一株罗伊氏乳杆菌及其在蜜蜂养殖过程中的应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，涉及一株罗伊氏乳杆菌及其在蜜蜂养殖过程中的应用，具体涉及一种罗伊氏乳杆菌lp4菌株在蜜蜂养殖过程中的应用。

背景技术：

蜜蜂是一种常见的有益昆虫，属膜翅目、细腰亚目、针尾部、蜜蜂总科、蜜蜂科昆虫，它对人类的最大贡献在于其可为植物传花授粉，提高植物果实和种子的产量及质量，同时，其产生的蜂蜜、采集的花粉、分泌的蜂毒和蜂胶等在医学、农业、工业中都有重要的应用。蜜蜂作为一种高度社会性昆虫，其传染性疾病多呈现爆发性发生和混合性发生，表现为流行速度快、发病区域广、致死率强等特点，对蜂群威胁极大。为控制蜜蜂传染性疾病，目前仍多采用抗生素防治为主，且存在盲目用药，过量使用等现象，不仅导致肠道菌群微生态失衡，增强肠道微生物的耐药性，使一般药物无效，而且抗生素会在蜂产品中残留，降低蜂产品质量，影响消费者健康，减少养蜂场经济效益。因此，在蜜蜂养殖过程中，研发能够减少或替代抗生素使用、促进机体健康、提高成活率的产品，在蜜蜂产业中将具有广阔的应用前景。

微生态制剂是指通过改善动物肠道菌群生态平衡、促进营养物质消化吸收、增强免疫功能，以提高动物健康水平的微生物制剂产品。与抗生素相比，微生态制剂具有安全、无毒、无残留、无耐药性以及环境友好等优点，是饲用抗生素最具发展潜力的替代品。菌种即益生菌的种类，是微生态制剂发挥功能的基础，也是产品安全的首要保证，世界各国对此都有明确规定和严格管理。目前应用于动物生产中的益生菌主要有乳酸菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌等菌种，其中乳酸菌是指一类能利用碳水化合物产生大量乳酸的革兰氏阳性菌的总称。乳酸菌作为益生菌的重要种类，已在世界范围内被公认为gras(generallyrecognizedassafe)等级的微生物。

罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)属厚壁菌门、乳杆菌科、乳杆菌属。国内外研究证实，罗伊氏乳杆菌具有众多的益生功能和极高的安全性。2001年我国卫生部批准罗伊氏乳杆菌为可用于保健食品的益生菌菌种，2014年国家卫生计生委同意罗伊氏乳杆菌(菌株号dsm17938)用于婴幼儿食品。因此，筛选具有抑制致病菌增殖、对抗生素敏感、促进肠道微生态平衡、提高机体免疫力等益生功能的罗伊氏乳杆菌，将其作为微生态制剂饲喂蜜蜂，对于提高蜜蜂成活率，减少抗生素在蜜蜂养殖过程中的应用，保障蜂产品安全具有重要意义。

技术实现要素：

本发明提供了一种乳酸菌可作为微生态制剂添加到饲喂蜜蜂的糖水中，可达到改善蜜蜂肠道菌群平衡，增强蜜蜂机体免疫力，提高蜜蜂成活率和养殖企业经济效益的技术方法。

本发明的技术方案：

一株罗伊氏乳杆菌，该罗伊氏乳杆菌菌种于2018年7月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno.16043，分类命名为罗伊氏乳杆菌lp4，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101；该罗伊氏乳杆菌使用mrs琼脂培养基培养后，菌落形态呈圆形、乳白色、边缘整齐、表面光滑且隆起、不透明。

本发明中罗伊氏乳杆菌lp4是从云南省罗平县蜂农饲养、春季自由采食油菜花蜜的东方蜜蜂成年工蜂肠道内自主分离得到，该菌通过体外实验发现具有较好的抑菌活性，对多种抗生素敏感，将罗伊氏乳杆菌lp4按10⁸cfu/ml的量添加到饲喂蜜蜂的糖水中，能够改善蜜蜂肠道内的菌群微生态结构，增强蜜蜂肠道免疫力，提高蜜蜂存活率。

