一株暹罗芽孢杆菌及其在降解邻苯二甲酸二丁酯中的应用的制作方法

本发明涉及一株暹罗芽孢杆菌（bacillussiamensis）及其在降解邻苯二甲酸二丁酯中的应用，即针对叶菜种植体系中土壤源塑化剂邻苯二甲酸二丁酯残留污染的土壤利用该暹罗芽孢杆菌制备修复剂并加以应用方法，属于微生物学与食品安全领域。

技术背景

塑化剂（plasticizer）又称增塑剂，是一类无色油状合成化合物，广泛用于各类塑料产品生产，如涂料、塑料包装盒或包装膜、医护管件、可伸缩玩具、农药以及聚氯乙烯材料等。作为一种代表性的塑化剂，邻苯二甲酸二丁酯（dibutylphthalate，dbp）的产量高达每年数百万吨，同时其极容易释放进入环境，污染生态圈及食物链。

由于dbp的挥发性，以及其与塑料产品之间的弱化学键，使得食品在包装和运输过程中与塑料制品接触会污染上塑化剂，但最具危害的还是作物在生产过程中吸收进体内的塑化剂残留。叶菜中残留积累的dbp是人类dbp暴露的主要来源（zhang,y.,tao,y.,zhang,h.,wang,l.,sun,g.,sun,x.,erinle,k.,feng,c.,song,q.,li,m.,2015.effectofdi-n-butylphthalateonrootphysiologyandrhizospheremicrobialcommunityofcucumberseedlings.j.hazard.mater.289,9-17.），长期接触积累会致癌，干扰内分泌系统以及降低雄性生育能力。因此，邻苯二甲酸二丁酯已被美国环境保护署（usepa）列为一种重点污染物。目前已经报道的土壤修复剂主要聚焦在土壤重金属污染治理修复，以及利用有益微生物群来提高土壤的肥力，专门针对塑化剂，特别是邻苯二甲酸二丁酯土壤污染进行治理的修复剂还未见报道。

随着人们生活水平的提高，对新鲜蔬菜的需求也越大。而温室塑料大棚及化学农药的使用目前是保障叶菜供应的最高效手段，这就不可避免地导致栽种土壤中塑化剂的污染。叶菜的快速生长特性决定了它会通过根部组织从土壤中吸收大部分水分和养料，这伴随着塑化剂残留进入叶菜可食用部分，最终被人类食用而危害人体健康。鉴于此，探索有效修复土壤塑化剂残留污染及寻找阻断塑化剂从栽种土壤进入叶菜中的方法对于生态环境保护，绿色农业生产及人类可持续发展都显得十分重要。

暹罗芽孢杆菌（bacillussiamensis）自2010年首次分离于泰国暹罗，目前研究较少，现有报道中，其对梨轮纹病、软腐病、番茄疫霉根腐病菌具有一定的防治效果，但在降解土壤中邻苯二甲酸二丁酯的应用尚未见报道。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一株暹罗芽孢杆菌（bacillussiamensis），该菌株可针对土壤主要塑化剂邻苯二甲酸二丁酯进行降解，并可进一步制备为修复剂，能够有效降解残留于栽种土壤中的塑化剂污染，进而减少其向叶菜中的吸收转移，同时要保证不影响叶菜植株的正常生长，以及不引入其他污染源。

本发明首先提供了一株保藏号为cgmccno:16234的暹罗芽孢杆菌（bacillussiamensis），申请人将其自命名为t7，芽孢杆菌属；该菌株分离自多年生本草植物酸模体内，菌株呈棒杆状，表面分泌多糖类物质，单个菌株之间能够粘附在一起，菌量大时形成生物膜状而存在，是土壤环境中常见有益菌属,多数对动植物无害。

其次，本发明提供了上述保藏号为cgmccno:16234的暹罗芽孢杆菌在降解邻苯二甲酸二丁酯中的应用，特别是降解土壤邻苯二甲酸二丁酯污染中的应用。

第三，本发明提供了一种针对邻苯二甲酸二丁酯土壤污染的高效修复剂。该修复剂中包含保藏号为cgmccno:16234的暹罗芽孢杆菌，同时选择搭载媒介、搭载固定条件的优化以及土壤施用比例等技术问题。具体包括：

