牛SERPINA3基因遗传标记辅助检测牛生长和胴体性状的方法及其应用与流程

本发明涉及分子生物学技术和牛育种领域，涉及基因突变位点的检测，具体涉及一种牛serpina3基因snp标记辅助检测牛生长和胴体性状的方法及试剂盒。

背景技术：

我国地方黄牛品种资源丰富，但相对国外优质牛品种，呈现出体格偏小、后驱不发达、生长速度慢、屠宰率和净肉率偏低等问题，这在现代肉牛生产规模化养殖发展过程中不占有优势。因此，对我国地方优良牛品种的选育势在必行，培育出生长速度快、净肉率高的优质地方牛品种，对促进畜牧业的发展具有重要的意义。

单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,snp)是由单个碱基的置换引起的位点多态性，是生物体基因组中最为广泛的一类变异，snp既有可能在基因序列内，也有可能在基因以外的非编码序列上。snp标记因其遗传稳定性高、位点丰富且分布广泛、检测快速方便等特点，已被广泛应用。基于限制性片段长度多态性技术(restrictionfragmentlengthpolymorphism,rflp)的pcr-rflp法在snp的检测中被大量使用。应用此方法的前提是snp的位点必须含有合适的限制性内切酶识别位点。利用限制性内切酶对目的片段进行切割，然后进行凝胶电泳分析，就能准确的鉴别snp位点的基因型。

丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(serpinpeptidaseinhibitor,cladea,member3,serpina3)，又称α1-抗胰凝乳蛋白酶(α1-antichymotrypsin)，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族a亚型，由423个氨基酸组成，其抑制胰凝乳蛋白酶和组织蛋白酶g等几种丝氨酸蛋白酶的活性(kalshekerna,1996)。serpina3参与如凝血、增强活化、细胞凋亡、伤口愈合、胚胎发育、肌肉细胞和肌肉纤维细胞的分化和增殖等生理活动(péré-brissaudetal.2015；zhoujetal.2016)。serpina3的过表达会降低细胞间的黏附，抑制细胞凋亡(chelbietal.2012)导致恶性肿瘤的发生。

在畜禽生产中，肌肉的产量是决定畜禽经济价值的最重要因素之一，有研究表明，serpina3在牛骨骼肌分化中起非常重要的作用，patrickpelissier等(2008)将牛serpina3基因定位于21q24区域的辐射杂交图中且仅横跨2.35×10⁵个碱基，不同的牛serpina3具有不同的组织特异性模式和不同的糖基化和磷酸化状态。péré-brissaud等(2015)研究发现在夏洛莱肉牛中，serpina3影响牛骨骼肌细胞的分化和增殖。

目前尚未见到关于中国地方黄牛品种中serpina3基因与生长及胴体性状优势相关联的研究报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种牛serpina3基因遗传标记辅助检测牛生长和胴体性状的方法及其应用，通过对与生长和胴体性状关联的单核苷酸多态性位点的检测，利用确定的遗传标记，加快具有优质经济性状黄牛种群的建立。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种检测牛serpina3基因突变位点多态性的方法，包括以下步骤：以待测黄牛(例如，秦川牛)全基因组dna为模板，以引物对s为引物，pcr扩增黄牛serpina3基因部分片段，用限制性内切酶hhai酶切pcr扩增产物，再对酶切后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛serpina3基因上单核苷酸多态性位点(serpina3基因外显子1第357位snp，参考序列为ac_000178.1)的基因型。

优选的，所述引物对s为：

上游引物s-f：5’-ttcagcctctacaagca-3’；

下游引物s-r：5’-ttcaccaggaccaaca-3’。

优选的，所述pcr扩增的反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共34个循环；72℃延伸10min；16℃保存。

优选的，所述琼脂糖凝胶电泳所用的琼脂糖凝胶的质量浓度为3％。

优选的，所述黄牛serpina3基因上单核苷酸多态性位点有gg、ga和aa三种基因型，酶切后的产物的琼脂糖凝胶电泳结果为：gg基因型(野生纯合型)表现为252bp和203bp两条电泳条带，ga基因型(杂合型)表现为455bp、252bp和203bp三条电泳条带，aa基因型(突变纯合型)表现为455bp一条电泳条带。

一种检测牛serpina3基因突变位点多态性的试剂盒，包括上述用于进行黄牛serpina3基因外显子1第357位snp位点分型的pcr扩增引物对s，以及pcr-rflp检测所需其他试剂。

本发明具有以下有益技术效果：

本发明根据筛查得到的目的基因serpina3上的单核苷酸突变，使用pcr-rflp技术进行遗传突变分型，最终从dna水平上鉴别serpina3基因上单核苷酸多态性(snp)位点(serpina3基因外显子1第357位snp，参考序列为ac_000178.1)的基因型，具有简便、快速、准确、灵敏的优点。根据所检测的serpina3基因snp与黄牛生长和胴体性状的关联分析，serpina3基因在该snp位点的不同基因型对黄牛的生长和胴体性状有显著或极显著影响(p<0.05或p<0.01)，即serpina3基因上的该snp位点的基因型可以作为黄牛生长和胴体性状有效的选择标记，使得检测方法可以用于中国黄牛(例如，秦川牛)优质肉用生长和胴体性状的标记辅助选择，从而快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

