一种可广泛检测致病性钩端螺旋体的试剂盒及引物的制作方法

本发明提供一种可广泛检测致病性钩端螺旋体的试剂盒及引物，将3对引物放入同一反应体系，能够特异性的检测出15种标准株钩体，省时省力，检测的致病性钩体血清型广泛，属于生物技术领域。

背景技术：

钩端螺旋体病（简称钩体病）是由致病性钩端螺旋体（简称钩体）引起的一种自然疫源性人畜共患病，危害了人们身体健康以及畜牧业的发展。钩端螺旋体拥有众多血清型，我国存在至少15种致病性钩体，分别为赖型（56601）、爪哇型（56602）、犬型（56603）、拜伦型（56604）、致热型（56605）、秋季型（56606）、澳洲型（56607）、波摩那型（56608）、临型（56609）、七日热型（56610）、巴叶赞型（56612）、塔拉索夫型（56613）、清水型（56615）、乌尔夫型（56635）和明尼型（56655），括号内为该种血清型的标准菌株。

目前存在的常用钩体pcr检测引物及专利产品，如lipl-32242和公开号为cn103205502a、公开号为cn101935696a的中国专利都不能将以上所有的钩体血清型全部检测出，只能检测出某几种钩体的血清型，造成pcr检测的假阴性，上述技术方案无法广泛检测致病性钩端螺旋体，后果严重。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的问题，本发明公开一种可广泛检测致病性钩端螺旋体的试剂盒及引物；将3对退火温度一致、目的条带一致的pcr引物放在同一个反应体系，目的是提供一种省时省力，特异性和敏感性优异，可广泛检测致病性钩端螺旋体ligl32基因的pcr引物及试剂盒，可用于检测致病性钩端螺旋体病的早期诊断。

本发明原理在于选择了钩端螺旋体ligl32基因作为检测对象，并针对不同血清型钩端螺旋体的ligl32基因设计了3对退火温度一致的pcr引物，增加检测的广泛性、特异性和敏感性。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供一种广泛检测致病性钩端螺旋体的pcr引物，所述引物如下：

上游引物：5’-caggcgacggagacttag-3’；

5’-caggcgacggagacttag-3’；

5’-cgggcgacggagatttag-3’；

下游引物：5’-agactcttcagcagcgatag-3’；

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所述引物的扩增片段长度为468bp。

本发明所述的一种广泛检测致病性钩端螺旋体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：上述的pcr引物、阳性对照、阴性对照、taq酶、dntp、10×buffer、ddh2o；具体如下：

1）阳性对照20ul*1管；

2）阴性对照20ul*1管；

3）反应管23ul*8管。

本发明所述的一种广泛检测致病性钩端螺旋体的试剂盒制备方法，包括以下步骤：

1）阳性对照的制备，培养56601钩体，提取10⁸个钩体的dna，用50ulte缓冲液进行洗脱，检测核酸浓度，并用te缓冲液稀释至1ng/ul，分装后-20℃保存；

2）阴性对照的制备，将蒸馏水经0.22um滤膜过滤后，进行高压灭菌处理，分装后-20℃保存；

3）反应管的制备，将3对引物、taq酶、dntp、10×buffer和ddh2o混合均匀，其中每条引物的终浓度为0.5um，taq酶的体积比为1:50，dntp的体积比为4:50，10×buffer的体积比为1:10，加入ddh2o定容到4.6ml，分装后-20℃保存；

4）提取待测样本的dna，将2ul样本dna加入反应管中；

5）取阳性对照2ul于反应管中做为检测的阳性对照，同时取阴性对照2ul于反应管中做为检测的阴性对照；

6）放入pcr仪，94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min；

7）将产物进行1%的核酸凝胶电泳，110v，20min，用凝胶成像仪进行观察，目的条带大小为468bp。

由于所述引物的扩增片段能够证明钩端螺旋体ligl32基因的存在，从而证明致病性钩端螺旋体的存在，因此，所述引物可用来制备广泛检测致病性钩端螺旋体的试剂盒；使所述引物能够最大程度地增加反应成功率和反应效果。

