一种多肽、多肽组合物在治疗结肠癌中的应用的制作方法

本发明涉及生物医药
技术领域：
，具体地说，是一种通过与β-catenin有效结合并促其正常降解，从而达到抑制肿瘤生长，治疗结肠癌的小分子多肽、多肽组合物及其应用。
背景技术：
：结肠癌(cancerofcolon)是西欧、北美等发达国家最常见的恶性肿瘤，也是我国九大常见恶性肿瘤之一。在过去30多年的时间里，包括我国在内的多数国家或地区结肠癌发病率呈上升趋势。在我国因结肠癌死亡者，男性居恶性肿瘤死亡的第5位，女性居第6位。从流行病学的观点看，结肠癌的发病与社会环境、生活方式(尤其是饮食习惯、缺乏体力活动)、遗传因素有关，年龄、结直肠息肉史、溃疡性结肠炎及胆囊切除史也是结肠癌的高危因素，但总体而言，结肠癌的病因并非很清楚。apc基因是由herrera于1986年对1例格德纳综合征(葡萄糖注射液)患者进行细胞遗传学研究时发现的一个新的抑癌基因。groden等于1991年从结肠癌中首先克隆到这一基因，并正式命名为dp2，5或腺瘤样结肠息肉易感基因(adenomatouspolyposiscoli)。groden和kinzler等应用pcr技术和特异cdna探针分析，确定dp2，5基因即为apc基因。早期研究发现该基因不仅与家族性结肠腺瘤息肉病(fap)有关，后发现其在散发性大肠癌的发生中也起着重要作用。chop等应用免疫沉淀技术也证实大肠癌组织中缺乏野生型apc蛋白，提示apc蛋白缺失表达可能与大肠癌的发生与演进密切相关。apc基因在fap及散发性大肠癌(scrc)中所显示生殖细胞与体细胞突变谱的相似性，提示apc基因参与这两种大肠癌的发生发展可能为共同机制。近年来分子生物学的研究结果表明，大肠癌发生发展与多个癌基因的激活和抑癌基因的失活有关，抑癌基因apc被认为是与大肠腺癌发生相关的热点基因，apc基因失活是大肠肿瘤发生的早期分子事件，但稳定于肿瘤发生发展的全过程。apc基因在85％的结肠癌中缺失或失活，并且该基因的缺陷与结肠癌的遗传易感性密切相关。前期研究发现，由于绝大多数结肠癌属apc基因缺陷型，导致apc不能与β-catenin有效结合并促其正常降解，过多的β-catenin进入细胞核启动细胞生长增殖相关基因过度表达而致癌。据文献报道apc基因上有一段包含20个氨基酸的重复序列区域能与β-catenin结合，另外，穿膜肽(cpp)可携带生物大分子，如β-catenin入胞发挥作用。结合目前研究报道，本申请推测这三条多肽与β-catenin结合能促进其降解，为进一步促进三条多肽与细胞中β-catenin结合，将cpp序列与之连接，从而达到抑制肿瘤生长的目的。本发明基于肿瘤发生特点和治疗难点，利用生物合成技术，发明一种多肽序列，其氨基酸序列为seqidno.1-3所示，多肽组合物为包括以上三条序列。接着对多肽及多肽组合物的抗肿瘤功能进行了研究，通过所述多肽/多肽组合物的治疗，在体内和外水平显示，本发明所涉及的多肽、多肽组合物具有抑制肿瘤细胞活性和抑制小鼠成瘤模型生长的重要抗癌功能。本发明为肿瘤治疗开发新的靶点提供实验依据，对于应用于肿瘤的临床治疗具有十分重要的开发应用前景。技术实现要素：发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种多肽及多肽组合物，具有抑制结肠癌效应，满足生物医药使用需求。本发明的另一目的是提供上述多肽及多肽组合物的用途。技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：第一步，基于肿瘤发生特点和治疗难点，利用生物合成技术，发明三段由氨基酸(aminoacid)组成的多肽，其氨基酸序列如seqidno.1-3所示；第二步，对上述合成多肽、多肽组合物的抗结肠癌功能进行体外验证研究：将合成的多肽或多肽组合加至人结肠癌ht-29细胞后，并以非特异性杀伤多肽(氨基酸序列如seqidno.4所示)为对照，检测细胞活性，cck-8结果显示此多肽具有显著抑制人结肠癌细胞增殖的作用，尤其是多肽组合物抑制结肠癌作用更加明显。将合成的多肽或多肽组合加至人结肠癌ht-29细胞后，并以非特异性杀伤多肽(氨基酸序列如seqidno.4所示)为对照，检测细胞克隆形成能力，克隆形成实验结果显示此多肽具有显著抑制人结肠癌细胞增殖能力，尤其是多肽组合物抑制结肠癌作用更加明显。将合成的多肽或多肽组合分别加至人结肠癌ht-29细胞后，并以非特异性杀伤多肽(氨基酸序列如seqidno.4所示)为对照，检测细胞周期情况，细胞周期实验结果显示此多肽具有显著抑制人结肠癌细胞增殖能力的作用，尤其是多肽组合物抑制结肠癌作用更加明显。