本发明的有益效果：

1.分离得到了具有良好益生特性的罗伊氏乳杆菌lp4；

2.将伊氏乳杆菌lp4(10⁸cfu/ml)添加到饲喂蜜蜂的糖水中，能够改善蜜蜂肠道内的菌群微生态结构，增强蜜蜂肠道免疫力，提高蜜蜂存活率；

3.减少抗生素在蜜蜂养殖过程中的应用，提高蜂产品的安全性。

附图说明

图1是饲喂罗伊氏乳杆菌lp4对东方蜜蜂成年工蜂死亡率的影响。

图2是饲喂罗伊氏乳杆菌lp4对东方蜜蜂成年工蜂肠道真菌数量的影响。

图3是饲喂罗伊氏乳杆菌lp4对东方蜜蜂成年工蜂肠道乳酸菌数量的影响。

图4是饲喂罗伊氏乳杆菌lp4对东方蜜蜂成年工蜂肠道细菌数量的影响。

图5是饲喂罗伊氏乳杆菌lp4对东方蜜蜂成年工蜂肠道肠球菌数量的影响。

图6是饲喂罗伊氏乳杆菌lp4对东方蜜蜂成年工蜂肠道abeacin类抗菌肽基因表达量的影响。

图7是饲喂罗伊氏乳杆菌lp4对东方蜜蜂成年工蜂肠道defensin类抗菌肽基因表达量的影响。

图8是饲喂罗伊氏乳杆菌lp4对东方蜜蜂成年工蜂肠道ppo类抗菌肽基因表达量的影响。

图中：不同的大写字母表示在同一实验天数，检测指标差异显著(p<0.05)。

具体实施方式

以下结合技术方案和附图，进一步说明本发明的具体实施方式。

实施例1：

罗伊氏乳杆菌lp4的筛选和鉴定

(一)罗伊氏乳杆菌lp4的筛选

(1)样品的采集

将从云南省罗平县随机捉取的东方蜜蜂健康成年工蜂放入50ml灭菌离心管中，接入二氧化碳至蜜蜂昏迷后，在超净工作台内固定好蜜蜂，使用镊子取出蜜蜂的肠道并转移入1.5ml灭菌离心管中，放入4℃冰箱保存备用，实验所用器材均用紫外灯与75％乙醇消毒。

(2)乳酸菌的筛选

在无菌条件下，取东方蜜蜂健康成年工蜂的肠道样品，加入到10ml的pbs中，匀浆5min后，按1％的比例接种到含0.1％维生素c的mrs肉汤培养基中，37℃厌氧培养18h。将富集后的培养液用无菌生理盐水进行梯度稀释，在碳酸钙-mrs固体培养基铺板，37℃厌氧培养24h，从平板中挑取溶钙圈大的疑似乳酸菌单菌落。

(二)罗伊氏乳杆菌lp4的鉴定

对从蜜蜂肠道中分离得到的疑似乳酸菌菌株进行分子生物学鉴定，具体方法为：(1)提取乳酸菌疑似菌株的基因组dna；(2)使用通用引物27f：5’-agagtttgatcctggctcag-3’和1492r：5’-tacggctaccttgttacgactt-3’进行16srdnapcr扩增。

表1pcr扩增体系

pcr反应条件：

对16srdna扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳，对扩增的pcr产物测序，获得16srdna序列后，在ncbi上使用blast程序比对，结果显示，与罗伊氏乳杆菌(ncbi登录号：ky969258.1)同源性大于99％。基于凡是16srdna可变区序列的同源性大于97.5％便可认为是同一个种的标准，该菌株鉴定为罗伊氏乳杆菌，命名为罗伊氏乳杆菌lp4。