本发明的有益效果在于：

本发明设计了3对退火温度一致，目的条带大小相同的引物组合，可放在同一反应体系，能够准确检测出15种钩体血清型。选择ligl32基因作为检测对象，应用3对特异性引物，实现广泛检测致病性钩端螺旋体的目的。本发明提供了一种省时省力，特异性和敏感性优异，可广泛检测钩端螺旋体的pcr引物及试剂盒。本发明提供的引物和试剂盒，可用于钩端螺旋体病的早期诊断在该实验中，建立并组装的广泛检测致病性钩端螺旋体病pcr方法特异性强，并且检测钩体浓度的灵敏度可达到1个钩体的dna含量。

附图说明

图1为实施例1的pcr效果图；

图2为实施例2的pcr效果图；（p.s:m表示为dnamaker、1—15分别表示：钩端螺旋体标准菌株赖型56601，爪哇型56602，犬型56603，拜伦型56604，致热型56605，秋季型56606，澳洲型56607，波摩那型56608，临型56609，七日热型56610，巴叶赞型56612，塔拉索夫型56613，清水型56615，乌尔夫型56635，明尼型56655）

图3为试验例1的pcr效果图；

图4为试验例2的pcr效果图；（p.s:1—3分别为：阴性对照、大肠杆菌、非致病性钩端螺旋体）；

图5为试验例3的pcr效果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

1、菌株和临床样本

钩端螺旋体标准菌株赖型56601，爪哇型56602，犬型56603，拜伦型56604，致热型56605，秋季型56606，澳洲型56607，波摩那型56608，临型56609，七日热型56610，巴叶赞型56612，塔拉索夫型56613，清水型56615，乌尔夫型56635，明尼型56655，非致病性钩体566505，由课题所在实验室传代培养保存。

2、主要仪器和试剂

凝胶电泳图像分析系统（北京六一仪器厂，中国）；梯度pcr仪（biometrauno，德国）；co2恒温培养箱（sanyo，日本），细菌基因组dna提取试剂盒以及胶回收试剂盒购自天根公司；taq酶、琼脂糖等常规试剂购自国产公司。

实施例1

引物设计与合成

根据genbank中已发表的钩体不同血清型的ligl32基因序列，应用primerpremier5.0软件设计得到不同的引物，经筛选得到本发明所述的3对退货温度一致的特异性引物。

筛选得到的引物通过ncbi中的blast进行特异性鉴定，如表1所示。引物均由库美生物公司合成。

上游引物：

5’-caggcgacggagacttag-3’；

5’-caggcgacggagacttag-3’；

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下游引物：

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实施例2

2种引物的pcr反应

应用本发明的3对引物，对15种钩体血清型进行检测，对比文献中常用的lipl-32242引物，分析本发明3对引物在试验中的优越性；

根据细菌组dna提取试剂盒产品说明，从生长良好的钩体菌液提取dna作为模板；

以钩体dna为模板，反应体系和条件：12.5μl，taq酶1μl，实施例1所述上下游引物各，模版1.5μl，ddh2o5μl补足，体系为25μl；

反应条件：94℃3min；94℃30s，退火温度60℃30s，72℃30s，35个循环；72℃5min。进行pcr反应，并对pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳观察结果。参见图2三对引物可以把本文所述菌株全部检测出来，条带清晰，检测效果佳；

由附图2可知，lipl-32242引物不能把全部的菌株检测出，而且条带不是特别清晰，辨别不佳。

实施例3

试剂盒的组装：

1）阳性对照的制备，培养56601钩体，提取10⁸个钩体的dna，用50ulte缓冲液进行洗脱，检测核酸浓度，并用te缓冲液稀释至1ng/ul，分装后-20℃保存；

