检测NAT2基因突变分型的引物、试剂盒和方法与流程

本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测与异烟肼等药物代谢有关的nat2基因分型的引物和方法。

背景技术：

结核病(tb)是由结核分枝杆菌引起的以肺部病变为主的慢性传染性疾病。近年来其发病率在全球范围内都有升高的趋势。在who推荐的标准抗结核化疗方案中，异烟肼是不可替代的一线抗结核药，其常见的不良反应有肝损伤、胃肠道反应和皮疹等。抗结核药物诱导的肝损伤(anti-tuberculosisdrug-inducedhepatotoxicity,atdh)在结核病标准治疗中发生率约为2％～28％，是结核患者停止化疗的最常见原因之一。atdh如果没有及时发现并停止用药，将导致患者肝衰竭甚至死亡。

异烟肼为胺类化合物，在体内通过n-乙酰基转移酶2(n-acetyltransferase2,nat2)代谢，最终产生无毒的乙酰肼及二乙酰肼。n-乙酰基转移酶2由nat2基因编码，是药物二相代谢酶，催化乙酰基团从乙酰coa转移到其作用底物芳香胺及杂环胺类物质上，在人体对芳香胺类及杂环类物质的活化和(或)灭活以及某些药物的代谢过程中起着重要的作用。

nat2基因的单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,snp)可引起相应代谢酶含量或酶活性的改变，从而影响个体的药物代谢能力。nat2基因多态性由其编码区的点突变所造成，根据野生型与突变型的组合形成不同的基因型：野生纯合的快乙酰型、野生突变杂合的中间型、突变纯合的慢乙酰型。研究发现快代谢型患者中极少出现药物性肝损伤，慢代谢型患者较易出现药物性肝损伤。

因此，在抗结核治疗时，结合患者nat2基因型的不同或代谢表型实施个体化治疗方案：对慢代谢型患者，在治疗初期减少异烟肼的用量，可减少药物不良反应，提高患者依从性；对快代谢型患者，则适当增加异烟肼剂量，可提高早期疗效。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种检测nat2基因突变分型的引物，采用pcr技术，可用于快速检测结核病患者nat2基因分型并判断患者的代谢表型。

检测nat2基因突变分型的引物，其特征在于所使用的扩增引物和测序引物均为：

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本发明还提供了检测nat2基因突变分型的试剂盒，包括

①血液样本dna抽提试剂；

②检测体系pcr扩增反应试剂；包括扩增引物

③测序体系试剂；包括测序引物；

④阳性对照品和阴性对照品。

其中，扩增引物和测序引物碱基序列均为：

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本发明最后提供了检测nat2基因突变分型的方法，包括以下步骤：

(1)抽提外周血中的基因组dna；

(2)以步骤1中提取的dna为模板进行pcr扩增；

(3)对步骤2中的扩增产物进行测序；

(4)将测序结果与标准序列进行比对，确定nat2的基因分型及代谢表型。

其中步骤2中的pcr扩增引物和步骤3中的测序引物的碱基序列均为：

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有益效果：本发明设计了扩增nat2基因核苷酸序列的引物。采用pcr技术，构建了稳定的扩增体系。通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。nat2基因分型很多，涉及的基因多态性位点也较多，本发明所述引物可将目前有报道的突变位点全部检测出来。相比较荧光定量pcr法及限制性酶切片段长度多态性(rflp)法降低了检测的成本和难度。本发明的2对引物涵盖了nat2基因有报道的全部分型，使得后续测序时的上下游引物均能测出目的片段，一定程度上保证了测序的准确性。

附图说明

图1为2对扩增引物的电泳图，m为markerdl2000，1-11为送检的临床样本，电泳结果显示引物扩增有效，且电泳条带单一。(a)：nat2-1电泳结果；(b)：nat2-2电泳结果。

图2为nat2基因部分阳性测序截图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。

实施例1

一种检测nat2基因突变分型的引物，其碱基序列为：

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一种检测nat2基因全外显子的试剂盒，包括

(1)基因组dna抽提试剂；

(2)检测体系pcr反应液；

(3)测序体系试剂；

其中，基因组dna提取所用试剂盒由北京天根生化科技有限公司提供；pcr扩增反应液所用kodfox由toyobo公司提供；引物由通用生物公司合成。

检测体系pcr扩增反应液包括：

pcr反应程序如下：

实施例2

骨髓/血液/组织基因组dna抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：

(1)抽提血液中的基因组dna：1)抽取300μl血液加入900μl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5min，期间再颠倒混匀几次。12，000rpm离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液ga，振荡至彻底混匀。2)加入20μl蛋白酶k溶液，混匀。3)加入200μl缓冲液gb，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮，瞬时离心以去除管盖内壁的水珠。4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀，瞬时离心去除管盖内的水珠。5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中(吸附柱放入收集管中)，12，000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱cb3放回收集管中。6)向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。7)向吸附柱cb3中加入700μl漂洗液pw(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。8)向吸附柱cb3中加入500μl漂洗液pw，12，000rpm离心30s，倒掉废液。9)将吸附柱cb3放回收集管中，12，000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱cb3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。10)将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液te，室温放置2-5min，12，000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。

(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系pcr反应液各xμl，每人份19μl分装：

x＝19μl反应液×(n份标本+1份空白对照)

n为检测标本数。

(3)加样：加入检测体系pcr反应液中1μldna；空白对照加1μl生理盐水或不加任何物质。

(4)扩增：检测在常规pcr仪上进行，可用仪器包括abiveriti(美国appliedbiosystems公司)等。反应条件如下：

pcr扩增体系试剂配制方法如下：

其中，pcr扩增引物序列为：

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(5)电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳，110v，35min，凝胶成像系统观察。

如图1所示，即为11例血液样本以相应的引物扩增后所得产物的电泳图谱。通过电泳图的分析表明本发明所述扩增有效，且条带单一。

(6)sanger测序：

取9pcr产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化：

将1μl纯化产物分别与上、下测序引物按照如下体系进行混合：

其中，测序引物序列同pcr扩增引物序列。

测序反应程序：

沉淀环节：

向完成测序反应的产物中加入2μl125mmol的edta，静置5min；加入15μl无水乙醇，漩涡混匀；13000rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50μl70％乙醇，漩涡混匀；13000rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μlhi-di后进行变性试验。

变性程序结束后，上测序仪(abi3730)测序。

(7)结果判断：分别将测序结果与nat2基因参考序列(genbank：ng_009567.1)进行比对，根据突变情况对结果进行基因分型和代谢表型判断。基因分型和代谢表型判断参考ncbi：http://nat.mbg.duth.gr/human％20nat2％20alleles_2013.htm。

实施例3

取11例临床样本，按实施例1和例2的试剂和方法提取基因组dna、配制试剂、扩增和测序。样本加入检测体系pcr反应液中1μl，阴性对照为ddh2o。电泳结果如图1所示，表明本发明所述引物对血液样本能有效扩增，且条带单一。

根据测序结果将样本进行基因分型及代谢表型判断，标本1、3、4、5、10和11的基因型均为nat2*12a，判定为快代谢型；标本2和标本7为nat2*6c/*12b，标本8为nat2*7c/*12b，均为中间代谢型；标本6和标本9有两个慢代谢型突变位点，判定为慢代谢型，结果如下表所示

本发明可快速地将nat2基因突变分型检测出来，并可判断其代谢表型。利用本发明完成的检测结果准确，在抗结核治疗时，可结合患者nat2基因型的不同或代谢表型实施个体化治疗方案。

序列表

<110>杭州艾迪康医学检验中心有限公司

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