可形成广泛且持续的控害作用，因此是最具潜力的生物农药。绿僵菌(metarhiziumacridum)是最早用于防治害虫的昆虫病原真菌，利用它来防治害虫的研究与实践已愈百年。迄今，国内外已登记的绿僵菌杀虫剂产品有100多种，在非洲、澳大利亚、巴西以及中国等国家已用在农林害虫防治方面(aschranketal.,2010，jovebioengineering.,56:1267-1274)。自上世纪90年代，利用绿僵菌防治蝗虫取得重大突破，被世界卫生组织推荐为防治蝗虫的重要生物农药，目前在国际上广泛应用，我国2003年也成功开发出防治东亚飞蝗的杀蝗绿僵菌。但是，在其实际应用中，杀虫真菌农药存在杀虫慢，防效低的问题，这严重地制约了其广泛应用。所以选育高毒力的杀虫真菌菌株成为杀虫真菌研究的重点。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种高毒力蝗绿僵菌工程菌，所述蝗绿僵菌工程菌为蝗绿僵菌敲除了腺苷酸形成还原酶adenylate-formingreductases(afr)基因的工程菌株。上述蝗绿僵菌采用蝗绿僵菌cqma102菌株，上述afr基因为蝗绿僵菌cqma102菌株的基因，cdna的序列为seqidno.9所示。上述蝗绿僵菌cqma102菌株保存在中国普通微生物保藏中心，其登录号为cgmccno.0877，已申请授权，专利授权公告号cn1216144c。进一步优选地，上述蝗绿僵菌工程菌中，所敲除的afr基因被由afr基因的上游同源臂，标记基因以及afr基因的下游同源臂组成的重组基因所代替，上述标记基因可优先采用草铵膦标记bar基因。上述蝗绿僵菌工程菌在制备杀虫剂中的应用。本发明另一目的在于提供一种杀虫效果好的杀虫菌剂。一种杀虫菌剂，它的活性成分是高毒力的蝗绿僵菌工程菌，所述蝗绿僵菌工程菌为蝗绿僵菌敲除了腺苷酸形成还原酶adenylate-formingrductases(afr)基因的重组菌。优选地说，上述杀虫菌剂中蝗绿僵菌采用蝗绿僵菌cqma102菌株，所敲除的afr基因为蝗绿僵cqma102菌株的基因，cdna的序列为seqidno.9所示。进一步优选地，上述蝗绿僵菌工程菌中，所敲除的afr基因被由afr基因的上游同源臂，标记基因以及afr基因的下游同源臂组成的重组基因所代替，上述标记基因可优选采用草铵膦标记bar基因。本发明的又一目的在于提供上述高毒力蝗绿僵菌工程菌株的构建方法。上述构建方法，其特征在于，包括如下步骤进行：1)pk2-pb-maafr-l/r重组质粒的构建根据蝗绿僵菌基因组序列设计pcr引物，扩增出腺苷酸形成还原酶蛋白编码基因的上、下游重组臂，并纯化扩增产物，上游同源重组臂为seqidno.10所示，下游同源重组臂为seqidno.11所示，酶切载体质粒pk2-pb并纯化线性质粒，上游重组臂片段与线性质粒在重组酶中进行一步克隆，重组产物至大肠杆菌感受态dh5α，得到pk2-pb-maafr-l/r重组质粒；2)回复载体(pk2-maafr-sur::egfp)的构建从蝗绿僵菌基因组中扩增带有maafr自身启动子与编码区的序列，maafr的cdna的序列为seqidno.9所示，与pk2-sur::egfp载体使用一步克隆的方法进行连接；3)农杆菌的转化以及与蝗绿僵菌的共培养将pk2-pb-maafr-l/r的质粒转化农杆菌后与蝗绿僵菌的共培养发生同源重组，回复转化使用δmaafr蝗绿僵菌孢子；4)蝗绿僵菌转化子的筛选经pcr初步验证转化子及southernblot验证得到蝗绿僵菌maafr基因敲除突变株以及回复菌株。本发明获得的有益效果：本发明提供一种高毒力蝗绿僵菌工程菌株及其构建方，所述工程菌为蝗绿僵菌cqma102敲除腺苷酸形成还原酶adenylate-formingreductases(afr)基因后的工程菌株，maafr为新发现的毒力基因，将敲除菌点滴接种的蝗虫在7天死亡率达到100％，而野生型以及回复菌株点滴的蝗虫死亡率约60％，直到第10天才达到100％，敲除菌株相较于野生型以及回复菌株对蝗虫的半致死时间提前1天左右，经蝗虫生测试验结果表明其半致死率较野生型菌株提高了1天，对进一步挖掘昆虫病原真菌侵染致病的分子机理以及增强菌株可用性十分重要，同时提供了一种新型的杀虫菌剂。