2）阴性对照的制备，将蒸馏水经0.22um滤膜过滤后，进行高压灭菌处理，分装后-20℃保存；

3）反应管的制备，将3对引物、taq酶、dntp、10×buffer和ddh2o混个均匀，其中每条引物的终浓度为0.5um，taq酶的体积比为1:50，dntp的体积比为4:50，10×buffer的体积比为1:10，加入ddh2o定容到4.6ml，分装后-20℃保存；

4）提取待测样本的dna，将2ul样本dna加入反应管中；

5）取阳性对照2ul于反应管中做为检测的阳性对照，同时取阴性对照2ul于反应管中做为检测的阴性对照；

6）放入pcr仪，94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min；

7）将产物进行1%的核酸凝胶电泳，110v，20min，用凝胶成像仪进行观察，目的条带大小为468bp；

pcr检测试剂盒中，包括阳性对照和阴性对照制品各一管，实施例1所述的上游和下游引物，以及taq酶、dntp、10×buffer和ddh2o则混在一起成为反应管，反应管的体积为23ul，所以试剂盒一共有10管产品。

试验例1

灵敏度试验

选取生长良好的56601钩体菌液进行计数，稀释成109菌体/ml，提取菌体基因组dna，所得液体为50μl，而后用bufferte对菌体的dna进行10倍梯度稀释:取10μl所提取的dna液加入90μl的te中制成108的菌体dna液，然后10倍梯度稀释到100，pcr反应能检测到最低的菌体dna浓度，第9孔为1个钩体的dna量，参见图3所示（p.s:m表示为dnamaker、1—15分别表示：钩端螺旋体标准菌株赖型56601，爪哇型56602，犬型56603，拜伦型56604，致热型56605，秋季型56606，澳洲型56607，波摩那型56608，临型56609，七日热型56610，巴叶赞型56612，塔拉索夫型56613，清水型56615，乌尔夫型56635，明尼型56655）。

试验例2

重复性试验

以相同浓度钩体dna标准品作为模版，在一次pcr反应中，进行多管同时进行反映，配置1%琼脂糖凝胶，进行电泳前进行加样时，每孔的加样量保持一致，结果如图所示。参见图4可知，各个样品的条带均明亮，重复性良好。

试验例3

特异性试验

由于所设计的引物可以把实例1所述的钩体都能检测出来，所以利用实施例1所述引物进行对阴性对照、大肠杆菌、非致病性钩端螺旋体的pcr反应。结果如图5所示，阴性对照、其他菌种和非致病性钩端螺旋体均未出现条带，表明特异性良好。

确定保存期：将两种试剂盒置于-20℃下保存，间隔两周进行检测，确定其保存期。经过六个月后，检测结果依然良好，确定保存条件为-20℃，保存期最短为六个月。

试剂盒检出率检测：临床采集血液和尿液样品，以钩体检测的金标准方法显微凝集试验（mat）方法，和建立的pcr方法进行检测，对比检出率。pcr方法检测出的阳性样本与mat方法检出阳性样本数一致，检出率良好。

常规的pcr产品体系中只含有一对pcr引物，这限制了其检测范围的广泛性，如果为了增加检测的广泛性，而随意添加不同的引物在体系中，则会由于不同引物的退货温度不一致而导致反应失败。本发明设计的3对钩体pcr引物，退货温度一致，都为60℃，且目的片段大小也相同，都为468bp，能准确检测出15种钩体标准株，重复性好。

序列表

<120>一种可广泛检测致病性钩端螺旋体的试剂盒及引物

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>人工序列()

<400>1

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<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工序列()

<400>2

caggcgacggagacttag18

<210>3

<211>18

<212>dna

<213>人工序列()

<400>3

cgggcgacggagatttag18

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列()

<400>4

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<212>dna

<213>人工序列()

<400>5

agattcttcggcggcgatag20

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列()

<400>6

agattcttcagctgctatgg20