一种棘孢曲霉菌株及其应用的制作方法

本发明属于植物保护技术领域，具体涉及一种棘孢曲霉菌株及其应用，本发明与蔬菜土传病害生物防治领域相关。

背景技术：

我国设施蔬菜产业发展迅速，2014年全国设施蔬菜面积超过380万hm²(5700万亩)，蔬菜生产方式得到进一步丰富，对于保障蔬菜周年供应和调整蔬菜品种结构意义重大。与露地栽培相比，设施栽培棚室湿度高、轮作倒茬困难，为病虫害的发生流行提供了有利条件。设施地土壤的次生盐渍化、酸化，土壤养分失衡，土传病害严重，造成蔬菜产量下降、品质恶劣，严重制约了设施蔬菜生产的可持续发展。

对设施蔬菜基地调查结果表明，猝倒病、立枯病、枯萎病、根腐病、黄萎病、青枯病、根结线虫等土传病害呈加重趋势。目前，针对这些病害主要以化学防治为主，但化学农药的长期和过量使用会导致生态环境破坏、次要病害猖獗、蔬菜农药残留超标等问题，直接影响了设施蔬菜的产量和品质，生物防治是一种环境友好且能够有效防治植物病害的方法，已成为继农业防治、化学防治之后的又一重要防治方法，并且有修复土壤生物多样性的作用，极具开发潜力。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，为了解决设施蔬菜土传病害化学防治中的环境安全问题，提供一种分离的棘孢曲霉菌株及其在土传病害防治中的应用。

本发明的技术方案如下所述：

申请人于2017年7月，在中国.湖北省.武汉市.武汉市农业科学院武湖蔬菜基地土传病害发生严重的地块，从设施蔬菜作物根际土壤中分离筛选得到一种拮抗真菌，申请人将该菌株命名为棘孢曲霉aa19，aspergillusaculeatusaa19，于2018年9月21日送中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(cctcc)保藏，保藏编号为cctccno：m2018648。

棘孢曲霉aa19的菌学特征：

棘孢曲霉aa19菌株在pda培养基平板上生长迅速，28℃培养5d菌落直径达6cm，质地紧密，呈丝绒状，气生菌丝较多，中心下凹、四周突起、边缘平坦、中心呈黑色、边缘白色、背面平坦呈放射状，背面中心呈黄色四周白色，菌落表面有黑色干粉，无渗出液，顶囊初生时呈球形或辐射状，后呈球形或椭圆形，直径50-65μm，孢梗茎无色或淡褐糙有刺突，直径约5μm，串生于小梗顶端，小梗单层，全部表面可育。

上述分离的棘孢曲霉aa19菌株可在防治设施蔬菜土传病害豇豆枯萎病中应用。

本发明还提供了棘孢曲霉aa19在防治设施蔬菜土传病害豇豆枯萎病中应用的具体步骤，所述的步骤包括：

a.以豇豆枯萎病菌jws-1作为指示菌

用于检测豇豆枯萎病的指示菌为豇豆枯萎病菌(fusariumoxysporumschl.)jws-1，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m2014314；

b、棘孢曲霉aa19的拮抗活性稳定性的测定

在pda培养基平板上对保藏编号为cctccno：m2018648的棘孢曲霉aa19进行了连续10代的继代培养，以豇豆枯萎病菌jws-1为指示菌，采用平板对峙法测定棘孢曲霉aa19拮抗活性的稳定性；

c、棘孢曲霉菌株aa19孢子悬浮液活性的测定

取培养好的棘孢曲霉aa19斜面菌种，加入5ml无菌水，轻轻将琼脂表面的孢子刮下，将该孢子悬液移入20ml已灭菌的塑料管内，充分振荡混匀后，用无菌纱布过滤，并用无菌水冲洗滤渣2-3次，最终使滤液达到10ml，即为10^-1孢子悬液，血球计数法在显微镜下检查孢子数，并将其依次稀释为10^-2、10^-3、10^-4、10^-5，分别吸取100μl稀释液涂于pda培养基平板上，在平板的中央接种指示菌豇豆枯萎病菌jws-1，以仅接豇豆枯萎病菌jws-1为对照，每处理3次重复，28℃恒温培养5d，测量菌落直径，明确棘孢曲霉aa19孢子悬浮液活性；