附图说明

图1是不同样本(泳道1～10)serpina3基因pcr扩增电泳图。

图2是serpina3基因pcr扩增产物经酶切后的分型(ga、gg、aa)电泳图。

图3是serpina3基因不同基因型对应的测序图谱：自上而下分别是ga、gg和aa基因型测序图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做详细说明，所述实施例是对本发明的解释而不是限定。

本发明根据ncbi数据库中已公布的牛serpina3基因的序列设计引物，以牛基因组dna为模板，进行pcr扩增，随机等量混合个体的pcr产物为1个样品并对其进行测序。根据样品测序结果和ncbi数据库中已公布的序列，使用blast软件比对，筛查出snp位点。之后，对待测牛群体进行多态位点(snp)的pcr-rflp检测。最后，根据检测到的位点不同基因型，进行群体遗传统计分析和生长和胴体性状的关联分析，筛选出与牛生长和胴体性状密切相关的遗传标记。

i、牛serpina3基因部分dna序列的多态性检测

本发明根据数据库中已公布牛serpina3基因(ncbireferencesequence:ac_000178.1)的序列设计引物，以秦川牛的基因组dna为模板，进行pcr扩增，并对pcr产物进行测序，将测序后得到的牛serpina3基因的dna序列与ncbi公布的dna序列进行比对，发现在秦川牛serpina3基因外显子1第357位存在单核苷酸突变，鉴定为snp位点。

1、牛全血样本采集

本发明具体以中国地方黄牛品种中的秦川牛作为检测对象，具体样本采集见表1：

表1.牛全血样本的采集

2、基因组dna的提取

血液基因组dna提取过程具体步骤如下：

(1)用移液器吸取1ml半冻融状态下的血样，置于2ml的灭菌离心管中；

(2)加入1ml的pbs缓冲液，使总体积达到2ml，上下轻轻颠倒数次以彻底混匀，静置5min后，放入预冷的4℃高速离心机中，12000rpm离心10min，用移液器弃去上清；

(3)重复上面的步骤2～3次，直到上清液变清亮；

(4)加入dna抽提液800μl，混匀后，放入恒温水浴箱中56℃消化1h，1h后拿出再加入蛋白酶k15μl，56℃继续过夜消化蛋白质等，溶液变得澄清透明；

(5)将样品拿出，室温放置10min，加入1mltris饱和酚，放在冰盒中温和摇动10min，之后4℃，12000rpm离心10min；

(6)用移液器小心吸取上清液到灭菌离心管中，加入500μl的tris饱和酚和500μl的氯仿，冰盒中温和摇动10min，4℃，12000rpm离心10min；

(7)用移液器小心吸取上清液到另一个灭菌的离心管中，加入1ml的氯仿，冰盒中温和摇动10min，之后放入预冷的高速离心机中，4℃，12000rpm离心10min；

(8)小心吸取上清液到另一个灭菌的离心管中，加入至少2倍体积的无水乙醇，上下颠倒数次，使dna析出，4℃，12000rpm离心10min，弃乙醇；

(9)加入70％的乙醇1ml，温和摇动5min，4℃，7500rpm离心10min，弃乙醇；

(10)室温条件下，放置数小时，将乙醇全部挥发干净，之后加入适量灭菌水进行溶解dna，彻底溶解后用紫外分光光度计测定dna浓度和纯度。

3、引物设计

以ncbi数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中已公布的牛serpina3基因(ncbireferencesequence:ac_000178.1)为参考序列，利用primer5.0软件设计pcr引物对s，其上、下游引物扩增了牛serpina3基因第1外显子区域。

引物对s序列如下(引物设计完成时间2018年4月)：

上游引物s-f：5’-ttcagcctctacaagca-3’；

下游引物s-r：5’-ttcaccaggaccaaca-3’。

4、pcr扩增

pcr反应体系采用混合加样法，即实验中先计算出每一种成份所需要的量，然后再算出加样总量，之后均等分装到每一个pcr管，瞬时离心后扩增。

pcr反应体系见表2：

表2.pcr反应体系

pcr扩增程序：

根据引物扩增片段的大小，选用合适的引物与模板的退火温度，具体pcr扩增程序如表3所示。

表3.pcr扩增的反应程序

5、pcr产物测序

将pcr扩增产物各自混合后送上海英潍捷吉生物科技有限公司进行双向测序。测序结果与ncbi公布的序列进行比对，筛查得到秦川牛serpina3基因的1个snp位点，该突变位于牛serpina3基因第1外显子第357位(参考ac_000178.1)。

ii、牛serpina3基因snp的pcr-rflp检测

1、pcr反应条件

pcr扩增体系和反应条件如i部分的内容所述，扩增产物如图1所示，酶切体系如表4所示。酶切反应条件：于37℃水浴锅中消化过夜，之后3％琼脂糖凝胶电泳检测。

表4.酶切反应体系

2、pcr-rflp检测

当dna序列中的碱基发生突变时，可形成不同的基因型，可以通过pcr-rflp进行判定。

本发明针对秦川牛serpina3基因第1外显子第357位(参考ac_000178.1)核苷酸由g突变为a，通过watcut(http://watcut.uwaterloo.ca/)确定限制性内切酶hhai能识别的切割位点：gcg↓c。