附图说明图1：a为腺maafr除载体构建示意图，b为回复载体构建示意图。图2：maafr基因敲除菌株和回复菌株的southernblot验证结果。图3：蝗虫生物测定试验十天内蝗虫致死率。图4：为蝗虫生物测定试验蝗虫半致死时间。具体实施方式实施例1pk2-pb-maafr-l/r重组质粒的构建(1)上下游基因同源臂的扩增根据蝗绿僵菌基因组序列设计pcr引物，所述蝗绿僵菌是由重庆大学杀虫真菌生物农药工程技术研究中心提供，此菌株保存在中国普通微生物保藏中心，其登录号为cgmccno.0877，专利授权号cn1216144c，引物碱基序列lf为seqidno.1所示，lr为seqidno.2所示，rf为seqidno.3所示，rr为seqidno.4所示。maafr的cdna的序列为seqidno.9所示。以蝗绿僵菌基因组为模板，引物分别用lf、lr一组和rf、rr一组，扩增出腺苷酸形成还原酶蛋白编码基因的上、下游重组臂，并纯化扩增产物，上游同源重组臂为seqidno.10所示，下游同源重组臂为seqidno.11所示。按照下列体系加样：rtaqdnapolymerase0.3μl10×labuffer(mg2+plus)5μldntps0.5μlforwardprimer(10μm)1μlreverseprimer(10μm)1μlcdna模板1μlddh2o11.5μl终体积20μl加样完成后离心混匀样品，于pcr仪中按照下列程序进行反应：(2)酶切载体质粒提取带有载体质粒pk2-pb的大肠杆菌质粒，pk2-pb载体是pan52-1载体(购自广州拓飞生物科技有限公司)构建而来由本实验室保存，以构巢曲霉基因组dna为模板对ptrpc启动子及其所控制的草铵膦标记bar基因序列进行融合pcr扩增，扩增引物见seqidno.14，seqidno.15，seqidno.16，seqidno.17，将pan52-1与扩增片段分别用bamhi和ecorv(takara，日本)进行双酶切，使用t4连接酶(takara，日本)进行连接得到pk2-pb载体。使用hindiii和xbai酶切载体质粒pk2-pb并纯化线性质粒。(3)质粒与同源臂的连接将4μl上游重组臂片段与1μl线性质粒在重组酶中进行一步克隆：体系如下：novorec10x重组缓冲液1μgnovorec重组酶0.5μl线性化载体(＞15ng/μl)nμl插入片段nμlddh2oupto10μl终体积10μl线性化载体以及插入片段比例可登录www.sinobio.net在线计算，混匀后在37℃放置20-40分钟，得到重组产物。(4)转化大肠杆菌感受态取5μl重组产物至50μl大肠杆菌感受态dh5α(北京鼎国公司购买)中，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴2min，加入800μllb液体培养基在37℃、220rpm恒温振荡器中培养1h。取50μl菌液涂布于含有卡那霉素的lb培养基上，37℃培养18h。挑取单菌落进行pcr验证。下游重组臂用ecori与ecorv酶切上述质粒并相同方法连接下游重组臂到载体上。得到pk2-pb-maafr-l/r重组质粒，原理如图1a所示。实施例2回复载体(pk2-sur-maafr-egfp)的构建表达载体pk2-sur::egfp是载体pan52-1(购自广州拓飞生物科技有限公司)构建而来由本实验室保存，先将稻瘟病菌基因组dna为模板对其乙酰乳酸合成酶(赋予氯嘧磺隆抗性)进行扩增，扩增引物见seqidno.18，seqidno.19，将pan52-1和扩增产物用bamhi和ecorv进行双酶切，回收产物后用t4连接酶进行连接，得到pk2-sur载体；egfp(绿色荧光蛋白，作为标记筛选转化子，购自广州拓飞生物科技有限公司)序列来自于以载体质粒pegfp-c1为模板对其egfp部分进行扩增，扩增引物见：seqidno.20，seqidno.21，使用psti以及hindiii(takara，日本)对pk2-sur载体以及pcr产物进行双酶切，回收产物后用t4连接酶进行连接，得到pk2-sur::egfp表达载体。