（1）稻壳生物质炭的制备：选取水稻脱粒后的生物质废料稻壳，暴晒风干至少一周后，再放入120℃烘箱干燥24小时，以达到完全脱水状态；然后将稻壳生物质放入sg-gl1100k高温炉中，500℃裂解4小时，得到生物质炭原料；最后对生物质炭原料进行研磨、筛选至粒径为0.154mm，然后于121℃高压蒸汽灭菌20min，即获得稻壳生物质炭；

该稻壳生物质炭的制备方法是在对现有制备方法的优化，前期进行长期风干，烘箱干燥可以确保稻壳完全脱水，这样在高温条件下就不会产生烟雾；而sg-gl1100k高温炉带有抽真空装置，使得稻壳生物质原料在真空状态下裂解，全程不排出任何烟雾废气，这比传统的马弗炉更能均匀而彻底的裂解生物质原料。在前期预实验中，申请人发现对于bacillussiamensissp.t7而言，稻壳生物质炭的粒径在0.154mm时所吸附搭载的生物量最大，所以在制备土壤修复剂时统一将生物质炭研磨成粒径为0.154mm；

（2）制备菌悬液：利用lb培养基过夜培养保藏号为cgmccno:16234的暹罗芽孢杆菌t7菌株，菌体经过离心（5000rpm，15min,4℃）并用无菌磷酸缓冲液（pbs，ph7.0）洗涤三遍，然后用pbs重悬成od6001.5左右的菌悬液；

（3）制备土壤修复剂：将步骤（2）获得的菌悬液与步骤（1）获得的稻壳生物质炭混合，混合比例为每1克稻壳生物质炭（干重）与200毫升菌悬液混合，然后添加氯化钙至0.01摩尔每升（菌液），添加叠氮化钠至0.2克每升（菌液）；随后将混合物置于30摄氏度摇床中，低速（80转每分钟）进行物理吸附固定24小时；然后用200目的筛子过滤菌液，再用无菌pbs冲洗微生物搭载剂（即稻壳生物质炭）三遍，以去除稻壳生物质炭表面没有吸附的t7菌株，最后将该搭载上t7菌的稻壳生物质炭放置在烘箱中35摄氏度干燥24小时，即获得土壤修复剂。

第四，本发明提供了上述土壤修复剂在降解叶菜种植体系中土壤源塑化剂残留污染的修复应用，以及降低该土壤源塑化剂向叶菜可食用部分的吸收转运中的应用。

本发明从植物体内分离筛选出了一株暹罗芽孢杆菌（bacillussiamensis），首次发现了其邻苯二甲酸二丁酯降解特性，该菌株区别其目前已知的植物促生长及生物防治，可防治多种作物真菌霉菌病害。其次，申请人将该菌株搭载在生物质炭上制备成土壤修复剂，充分发挥其dbp降解的功能，以弥补当前有效阻断塑化剂从栽种土壤进入叶菜中方法的空白实现绿色安全种植，既降解叶菜种植体系中土壤源塑化剂残留污染，又降低该土壤源塑化剂向叶菜可食用部分的吸收转运，减少人们因为食用叶菜而暴露dbp的危害。

附图说明

图1为暹罗芽孢杆菌（bacillussiamensis）t7的扫描电镜显微图。

图2为暹罗芽孢杆菌t7对邻苯二甲酸二丁酯的降解功能验证结果示意图。

图3为塑化剂修复剂外表面扫描电镜显微图。

图4为该微生物修复剂对土壤中残留邻苯二甲酸二丁酯修复功能展示。

图5为该微生物修复剂对减少叶菜种植过程中塑化剂污染的效果示意。

具体实施方式

实施例所涉及的培养基：

lb培养基：10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母膏，10g/l氯化钠，ph7.0；

无机盐液体培养基:mgso4·7h2o(0.4g),feso4·7h2o(0.2g),k2hpo4(0.2g),(nh4)2so4(0.2g),andcaso4,(0.08g),去离子水1l,ph7.0~7.2;