当serpina3基因第1外显子第357位点未发生突变时，使用引物对s进行pcr扩增所得产物，具有限制性内切酶hhai的酶切位点；而当所述第1外显子第357位点由g突变为a时，使用引物对s进行pcr扩增所得产物，不再具有限制性内切酶hhai的酶切位点，从而对该位点的多态性进行检测。

根据电泳后的目的条带能够将不同的基因型区分开(与测序结果一致)，从而对snp位点实现检测(具体见图2、图3)。当限制性内切酶hhai对扩增的基因片段进行酶切消化时，如果具有限制性内切酶hhai的识别切割位点，则扩增的片段将会被切成两个片段。具体而言，gg基因型表现为252bp和203bp两条电泳条带，ga基因型表现为455bp、252bp和203bp三条不同的条带，aa基因型表现为455bp条带。其中，gg基因型是野生纯合基因型，ga基因型为杂合基因型，aa基因型是突变纯合基因型。

iii、牛serpina3基因snp位点的频率统计及其与生长性状的关联分析

1、群体中基因型的判定

利用上述的snp检测方法对194头秦川牛dna样品分别进行基因型判定。

2、snp等位基因频率和基因型频率统计分析

(1)基因频率：指一个群体中某一基因对其等位基因的相对比率。实际上就是纯合子基因型频率加上包含该基因的各种杂合子频率之和的1/2。公式如下：

pi＝[2(ii)+(ij1)+(ij2)+…+(ijn)]/2n

其中：pi为第i个等位基因的频率；ii为第i个等位基因纯合的个体数；ijn为i与jn共显性等位基因的个体数；n为群体中的个体数。

(2)基因型频率：指一个群体中某一性状的各种基因型之间的比率。因为pcr-rflp的检测结果是共显性等位基因，所以表型频率和基因型频率相一致。

paa＝naa/n

其中：paa代表某一位点的aa基因型频率；naa表示群体中具有aa基因型的个体数；n为检测群体的总数。

具体的统计结果见表5。

表5.秦川牛serpina3基因snp位点的等位基因和基因型频率

3、不同基因型的个体与生长和胴体性状数据的关联分析

采用统计软件spss20.0版本，对30±2月龄阶段秦川牛的不同基因型与生长和胴体性状数据进行了统计学的显著性检验。

1)测定的性状包括：体高、体斜长、腰角宽、宰前活重(空腹24h)、胴体重、屠宰率等。

2)测定的群体：秦川牛数据资料现场测定并记录。

3)关联分析：调用spss20.0软件中的一般线性模型，对不同基因型对生长和胴体性状的影响进行显著性检验。建立以下统计模型：

yijk＝μ+mi+gj+eijk

其中：yijk：个体表型记录；μ：个体性状的总体均值；mi：屠宰月龄效应；gj：基因型效应；eijk：随机误差。

关联统计结果见表6，秦川牛serpina3基因gg基因型个体的30月龄的体高、体斜长、宰前活重和胴体重均显著或极显著高于ga和aa基因型个体(p<0.05或p<0.01)；此外，gg基因型个体的30月龄的腰角宽和屠宰率也高于ga或aa基因型个体，因此，gg基因型为秦川牛群体中的优势基因型，可以作为分子遗传标记。在秦川牛早期育种工作中，应当优先选择gg基因型的个体留种进行扩繁，从而加快建立具有优质经济性状的牛种群。

表6.秦川牛serpina3基因不同基因型之间最小二乘均值差异显著性检验的关联分析

注：表中数值为平均值±标准误；在同一行中小写字母表示差异显著(p<0.05)，大写字母表示差异极显著(p<0.01)，相同字母表示差异不显著(p>0.05)

总之，本发明通过对牛serpina3基因dna序列进行突变分析，以及不同基因型和性状的关联分析，确定变异位点对牛生长和胴体性状的影响，为牛优良生长和胴体性状的标记辅助选择和新的优良品种的育种提供重要的研究资料，为牛生长发育和牛肉品质的改善提供科学依据。

<110>西北农林科技大学

<120>牛serpina3基因遗传标记辅助检测牛生长和胴体性状的方法及其应用

<160>2

<210>1

<211>17

<212>dna

<213>人工合成

<400>1

ttcagcctctacaagca17

<210>2

<211>16

<212>dna

<213>人工合成

<400>2

ttcaccaggaccaaca16