pk2-sur-maafr-egfp构建方法：从蝗绿僵菌基因组中扩增带有maafr自身启动子与编码区的序列，maafr的cdna的序列为seqidno.9所示，与pk2-sur::egfp载体使用一步克隆的方法进行连接。具体步骤如下：(1)maafr回复引物设计取蝗绿僵菌基因组中包含maafr起始密码子atg上游3000bp(即包含目的基因启动子区，在ncbi中检测是否有其它基因)到终止密码子taa的所有序列。用软件primerpremier5，设计回复引物cf/cr(分别在上下游引物5′添加18bp及19bp的载体接头及hindiii/bamhi识别序列)，cf为seqidno.5所示，rr为seqidno.6所示。引物设计与原则是上游引物cf在atg上游1000bp～2500bp，且不破坏相邻基因编码区，下游引物cr位于终止密码子之前。(2)maafr回复片段扩增，pcr扩增反应体系：phusiondna聚合酶0.25μl5×phusionbuffer4μlmaafr-ff/fr各1μltemplate1μldntps0.5μlddh2o12.5μl终体积20μlpcr程序：预变性(98℃，30s)，1个循环；变性-退火-延伸(98℃，10s；57℃，20s；72℃，3min)，35个循环；再延伸(72℃，10min)，1个循环；16℃，10min。取2μlpcr扩增产物，于1％的琼脂糖凝胶上进行电泳验证，条带正确后使用纯化试剂盒回收pcr产物。(3)酶切回复载体质粒用hindiii/bamhi酶切回复载体质粒pk2-sur::egfp。酶切体系：pk2-sur::egfp载体质粒1μghindiii1μlbamhi1μl10×fastdigestbuffer3μlddh2oupto10μl终体积10μl样品混匀，37℃处理1h，纯化回收酶切开后的载体质粒pk2-sur::egfp，将回复片段和酶切后载体用novorec重组酶(novoprotein，美国)连接，连接产物为pk2-sur-maafr-egfp。连接体系：novorec重组酶1μl载体pk2-sur::egfp酶切产物3μlmaafr回复片段5μlnovorec10×重组缓冲液1μl终体积10μl样品混匀，37℃处理40min，将连接产物转化大肠杆菌，通过菌落pcr及酶切验证得到pk2-sur-maafr-egfp阳性转化子，提取质粒备用。构建方法如图1b所示。实施例3农杆菌的转化以及与蝗绿僵菌的共培养(1)电转化农杆菌将5μlpk2-pb-maafr-l/r的质粒置于50μl农杆菌(博大泰克生物公司购买)感受态中，冰浴5min，用移液枪轻地混匀后转至电杯中，用电穿孔转化仪(电压2.5kv，电阻400ω)转化农杆菌，加入800μllb液体培养基后，混匀后一起转入1.5ml离心管中于28℃，220rpm摇床培养4h，取4μl涂布于lk培养基，菌落培养基，菌落pcr验证出阳性转化子。(2)农杆菌与蝗绿僵菌共培养①将转化农杆菌成功的阳性落接种于20mllk(lb+卡那霉素)液体培养基中，摇床28℃，250rpm培养约16h至od660约为0.6-1.0为佳；②收集菌体：取4个灭菌的2ml离心管，分别加入1.5ml菌液，10000rpm离心1min，弃去上清；③重悬菌体：每管分别加入250μl(含有200μm乙酰丁香酮)的nim液体培养基，重悬菌体合后并成1管，测定od660。