一种与玉米产量相关的单倍型分子标记及其应用的制作方法

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种与玉米产量相关的单倍型分子标记及其应用。

背景技术

功能分子标记(functionalmarkers)是基于目的基因基序中功能性核酸多态性位点开发而成的一类新型分子标记。关联分析方法依赖于基因组中等位基因单倍型的非随机性为基础的连锁不平衡，该方法可用于鉴定表型相关的基因和基因内部的功能基序。以一些相互间无亲缘关系的种质资源，纯系品种或者自交系为材料，针对候选基因区段进行序列多样性分析，结合生物材料的表型数据，采用统计学的方法，从而检验表型变异与候选基因序列多样性之间的关联，也是一种检验候选基因表型功能的途径(whittsr,buckleres.usingnaturalallelicdiversitytoevaluategenefunction[j].plantfunctionalgenomics,2003:123-139；wilsonlm,whittsr,am,etal.dissectionofmaizekernelcompositionandstarchproductionbycandidategeneassociation[j].theplantcell,2004,16(10):2719-2733.)。若二者之间存在显著关联，则来源于该位点的可检验该序列的多样性的分子标记，即成为相应的功能标记。此方法可充分利用自然进化和人工进化过程中所积累的遗传重组，从而高分率地检验现存物种中候选基因的遗传多样性与表型变异之间的关系，最终识别功能性的多态性及互作(baojs,corkeh,sunm.nucleotidediversityinstarchsynthaseiiaandvalidationofsinglenucleotidepolymorphismsinrelationtostarchgelatinizationtemperatureandotherphysicochemicalpropertiesinrice(oryzasatival.)[j].theoreticalandappliedgenetics,2006,113(7):1171-1183.)，进而获得功能标记。关联分析提供了统计学上的间接证据，故被称为间接类型的功能标记。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种与玉米产量相关的单倍型分子标记及应用，利用ril(recombinantinbredlines,重组自交系)群体grmzm2g039588基因的分离，和该ril群体的表型变异数据，推测该单倍型标记的遗传效应。

本发明还公开了一种上述单倍型标记在提高玉米轴粗、穗粗、穗长、行粒数以及茎磷含量、茎磷吸收效率、和茎吸磷量中的应用。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种与玉米产量相关的单倍型分子标记，所述的单倍型标记位于玉米的第2条染色体基因grmzm2g039588，从起始密码子atg开始，其物理位置下游出现了如下的变异：indel328、snp655、indel656、snp680、snp682、snp686、snp689、snp692、indel696、snp700、snp701、snp704、snp706、snp708、snp709、snp713、snp714、snp715、indel717、snp756、snp761、snp1384、indel1418、snp1426、snp1447、indel1451、snp1469、snp1474、snp1475、snp1477、snp1478、indel1484、indel1549、snp1609、snp1610、snp1612、indel1617、snp1631、snp1661、snp1693、snp1696、snp1761和snp1763。

本发明还提供了扩增或检测上述单倍型标记的引物对，所述的引物对如下：

上游引物：tctgcggcttcctgtgagtga；

下游引物：gccacgcttgccttctaatgc。

本发明还提供了所述单倍型分子标记、引物对在鉴定玉米产量中的应用，在玉米高产改良中的应用。

同时所述的单倍型分子标记在鉴定或筛选高产量玉米种质资源中的应用。

另一方面所述的单倍型分子标记在玉米育种中的应用也在本发明的保护范围之内。

本发明还提供一种检测上述与玉米产量相关的单倍型分子标记的方法，用上述引物对进行pcr扩增待检测玉米基因组dna，用上述的引物对pcr扩增待检测玉米材料基因组dna，根据扩增产物，确定待检测玉米种时候存在上述单倍型分子标记。

所述的pcr扩增体系为25μl：10ng/μldna模板1μl，maxsuper-fidelitydnapolymerase0.5μl，混合引物2μl，ddh2o8μl，phantamaxbuffer12.5μl，dntpmix(10mmeach)1μl。