d、棘孢曲霉aa19发酵滤液活性的测定

用无菌接种环挑取一环在斜面上培养的棘孢曲霉aa19菌丝，接种于50ml的pd培养基，180rpm/min、28℃恒温振荡培养5d，用四层无菌纱布过滤后，分别取100μl均匀涂布在pda培养基平板上，在平板的中央接种指示菌豇豆枯萎病菌jws-1，以仅接种指示菌豇豆枯萎病菌jws-1为对照，每处理3次重复，28℃恒温培养5d，测量菌落直径，明确棘孢曲霉aa19发酵滤液活性；

e、活体盆栽

将种子用55℃温水浸泡30min，清水清洗干净后播种，当幼苗长齐2片真叶时拔出，抖落根部土壤，用清水冲洗干净根系，剪去根尖部分，浸入含孢子2.05×10⁷cfu/ml豇豆枯萎病菌jws-1菌液中30min，再移植到营养钵内，置于大棚内培养，在接种病原菌7d后做如下处理：用棘孢曲霉aa19发酵滤液(7.20×10⁷cfu/ml)灌根8ml/株，以清水灌根8ml/株为对照，7d后进行第1次调查，14d后进行第2次调查(在第1次调查结束后及时进行第2次灌根处理)；

每处理3次重复，每重复10株，按时统计幼苗发病情况，按病情分级(参照张衍荣等，2005年报道)，计算病情指数和防治效果，计算公式如下；

pda培养基及制备方法：去皮马铃薯200g，切成厚约2mm的片，加入1000ml蒸馏水煮沸30min，用4层纱布过滤，向滤液中加入葡萄糖20g和琼脂20g，加热溶解后再补足蒸馏水至1000ml，自然ph，在121℃湿热蒸汽下高压灭菌30min，之后在超净工作台上倒平板，得到pda培养基；

pd培养基及制备方法：称取200g马铃薯，洗净去皮切片，加水1000ml煮沸15min，纱布过滤后加蒸馏水补足至1000ml，再加12g葡萄糖，煮沸至固体充分溶解后分装到三角瓶中，于121℃湿热蒸汽下高压灭菌20min，得到pd培养基。

本发明具有以下有益效果：

1、棘孢曲霉aa19从设施蔬菜根际土壤分离获得，对蔬菜作物安全，且对豇豆枯萎病具有防治作用，可用于设施蔬菜土传病害的防治。

2、棘孢曲霉aa19稳定性好，防效较高，连续10代继代培养对豇豆枯萎病菌jws-1抑菌效果稳定在68％以上，田间盆栽防效达到69.43％，适合设施蔬菜土传病害防治要求。

3、棘孢曲霉aa19防治设施蔬菜土传病害，使用方法简单，只需将菌株进行发酵培养，然后取发酵滤液对作物灌根即可，使用方便。

附图说明

序列表seqidno:1是棘孢曲霉aa19的18srdna序列。

图1：棘孢曲霉aa19菌落形态及分生孢子和分生孢子梗形态。

图2：棘孢曲霉aa19的18srdna-its系统发育树。

图3：棘孢曲霉aa19发酵滤液对豇豆枯萎病的防治效果。附图标记说明：图3中的a为棘孢曲霉aa19发酵滤液处理组；图3中的b为对照组(仅接种指示菌豇豆枯萎病菌jws-1)。