[a]＝od660测定值×10；④调整菌体浓度为od660＝0.15，取出，取出[b]ml菌液加入到10ml(含有200μm乙酰丁香酮)nim液体培养基的灭菌三角瓶中，根据公式液体培养基的灭菌三角瓶中，根据公式液体培养基的灭菌三角瓶中，根据公式[b]＝(0.15×10)/[a]，使其最终为0.15；在28℃下，250rpm，避光摇瓶培养6～8h，至od660＝0.5-0.7；⑤用nim液体培养基培养基(含有200μm乙酰丁香酮)配置野生型蝗绿僵菌cqma102孢悬液(1×106个/ml)，回复转化使用δmaafr蝗绿僵菌cqma102孢子；⑥将避光培养好的农杆菌与配制的蝗绿僵菌cqma102孢悬液等体积混合，取100μl混合菌液涂布于铺有转化膜的nim(100ml固体/100μlas)培养基，28℃培养箱倒置避光养48h；⑦2天后，将膜转至查氏平板(80μg/mlppt)上，28℃培养箱倒置培养至单菌落长出(一般为7-10天)。实施例4蝗绿僵菌转化子的筛选(1)蝗绿僵菌基因组的微量提取研磨敲除及回复转化子的样品；加入400μllysisbuffer(裂解缓冲液)，混匀37℃处理30min；加入150μl预冷的3m醋酸钾溶液，冰浴10min，12000rpm离心10min，弃上清；加入等体积预冷的异丙醇，冰浴30min后12000rpm离心5min，弃上清；加入500μl现配的70％乙醇洗涤，12000rpm离心1min，弃上清，直到晾干；加入30μl灭菌ddh2o溶解dna，用于转化子的初步筛选。(2)pcr初步验证转化子，以maafr上游1000-1500bp选取验证引物vf，vf为seqidno.12所示，pt-r2为载体上的通用引物pt-r2为seqidno.13所示，以提取的各转化子基因组为模板，pcr扩增反应体系：phusiondna聚合酶0.25μl5×phusionbuffer4μlvf/pt-r2各1μltemplate1μldntps0.5μlddh2o12.5μl终体积20μl(3)southernblot验证转化子①设计探针：分析maafr序列，设计探针引物pf序列如seqidno.7，pr序列如seqidno.8，扩增探针，电泳检测正确后对探针进行纯化回收和标记(取5μg探针，98℃处理10min，4℃处理10min，按southern杂交试剂盒的说明标记探针)，再次纯化标记后的探针用于杂交实验。②基因组提取：接种适量待验证菌株的蝗绿僵菌孢子于1/4sday液体培养基中，250rpm，28℃恒温震荡3d，抽滤，提取高质量菌丝基因组。③酶切处理：分析maafr序列选取合适的酶切位点，酶切体系：蝗绿僵菌cqma102、δmaafr、回复株基因组7μgsaci3μlxhoi3μl10×fastdigestbuffer6μlddh2oupto60μl总体积60μl37℃处理30min，电泳检测酶切效果，如果酶切不完全，则每30min检测一次并观察，直至基因组无明显主条带且自上而下呈弥散状分布。④分离酶切基因组：制一块1％琼脂糖凝胶(无核酸染料)，取完全酶切的样品加入4μl的6×loadingbuffer，混匀后点入琼脂糖凝胶孔，电压90v，电泳1h(电泳槽置于冰水浴环境)。在凝胶电泳成像系统下观察并对照marker切除多余凝胶，保留含有目的条带的位置(marker中需添加核酸染料)。⑤凝胶变性(室温水平摇床上进行)：1)用ddh2o缓慢冲洗④中的凝胶。2)变性缓冲液浸泡凝胶，80rpm/min，30min/次，2次，使dna变性。3)弃变性液，用ddh2o洗涤凝胶，80rpm/min，10min/次，2次，去除残留变性液；4)弃ddh2o，用中和缓冲液中和凝胶，80rpm/min，15min/次，2次；5)弃中和缓冲液，用适量20×ssc溶液使dna彻底变性，80rpm/min，10min。