无机盐固体培养基：无机盐液体培养基中添加20g/l琼脂；

以下实施例所涉及的试剂，除非特别说明，均为商业渠道购买。

实施例1暹罗芽孢杆菌t7的分离鉴定与降解功能验证

1、菌株bacillussiamensissp.t7分离鉴定

申请人于2016年7月采集来自江苏省农业科学院实验大田((e118°86′,n32°03′)中的塑料大棚中生长的野生杂草酸模，然后对酸模植株进行表面消毒，研磨成汁液，涂布在含有dbp为唯一碳氮源的无机盐固体培养基上，筛选获得一株具备邻苯二甲酸二丁酯降解特性的植物内生菌bacillussiamensissp.t7。

申请人将该菌自命名为t7，其电镜图片如图1所示，该菌株呈棒杆状，表面分泌多糖类物质，使得单个菌株之间能够粘附在一起，菌量大时形成生物膜状而存在。

通过生理生化特性和16srdna保守序列比对t7菌株鉴定为暹罗芽孢杆菌（bacillussiamensis），于2018年8月8日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（cgmcc），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号为cgmccno.16234,分类命名为暹罗芽孢杆菌（bacillussiamensis）。

2、bacillussiamensissp.t7菌株降解dbp功能验证

先用lb培养基过夜培养步骤1筛选获得的纯t7菌株，菌体经过离心（5000rpm，15min,4℃）并用无菌磷酸缓冲液（pbs，ph7.0）洗涤三遍，然后用pbs重悬成t7菌悬液（od6001.5左右）；再按体积比1%的接菌量将t7菌悬液分别加入含有不同浓度（dbp浓度依次为5μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml）的dbp为唯一碳氮源的无机盐液体培养基中培养24小时;最后用高效液相色谱法（hplc）检测无机盐液体培养基中的dbp残留含量，对比不接菌的对照（加入等体积1%的pbs），计算t7菌株的降解率：

dbp降解率=（对照组dbp含量-实验组dbp含量）/对照组dbp含量*100%；最终确定bacillussiamensissp.t7的dbp降解性能。上述高效液相色谱法（hplc）参见文献：gao,m.,dong,y.,zhang,z.,song,w.,qi,y.,2017.growthandantioxidantdefenseresponsesofwheatseedlingstodi-n-butylphthalateanddi(2-ethylhexyl)phthalatestress.chemosphere172,418-428.

检测结果如图2所示，通过对比dbp色谱峰面积可知，1%体积的t7菌液就能够分别将浓度为5μg/ml（图2a）、10μg/ml（图2b）、50μg/ml（图2c）、100μg/ml（图2d）的dbp的24h降解率提高至100%（未检出）、81.34%、44.61%和31.03%。充分验证了bacillussiamensissp.t7对领苯二甲酸二丁酯的高效降解特性。

实施例2稻壳生物质炭的制备

选取水稻脱粒后的生物质废料稻壳，在晴天条件暴晒风干一周，再放入120摄氏度烘箱干燥24小时以达到完全脱水状态；然后将稻壳生物质放入sg-gl1100k高温炉中，500摄氏度裂解四小时而得到生物质炭原料；最后对生物质炭原料进行研磨筛选成粒径为0.154mm的稻壳生物质炭，可作为t7菌株的微生物搭载剂。

利用asap2020全自动比表面积和孔隙分布仪与2400ⅱ元素分析仪来分析本实施例获得的稻壳生物质炭，利用化学指示剂法测定其表面官能团特性，检测结果如表1所示：

表1稻壳生物质炭理化性质检测结果

由表1可见，本实施例获得的稻壳生物质炭相对较大的表面积和孔隙容量为t7菌株提供了极好的栖息场所，同时生物质炭表面的酸性官能团（羧基官能团、内酯基官能团、内酯基官能团）赋予了生物质炭极性，使其成为微生物极佳的吸附剂。这些特点都为t7菌株成功吸附搭载在稻壳生物质炭上提供了保障。