具体实施方式

实施例1候选菌株的分离与鉴定

a、土样的采集

2017年7月在中国.湖北省.武汉市.武汉市农业科学院武湖基地土传病害发生严重的地块，采用5点取样法，取地下15-20cm处土样，采集设施蔬菜作物根际土壤，自然风干后保存备用；

b、候选菌株的分离纯化

称取5g土样倒入三角瓶中，加无菌水至50ml，28℃振荡30min后静置，即为10^-1土壤悬液；再从上述溶液中取出1ml，加入9ml无菌水充分振荡制成10^-2的土壤稀释液，吸取100μl稀释液涂于马丁氏培养基(配方：葡萄糖10g，蛋白胨5g，k2hpo41g，mgso4·7h2o0.5g，孟加拉红0.03g，琼脂20g，加蒸馏水定容至1l，自然ph，分装后121℃湿热蒸汽下高压灭菌30min)，使用时每ml培养基中加入30μg链霉素以抑制放线菌生长，置于28℃培养箱中培养，生长5天后挑取单菌落于培养基上，进行分离纯化，4℃保存备用；

c、候选菌株形态学观察

将候选菌株接种到pda培养基平板上，置于28℃恒温培养，观察菌落形态和颜色，5d后制作玻片在光学显微镜下观察分生孢子及分生孢子梗的形态特征。

菌学特征：

候选菌株在pda培养基平板上，生长迅速，28℃培养5d菌落直径达6cm，质地紧密，呈丝绒状，气生菌丝较多，中心下凹、四周突起、边缘平坦、中心呈黑色、边缘白色、背面平坦呈放射状，背面中心呈黄色四周白色，菌落表面有黑色干粉，无渗出液，顶囊初生时呈球形或辐射状，后呈球形或椭圆形，直径50-65μm，孢梗茎无色或淡褐糙有刺突，直径约5μm，串生于小梗顶端，小梗单层，全部表面可育。

d、菌丝收集

用接种针挑取少量候选菌株的菌丝，在无菌条件下接种至装有100mlpd培养基的三角瓶内，于28℃，180rpm/min下振荡培养4d，取10ml上述菌液至无菌离心管内，于13000rpm/min离心10min，弃上清收集菌丝备用。

e、基因组dna的提取

采用omegahpfugaldnakit试剂盒提取候选菌株基因组dna，利用通用引物its1/its4对候选菌株的18srdna的its片段进行扩增(pcr为常规方法)，引物序列为its1：5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’；its4：5’-tcctccgcttattgatatgc-3’(pcr方法为常用方法)。

f、测序

采用1.0％琼脂糖凝胶法对扩增产物进行检测，并用紫外凝胶成像系统进行拍照保存，将pcr扩增得到的产物直接送武汉擎科创新生物技术有限公司进行测序。

g、分子鉴定

将测序所得的序列在ncbiblast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)数据库中进行比对，确定待鉴定菌株(即候选菌株)的遗传来源，利用mega6.0.6软件与已知菌种its序列作序列同源性比较，并对检索获得的同源性较近的菌株采用邻接法(neighbor-joining,nj)构建系统发育树(boot-strap＝1000，见图2)，分析亲缘关系和系统发育，结合微生物形态分类鉴定，将分离株(即候选株)命名为棘孢曲霉aa19，aspergillusaculeatusaa19，于2018年9月21日送中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(cctcc)保藏，保藏编号为cctccno：m2018648。

实施例2棘孢曲霉aa19在防治设施蔬菜土传病害豇豆枯萎病中的应用

实施步骤如下所述：

a、棘孢曲霉aa19菌株的稳定性测定

在pda培养基平板上对筛选得到的棘孢曲霉aa19进行连续10代的继代培养，并每一代以豇豆枯萎病菌jws-1(jws-1于2014年7月3日送中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为cctccno：m2014314，该菌株已获中国发明专利授权，专利号为zl2014103340109，授权公告日为2016.02.17)为指示菌，利用平板对峙法测定棘孢曲霉aa19拮抗活性的稳定性；