⑥dna的转移及固定1)取一张滤纸(12×25cm)用20×ssc溶液浸湿，平铺在作为支撑平台的干净玻璃板上，滤纸两端浸入20×ssc溶液中，去除滤纸和玻璃板之间的气泡，形成滤纸“桥”，滤纸上放一张比凝胶长宽各略大1cm的滤纸；2)将凝胶倒置于上层滤纸上，切掉凝胶一角作标记，用玻璃棒反复碾压赶走气泡；裁剪1张与凝胶大小相同的immobilon-ny+尼龙膜，20×ssc溶液浸湿后放在凝胶上，用玻璃棒赶走气泡；用塑料隔板在凝胶周围封闭，防止液流的短路；3)取3张与凝胶大小相同的滤纸，20×ssc溶液浸湿后放在尼龙膜上，玻璃棒赶走气泡；4)取适量与凝胶大小相同的吸水纸，平铺在3层滤纸之上，其上置一约0.5kg的实体重物；5)在20×ssc溶液中转移约48h，期间每隔12h更换一次吸水纸(不要更换紧挨滤纸的几层吸水纸)，以保证凝胶中的基因组完全转移；6)转移完成后，取尼龙膜用2×ssc缓冲液在水平摇床上冲洗，120rpm/min，10min。用3层滤纸轻轻包裹尼龙膜，在120℃烘箱中烘烤30min，以固定膜上的基因组。⑦预杂交与杂交1)将⑥中dna固定后的尼龙膜放入杂交管中(有dna的面朝向管内)，管内加入10ml的杂交液(试剂盒中的7号液)，放入杂交炉中40℃预杂交2h；2)取10μl纯化并标记后的探针98℃处理10min，4℃处理10min，待用；3)弃1)中液体，重新加入10ml的杂交液，加入2)中处理好的探针，杂交炉中40℃杂交20h以上。⑧洗膜、显色1)倒出杂交瓶中的杂交液(-20℃保存，以备下次使用)，将30ml65℃预热的2×ssc+0.1％sds溶液倒入杂交瓶中，入杂交炉65℃洗涤10min，重复1次；2)弃1)中溶液，将30ml的65℃预热0.1×ssc+0.1％sds溶液倒入杂交管，入杂交炉65℃杂交15min，重复2次；3)弃2)中液体，将尼龙膜移至水平摇床上的平皿中，加入20ml洗涤缓冲液，80rpm/min，室温洗涤20min；4)弃3)中液体，加入50ml封阻缓冲液，80rpm/min，室温封阻30min；5)弃4)中液体，加入20ml二抗孵育缓冲液，80rpm/min，室温杂交30min；6)弃5)中液体，加入100ml洗涤缓冲液，80rpm/min，室温洗涤20min，重复1次；7)弃6)中液体，加入20ml检测缓冲液，80rpm/min，室温震荡10min；8)室温下避光加入10ml显色液(200μl的5号液加10ml检测缓冲液)，显色1h左右，30min观察一次，当膜上出现明显条带时停止显色，ddh2o冲洗尼龙膜，晾干后扫描并保存结果，结果如图2所示，通过saci以及xhoi双酶切基因组，野生型cqma102杂交得到的片段为4524bp，敲除转化子为1165bp，回复转化子同时具有两条带，所得敲除、回复转化子均正确。实施5蝗虫生物测定实验用石蜡油配制野生型、maafr敲除和回复菌株的孢悬液敲除和回复菌株的孢悬液(浓度为1×107个/ml)，在东亚飞蝗(五龄虫)背板上点滴5μl孢悬液，30头/组，3组/样本，并放置于28℃光照培养箱中，光照16遮光8h，并保持其相对湿度30％-45％，喂养新鲜的玉米叶片。从第三天开始统计虫子的死亡数。注意：用石蜡油点滴蝗虫作为空白对照，实验重复三次。按上述试验方法进行蝗虫体表点滴毒力测定试验，如图3蝗虫生物测定试验十天内蝗虫致死率和图4蝗虫生物测定试验蝗虫半致死时间所示，敲除maafr后点滴接种的蝗虫在7天死亡率达到100％，而野生型以及回复菌株点滴的蝗虫死亡率约60％，直到第10天才达到100％，通过计算得到敲除菌株相较于野生型以及回复菌株对蝗虫的半致死时间提前1天左右。结果表明：敲除蝗绿僵菌maafr后蝗绿僵菌毒力显著提高。