实施例3dbp土壤修复剂制备

将实施例2中所制备的稻壳生物质炭放入埃伦迈尔烧瓶中，121摄氏度高压蒸汽灭菌20分钟；然后将实施例1中的t7菌悬液加入三角烧瓶中与生物质炭混合，每1克生物质炭（干重）与200毫升菌悬液混合，同时添加0.01摩尔每升（菌液）的氯化钙和0.2克每升的叠氮化钠，随后把稻壳生物质炭与菌悬液的混合物置于30摄氏度摇床中，低速（80转每分钟）进行物理吸附固定24小时；然后用200目的筛子过滤菌液，再用无菌pbs冲洗微生物搭载剂三遍，以去除生物质炭表面没有吸附的t7菌，最后将该搭载上t7菌的稻壳生物质炭放置在烘箱中35摄氏度干燥24小时，即获得针对领苯二甲酸二丁酯污染的土壤修复剂。

图3为本实施例制备获得的土壤修复剂扫描电镜图。由图3可见，即使经过了三遍冲洗，该土壤修复剂（生物质炭）表面依然吸附了大量的t7菌株，而经过优化的粒径和适宜的孔隙使大量的降解菌t7进入了生物质炭的裂隙和孔洞之中（箭头标注）不易流失，从而使其长期栖息在生物质炭上，避免了环境中不利因素（如其他土壤微生物的竞争胁迫）的影响，长久地发挥dbp降解修复作用。

实施例4土壤修复剂修复土壤中的dbp污染实验

取样农田自然土壤，先暴晒风干，再过30目筛子去除过大的石粒，土壤成分性质为ph5.97,有机质含量66.8g/kg干土,总氮含量0.36%,总碳含量49.61%,总氢含量5.7174%,总硫含量0.01%,氧含量44.37%，黏土含量2.33%，淤泥含量16.1%，沙含量81.5%。将土壤样品铺平在不锈钢盘中，喷洒dbp母液（将dbp溶于乙腈中），静置24小时以让有机溶剂挥发，再将土样装入玻璃容器中，置于翻动摇床混匀过夜以均匀分散dbp，使实验土壤dbp残留量定为100微克每克土壤。

再按质量比5%的添加量向实验土壤中加入实施例3获得的土壤修复剂，摇床翻转过夜混匀。将玻璃容器置于暗室，同时以不添加土壤修复剂的实验土壤为对照。定期取样用高效液相色谱法测定实验土壤中dbp的降解动态，确定该土壤修复剂对塑化剂dbp污染的修复效果。

实验结果如图4所示，相比不做任何处理的对照组dbp污染土壤，加入土壤修复剂能够将降解菌t7的生物量长期维持在稳定的水平，这直接导致该污染土壤中的dbp降解速率常数和降解半衰期从0.1979d^-1和2.3131d提高到了0.2434d^-1and2.1062d。即使在修复后期（14天之后）由于与土壤中的其他吸附物质结合成结合态而难以被t7菌株和其他降解媒介降解，导致dbp在后期降解速度变慢，该土壤修复剂依然在30天的实验周期内将土壤dbp含量减少超过50%以上。

实施例5土壤修复剂修复叶菜dbp污染土壤实验

将实施例3获得的土壤修复剂撒在叶菜将要种植的土壤表面（同实施例4农田自然土壤），土壤修复剂施用量为土壤质量的5%，将土壤修复剂与dbp污染土壤混匀，并栽种上不同品种叶菜，对照组不做任何处理；

栽培40天后取叶菜可食用部分进行冷冻干燥，并用气相色谱质谱联用（gc-ms）检测叶菜可食用部分的dbp残留含量（干重）（检测方法参见文献：feng,n.,yu,j.,mo,c.,zhao,h.,li,y.,wu,b.,cai,q.,li,h.,zhou,d.,wong,m.,2017.biodegradationofdi-n-butylphthalate(dbp)byanovelendophyticbacillusmegateriumstrainyjb3.sci.totalenviron.616-617,117-127.）。

该实验结果如图5所示，即使不同品种叶菜对土壤中的邻苯二甲酸二丁酯具有不同的吸收特性，该土壤修复剂都能够显著降低叶菜可食用部分的dbp残留含量。除此之外，在实验中同时发现，该土壤修复剂能够减少高浓度dbp（100μg/g土壤）对叶菜生长的毒性，具有促进植物生长的作用。

在具体实施中，该土壤修复剂一般施入量为20t/hm²，也可根据土壤塑化剂污染程度增减修复剂使用量，用翻铲将土壤表层的修复剂与土壤混匀，再撒上蔬菜种子或移栽蔬菜幼苗进行叶菜常规种植。