实施例2：

罗伊氏乳杆菌lp4的益生特性

(一)罗伊氏乳杆菌lp4的抑菌特性

采用琼脂打孔扩散法，研究罗伊氏乳杆菌lp4对主要肠道致病菌生长繁殖的抑制作用。罗伊氏乳杆菌lp4接种于mrs肉汤培养基中，37℃厌氧培养24h，用mrs肉汤培养基调节菌体数到10⁸cfu/ml；4℃，5000rpm，离心10min，收集上清液；上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，用氢氧化钠调ph至6.2；将20μl培养24h且浓度为1×10⁸cfu/ml的指示菌菌液(大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、福氏志贺氏菌)加入到经高温高压灭菌并冷却到45℃左右的lb固体培养基中，剧烈混合后迅速倒入平皿中，待培养基凝固后用牛津杯在培养基上打孔(直径8mm)，吸取90μl罗伊氏乳杆菌lp4培养液上清注入小孔中，鼠李糖乳杆菌lgg为参照，灭菌的mrs液体培养基为空白对照，室温下扩散4h后，置于37℃恒温箱中培养24h后，测量抑菌圈直径。罗伊氏乳杆菌lp4对三株肠道致病菌的抗菌活性结果如表2所示，罗伊氏乳杆菌lp4能显著抑制大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏、福氏志贺氏菌的生长，抗菌活性优于参考益生菌菌株鼠李糖乳杆菌lgg。

表2乳酸菌对3种指示菌的抑菌性试验结果

注：“-”表示无抑菌作用；“+”表示抑菌圈半径<3mm；“++”表示抑菌圈半径3-6mm；“+++”表示抑菌圈半径6-8mm。

(二)罗伊氏乳杆菌lp4的抗生素敏感性

乳酸菌如具有细菌耐药性，就可能通过水平转移的方式将携带的耐药基因传递给体内的其它肠道菌群，导致其它肠道菌群甚至是致病菌具有抗生素耐药性，因此益生菌对抗生素敏感是乳酸菌益生特性的重要指标之一。本实验采用滤纸片扩散法，鉴定罗伊氏乳杆菌lp4的抗生素敏感性。具体方法为：在灭菌平皿中加入2％的琼脂10ml铺底；取罗伊氏乳杆菌lp4的株菌悬液500μl加入10ml温度为50℃左右的mrs琼脂培养基中迅速混匀，倒入已铺底的平皿中；待培养基冷却凝固后，贴放标准药敏纸片，纸片间距不少于24mm，15min内放入恒温培养箱中，37℃培养48h，测量抑菌圈直径。试验乳酸菌的抗生素敏感性参照美国临床实验室标准化协会(clinicalandlaboratorystandardsinstitute，clsi)修订的最新版本的抗菌药物敏感性试验执行标准进行判定，实验结果如表3所示，罗伊氏乳杆菌lp4对头孢噻肟、阿莫西林、头孢噻吩、青霉素g、氨苄青霉素、卡那霉素、万古霉素敏感，对新生霉素中度敏感，对庆大霉素耐药。而有研究证实，庆大霉素属氨基糖苷类抗生素，乳酸菌对其固有耐药。以上结果表明罗伊氏乳杆菌lp4具有良好的抗生素敏感性。

表3东方蜜蜂成年工蜂肠道分离乳酸菌的抗生素敏感性

实施例3：

罗伊氏乳杆菌lp4对东方蜜蜂成年工蜂生长和肠道健康的影响

(一)罗伊氏乳杆菌lp4对东方蜜蜂成年工蜂死亡率的影响

从云南农业大学养蜂场捉取300只东方蜜蜂健康成年工蜂，随机分为2组，实验ⅰ组为对照组，饲喂普通无菌糖水，实验ⅱ组为实验组，饲喂添加有10⁸cfu/ml罗伊氏乳杆菌lp4的糖水；对照组、实验组分别饲养在2个自制培养箱中，实验过程中均保证充足的糖、水供应；在实验期的第3d、第6d、第9d，分别统计对照组、实验组的蜜蜂死亡率。实验结果如图1所示，随着饲喂日龄的增长，实验组和对照组蜜蜂的死亡率均逐渐提高；但在第3d、第6d、第9d，实验组的死亡率分别为15.4％、26.4％、33.6％，显著低于对照组的死亡率21.9％(p＜0.05)、39.9％(p＜0.05)、52.4％(p＜0.05)，表明东方蜜蜂成年工蜂饲喂罗伊氏乳杆菌lp4后可显著提高蜜蜂的存活率。