结果表明，棘孢曲霉aa19连续10代培养对豇豆枯萎病菌jws-1的抑制率稳定在68％以上，结果见表1。

表1棘孢曲霉aa19的拮抗活性稳定性

b、棘孢曲霉aa19菌株孢子悬浮液活性测定

取培养好的棘孢曲霉aa19斜面菌种，加入5ml无菌水，轻轻将琼脂表面的孢子刮下，将该孢子悬液移入20ml已灭菌的塑料管内，充分振荡混匀后，用无菌纱布过滤，并用无菌水冲洗滤渣2-3次，最终使滤液达到10ml，即为10^-1孢子悬液，血球计数法在显微镜下检查孢子数，并将其依次稀释为10^-2、10^-3、10^-4、10^-5，分别吸取100μl稀释液涂于pda培养基平板上，中央接豇豆枯萎病菌jws-1，以仅接豇豆枯萎病菌jws-1为对照，每处理3次重复，28℃恒温培养5d，测量菌落直径；

结果表明，棘孢曲霉aa19孢子悬液对豇豆枯萎病菌jws-1的抑制作用随稀释倍数的增加而降低，由84.32％降至64.33％，在最低浓度时其抑制率均超过60％，具体数据见表2。

表2棘孢曲霉aa19孢子悬浮液活性

c、棘孢曲霉aa19菌株发酵滤液活性的测定

用无菌接种环挑取一环在斜面上培养的棘孢曲霉aa19菌丝，接种于50ml的pd培养基中，在180rpm/min，28℃恒温下振荡培养5d。用四层无菌纱布过滤后，分别取100μl均匀涂布在pda培养基平板上，在平板的中央接种指示菌豇豆枯萎病菌jws-1，以仅接豇豆枯萎病菌jws-1为对照，每处理3次重复，28℃恒温培养5d，测量菌落直径。

结果表明，棘孢曲霉aa19发酵滤液对豇豆枯萎病菌jws-1的抑制率为70.75％，结果见表3。

表3棘孢曲霉aa19发酵滤液对豇豆枯萎病菌的抑制作用

d、棘孢曲霉aa19活体盆栽试验

将市购豇豆种子用55℃温水浸泡30min，清水清洗干净后播种，当幼苗长齐2片真叶时拔出，抖落根部土壤，用清水冲洗，得到干净根系，剪去根尖部分，浸入含孢子数为2.05×10⁷cfu/ml豇豆枯萎病菌jws-1菌液中30min，再移植到营养钵内，置于大棚内培养，在接种豇豆枯萎病菌jws-1菌液7d后做如下处理：用棘孢曲霉aa19发酵滤液(7.20×10⁷cfu/ml)灌根8ml/株，以清水灌根8ml/株做为对照，7d后进行第1次调查，14d后进行第2次调查，在第1次调查结束后及时进行第2次灌根处理。

每处理3次重复，每重复10株。按时统计幼苗发病情况，按病情分级(参照张衍荣等，2005年报道)，计算病情指数和防治效果，公式如下；

豇豆枯萎病病情分级标准：(张衍荣等，2005年报道)

0级：无症状；

1级：胚轴或子叶出现轻微病症，但生长正常；

3级：胚轴或子叶出现明显坏死，或1片子叶黄化，影响生长；

5级：2片子叶黄化，或1片子叶枯死；

7级：2片子叶生长僵化，植株部分萎蔫或停止生长；

9级：整株萎蔫、倒伏或枯死；

采用浸根接种法测定棘孢曲霉aa19发酵滤液(7.20×10⁷cfu/ml)对豇豆枯萎病防效，结果表明，7d时对豇豆枯萎病的防治效果为100％，14d时为69.43％，具体数据见表4。

表4棘孢曲霉aa19发酵滤液对豇豆枯萎病的防效

本实施例验证表明，本发明得到的棘孢曲霉aa19具有较强的稳定性，较高的孢子悬浮液活性和发酵滤液的活性，防治设施蔬菜土传病害豇豆枯萎病具有积极效果。

序列表

<110>武汉友芹种苗技术有限公司

<120>一种棘孢曲霉菌株及其应用

<141>2018-09-28

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>630

<212>dna

<213>棘孢曲霉(aspergillusaculeatus)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(630)

<400>1

gagagccgggtcgggggggggaccctgcggagggatcattacggagaacttccgttaggg60

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