第三步，对上述合成多肽的抗结肠癌功能进行体内验证研究：构建小鼠皮下成瘤模型，每周观察瘤体，挑选状态良好的已成瘤裸鼠于瘤体周围皮下注射多肽或多肽组合物，并以非特异性杀伤多肽(氨基酸序列如seqidno.4所示)为对照，测量肿瘤大小，接种后30天，处死裸鼠，剥离肿瘤，称量测量；实验结果显示此多肽具有显著抑制小鼠成瘤模型生长的作用，尤其是多肽组合物抑制结肠癌作用更加明显。本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明基于肿瘤发生特点和治疗难点，通过抗肿瘤基因治疗途径发明3段多肽，接着对多肽或多肽组合物的抗肿瘤功能进行了研究，通过所述多肽或多肽组合物的治疗，在体内和外水平显示，本发明所涉及的多肽具有抑制肿瘤细胞活性和抑制裸鼠成瘤模型生长的重要抗癌功能，尤其是多肽组合物抑制结肠癌作用更加明显。具备很好的药物用途前景。附图说明为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：图1是cck-8实验结果图图2是细胞克隆形成实验结果图图3是细胞周期流式结果分析图图4是裸鼠成瘤模型肿瘤生长大小图具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。【实施例1】多肽工作液的配置1.储备液配制：1mg/瓶肽，4℃离心，12000rpm，5min；加pbs与5μldmso，配成终浓度0.5mm储备液，如下表。2.工作液配制：用pbs将储备液稀释，配制成5μm浓度工作液。【实施例2】cck-8实验证明多肽细胞水平的抗结肠癌效应本发明以合成肽的形式发挥其抗肿瘤作用，cck-8实验证明此多肽对人结肠癌细胞具有生长抑制效应，以一种人结肠癌细胞ht-29细胞为例。1.细胞模型分组：(1)正常对照组：正常细胞(2)实验对照组：对照多肽(seqidno.4)处理细胞(96孔板每孔给工作液各100μl)(3)实验组1：seqidno.1多肽处理细胞(96孔板每孔给工作液各100μl)(4)实验组2：seqidno.2多肽处理细胞(96孔板每孔给工作液各100μl)(5)实验组3：seqidno.3多肽处理细胞(96孔板每孔给工作液各100μl)(6)实验组4：seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3组合多肽处理细胞(三种多肽：96孔板给工作液各33.3μl)2.细胞培养：ht-29细胞培养于含青、链霉素(各1u/ml，0.1mg/ml)10％fbs的mccoy′s5a培养基中，放置在37℃、5％co2、相对湿度为100％的细胞培养箱中培养，细胞贴壁生长，经过传代培养用于后续实验。3.cck-8检测步骤：收集生长状态良好的ht-29细胞，细胞计数调整细胞浓度至2×105/ml。分别接种于96孔板中，每孔100μl，每组细胞设3个复孔。将96孔板移入培养箱中培养(37℃，5％co2)，次日待细胞完全贴壁后，分别加入5μm的相关多肽药物，继续培养12h、24h、36h后用于检测。每孔加入20μlcck-8溶液(注意不要产生气泡)，于培养箱内孵育14h。用酶标仪测定在450nm处的吸光度值。同时设置空白孔(培养基、cck8)，对照孔(未经处理的细胞、培养基、cck8)。4.活力计算：细胞活力(％)＝[a(实验组)-a(空白组)]/[a(对照组)-a(空白组)]×100％细胞抑制率(％)＝[a(对照组)-a(实验组)]/a(对照组)＝1-细胞活力a(实验组)：具有经过处理的细胞、cck溶液的吸光度值a(空白组)：具有培养基和cck溶液而没有细胞的孔的吸光度值a(对照组)：具有未经过处理的细胞、cck溶液的吸光度值注：细胞活力指细胞增殖活力或细胞毒性活力。5.实验结果：结果如图1所示，实验组(多肽或多肽组合物处理细胞)的细胞增殖速率明显小于正常对照组，其中实验组4(多肽组合物处理细胞)的细胞增殖速率又较实验组1-3(一种多肽单独处理细胞)小，此多肽具有显著抑制人结肠癌细胞增殖能力，尤其是多肽组合物对人结肠癌细胞生长有明显的抑制作用。【实施例3】细胞克隆实验证明多肽细胞水平的抗结肠癌效应1.细胞培养及细胞分组同实施案例22.细胞克隆实验步骤：3.实验步骤(1)取处理后的各组细胞，分别用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10％胎牛血清的mccoy′s5a培养基中备用。