(二)罗伊氏乳杆菌lp4对东方蜜蜂成年工蜂肠道菌群变化的影响

从云南农业大学养蜂场捉取300只东方蜜蜂健康成年工蜂，随机分为2组，实验ⅰ组为对照组，饲喂普通无菌糖水，实验ⅱ组为实验组，饲喂添加有10⁸cfu/ml罗伊氏乳杆菌lp4的糖水；对照组、实验组分别饲养在2个自制培养箱中，实验过程中均保证充足的糖、水供应；在实验期的第3d、第6d、第9d，分别取对照组、实验组各3只蜜蜂肠道样品；称重后，每只蜜蜂的肠道样品加入10ml的pbs，匀浆5min，使用pbs做梯度稀释后，将不同的稀释比液体分别取100μl接种到pda、mrs、lb、eb4种琼脂培养基中，每种培养基3次重复；37℃培养48h后，对每个平板进行菌落计数，检测对照组、实验组每克肠道样品中的真菌、乳酸菌、细菌和肠球菌数量，计算lg(cfu/g)值。实验结果由图2至图5所示，与对照组比较，饲喂东方蜜蜂成年工蜂罗伊氏乳杆菌lp4，在第3d、第6d时东方蜜蜂成年工蜂肠道真菌数量无显著变化(p＞0.05)，第9d时显著减少(p＜0.05)；而在第3d、第6d、第9d时，乳酸菌数量显著增加(p＜0.05)，肠球菌数量显著减少(p＜0.05)，细菌总量无显著变化(p＞0.05)，表明饲喂罗伊氏乳杆菌lp4可增加肠道乳酸菌数量，减少肠球菌、真菌数量，改善东方蜜蜂肠道微生态平衡。

(三)罗伊氏乳杆菌lp4对东方蜜蜂成年工蜂肠道抗菌肽基因表达量的影响

抗菌肽能够与病原菌非特异性结合，通过破坏病原菌细胞膜的完整性来杀灭病原菌，提高动物机体免疫力。本实验从云南农业大学养蜂场捉取300只东方蜜蜂健康成年工蜂，随机分为2组，实验ⅰ组为对照组，饲喂普通无菌糖水，实验ⅱ组为实验组，饲喂添加有10⁸cfu/ml罗伊氏乳杆菌lp4的糖水；对照组、实验组分别饲养在2个自制培养箱中，实验过程中均保证充足的糖、水供应；在实验期的第3d、第6d、第9d，分别取对照组、实验组各3只蜜蜂肠道样品，转移入无菌研钵中研碎，提取蜜蜂肠道总rna，使用takara宝生物工程有限公司提供的反转录合成cdna试剂盒将rna反转录为cdna后，采用rt-pcr技术，检测对照组、实验组蜜蜂肠道样品中abeacin类、defensin类、ppo抗菌肽目的基因和actb基因的ct值。具体反转录合成体系、引物信息、rt-pcr反应体系、rt-pcr反应程序如下：

反转录合成体系：

表4去除基因组dna的反应体系

表5cdna合成的反应体系

引物信息：rt-pcr的引物序列均由takara宝生物工程有限公司合成，序列如下表6。

表6rt-pcr引物序列

rt-pcr反应体系：

表7目的基因rt-pcr定量的反应体系

rt-pcr反应程序：

表8荧光定量pcr反应程序步骤及熔解曲线收集步骤

根据下列公式计算目的基因表达量。公式如下：

ratio＝2^{-△cttarget(samper-cablirator)}/2^{-△ctactb(samper-cablirator)}

公式中，sample为实验组样本的ct值，calibrator为对照组样本的ct值。

罗伊氏乳杆菌lp4对东方蜜蜂成年工蜂肠道抗菌肽基因表达量的影响如图6、图7、图8所示，与对照组相比较，饲喂东方蜜蜂成年工蜂罗伊氏乳杆菌lp4，在第3d、第6d、第9d，肠道内abeacin类和defensin类抗菌肽基因表达量均显著升高(p＜0.05)；在第6d，肠道内ppo抗菌肽基因的表达量无显著差异(p＞0.05)，而在第9d，ppo基因的表达量显著升高(p＜0.05)，表明罗伊氏乳杆菌lp4能够促进东方蜜蜂成年工蜂肠道内抗菌肽的产生，提高肠道免疫力。