<110>重庆大学<120>一种高毒力蝗绿僵菌工程菌株及其构建方法<160>21<170>patentinversion3.1<210>1<211>38<212>dna<213>人工序列<400>1gacggccagtgccaagctatagagggattgtccgttgt38<210>2<211>40<212>dna<213>人工序列<400>2cggatccctcgagtctagaatgggtagtagttggagaaga40<210>3<211>34<212>dna<213>人工序列<400>3gctggccgcccatgggatccccaaactctattcg34<210>4<211>34<212>dna<213>人工序列<400>4atgacatgattacgaatttcctcccactcaagca34<210>5<211>38<212>dna<213>人工序列<400>5gacggccagtgccaagctttcaagtgcgagcagagatc38<210>6<211>39<212>dna<213>人工序列<400>6ccttgctcaccatggatccactatcccagatggctccat39<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列<400>7taccctgctcagctccctcc20<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列<400>8acatcctagtctgatactgg20<210>9<211>2778<212>dna<213>metarhiziumacridumcqma102<400>9atgaacgactctaggaaacctcataccatgatcctgcctacaagggacttcacccacggt60gaagcatcgtattgtcccttccctacagtcactgcagccttctttcactatgctgcggct120attccctcagccaaggctgttagagacttgtctgctaatacagaaagggcgcttacatat180cgggagctagccatccatgtgcagtcacttgcgtcacggctgcggaggatgggcgtgggc240cctcaccaaacagtcccactggttgtcaagcgaggggctgagatggtgattggtatattg300gccatattgtcctgtggtgcacagtatgtgcctctcgatggcggagtcgtcccggattct360acgatcaagcttgttgcggagcagtgcggcgggcagaatgttgtctgtataacatcaacg420gaagaccgcatcaaaaagctcttgcctacgcacagccccatagttgttgagcagactcca480gttgaggatcaagaatatgatgctccagagtcttgggttgatcttgcgtctgctgacggt540ggatgctacgtcatctatacctctgctgcttgggagattttctcgtgtctttgcaatggc600ggcacgctcgttctgagaggctccaagtgggagcctactgttcgacagcttgacgtattc660atttgcacacccaccatcttgtcaaagtaccatccaaaactgtatcccaacatcaaagtt720gtcgcaaccgctggagaacccacctctcaggatctggccgatctctgggcaacacatgca780acgtattggaactgttgtggacccacggaaactaccattgtcaacacaatgtcgaagcat840gtcgctggtgaccctatttccattggccggccgactcccaacaactcggtttacatttta900gacaatgacggcagacccgtacctgtgggtgtggctggtgtgatgtgggcaggcggccac960ggcgtcactcgtggctacgtggggcttgaatccaagacaaaggaaacgtacattccagat1020ccgttcgcaaatgacggagtggacgatcaggtcaaggtcaagg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