(2)将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞每皿分别接种1000个细胞子含10ml37℃预温培养板中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37℃，5％co2及饱和湿度的细胞培养箱中培养10～14d。(3)当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用pbs小心浸洗2次。结晶紫染色10min，然后用水缓慢洗去染色液，空气干燥。(4)将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，并用相机拍照保存。最后计算克隆形成率。克隆形成率＝(克隆数/接种细胞数)×100％4.实验结果：结果如图2所示，实验组(多肽及多肽组合物处理细胞)形成的集落数量明显少于正常对照组，其中实验组4(多肽组合物处理细胞)形成的集落数量又较实验组1-3(一种多肽单独处理细胞)少，此多肽具有显著抑制人结肠癌细胞增殖能力，尤其是多肽组合物对人结肠癌细胞生长有明显的抑制作用。【实施例4】流式检测细胞周期实验证明多肽细胞水平的抗结肠癌效应1.细胞培养及细胞分组同实施案例22.流式检测细胞周期步骤：(1)用6孔板培养细胞，待细胞生长达到60％-70％，根据实验需求处理，继续培养；(2)根据实验细胞处理后，把细胞吸出至1.5ml离心管内，2000rpm离心5min；(3)用pbs洗涤细胞2次，2000rpm离心5min，收集1-5×105细胞；(4)细胞固定：加入1ml冰浴预冷70％乙醇中，轻轻吹打混匀，4℃固定2h或更长时间。固定12-24h可能效果更佳。1000rpm左右离心3-5min，沉淀细胞。加入约1ml冰浴预冷的pbs，重悬细胞。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50μl左右的pbs，以避免吸走细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。(5)碘化丙啶染色液的配制：参考下表，根据待检测样品的数量配制适量的碘化丙啶染色液：1个样品6个样品12个样品染色缓冲液0.5ml3ml6ml碘化丙啶染色液(20x)25μl150μl300μlrnasea(50x)10μl60μl120μlfinalvolume0.535ml3.21ml6.42ml(6)染色：每管细胞样品中加入0.5ml碘化丙啶染色液，缓慢并充分重悬细胞沉淀，37℃避光温浴30min。随后可以4℃或冰浴避光存放。染色完成后宜在24h内完成流式检测。(7)流式检测：用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测红色荧光，同时检测光散射情况。3.实验结果：结果如图3所示，与正常对照组相比，实验组(多肽或多肽组合物处理细胞)s期细胞明显下降，对细胞增殖产生了抑制作用；其中实验组4(多肽组合物处理细胞)s期细胞数量又较实验组1-3(一种多肽单独处理细胞)少，说明是多肽组合物对人结肠癌细胞生长有更明显的抑制效果。【实施例5】裸鼠体内成瘤模型构建1.实验分组：正常对照组：正常ht-29细胞成瘤组实验对照组：对照多肽(seqidno.4)治疗组实验组1：seqidno.1多肽治疗组实验组2：seqidno.1-3组合多肽治疗组2.建立裸鼠体内成瘤模型：(1)动物适应性喂养：动物房12h-12h昼夜交替，保持动物自由饮水、进食，温度23-25℃，适应性喂养一周后进入实验。(2)裸鼠皮下接种：取对数生长期的ht-29细胞，制成浓度为6×107/ml的细胞悬液，每只裸鼠于右腋皮下接种150μl细胞悬液。(3)成瘤观察：皮下接种后，每天观察裸鼠健康状态及肿瘤生长情况；待成瘤后，于每周1、3、5观察瘤体、动物称重、测量肿瘤长径与短径并计算肿瘤体积(肿瘤体积＝长径×短径2/2)。(4)分组给药：待肿瘤直径达到5mm时，挑选状态良好的已成瘤裸鼠，于瘤体周围皮下注射浓度为5μm的相应工作液(4点注射，每点10μl，共40μl)，每天1次，连续5天后停药2天，持续至实验结束。对照组注射等量生理盐水。(5)取材：接种后30天，按10ml/kg剂量注射3.5％水合氯醛麻醉动物，取下肿瘤组织并称重。3.实验结果：结果如图4所示，与正常对照组相比，实验组(多肽或多肽组合物注射裸鼠)抑制了裸鼠体内肿瘤的生长；其中实验组2(多肽组合物注射裸鼠)又较实验组1(一种多肽单独注射裸鼠)的抑瘤效果更明显，说明是多肽组合物对肿瘤增殖产生明显的抑制作用。最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。当前第1页12