所述的pcr反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，tm退火15s，72℃延伸2kb/min，共38个循环；72℃终延伸5min；12℃保存。

本发明的有益效果为：

本发明通过对ril群体三年四点的产量相关性状及两个独立重复实验的苗期含磷量相关性状进行基因grmzm2g039588比对发现，在除崇州对照条件下的玉米轴粗在其它各个环境条件下其178单倍型型对应的ril家系显著低于9782单倍型对应的ril家系(178对应的单倍型对于轴粗性状来说为优异单倍型)；在除碧峰峡处理条件下的玉米穗长在其它各个环境条件下其178单倍型对应的ril家系显著长于9782单倍型对应的ril家系(178对应的单倍型对于穗长来说为优异单倍型)；玉米穗粗四个环境的处理条件下其178单倍型对应的rl家系都显著低于9782单倍型对应的ril家系(低磷胁迫条件下9782单倍型对于穗粗来说表现更好)；玉米穗行数在崇州和碧峰峡低磷条件下178单倍型对应的ril家系显著低于9782单倍型对应的ril家系(低磷条件下9782单倍型对应穗行数来说表现更好)；对于茎中的磷含量和茎中的吸磷量，在对照条件下178单倍型对应的ril家系都显著高于9782单倍型对应的ril家系而茎磷利用率却相反，说明在正常磷含量的条件下，178单倍型对茎中的磷含量和吸磷量有利，而9728单倍型对茎的磷利用率有利。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

在对ril群体亲本1(玉米耐低磷自交系178)、亲本2(玉米低磷敏感自交系9782)和参照序列b73的grmzm2g039588基因序列比对中，共出现了43个由snp和indel组成的单倍型。本发明依据这个单倍型将材料分成的两个等位基因型，在271份ril群体(178×9782)dna中设计引物(f：tctgcggcttcctgtgagtga；r：gccacgcttgccttctaatgc)，pcp扩增包含这个单倍型的片段；pcr、电泳和测序方法如下：

1)pcr扩增

在200份ril群体基因组dna中pcr扩增grmzm2g039588基因indel标记。扩增采用maxsuper-fidelitydnapolymerase酶。该酶的pcr扩增体系如下：

pcr反应程序：95℃预变性3min；95℃变性15s，tm退火15s，72℃延伸2kb/min，共38个循环；72℃终延伸5min；12℃保存。

2)扩增产物送测序

根据测序结果，统计分离的两种基因型材料的编号和各组数目。

根据电泳和测序结果分组统计各基因型的ril群体材料。

3)实验结果

将所统计到的两个基因型分组，和2013年、2014年和2015年ril群体在两种水平磷处理(ck与t)的产量相关表型数据(包括行粒数、穗行数、突尖长、穗长、穗粗、轴粗、百粒重、穗重和轴重)以及两次独立重复实验的氮磷含量表型数据(包括茎/根含氮量、茎/根含磷量、茎/根吸氮量、茎/根吸磷量、茎/根氮利用率和茎/根磷利用率)结合起来，独立样本t-test检验在两种水平磷处理下，选取统计水平p<0.05以下的表型(表1)。该单倍型中总共包含43个位点，其中snp位点34个，indel位点9个。其中在用来基因分型的198个ril家系中，属于自交系9782单倍型的家系数为85，属于自交系178单倍型的家系数量为113。

表1低磷和正常磷条件下两种单倍型之间差异显著的性状

实施例2本发明单倍型标记在玉米产量上的应用试验

2014年4月温江农场种植亲本178、9782和ril群体271个家系。试验采用随机区组设计，单行区行长2m，株距0.4m，行距0.7m，每行种植5穴，每穴2株，对照和处理各设置2个重复。对照条件是在播种前以磷酸二氢钾的形式施50kg/hm²的p和63kg/hm²的k；以尿素的形式施180kg/hm²的n，其中在苗期施60kg/hm²，在拔节期施120kg/hm²。低磷胁迫条件下，在播种前不施磷肥，只施氮肥和钾肥，其中钾肥是以氯化钾的形式施63kg/hm²的k；氮肥分3个时期施肥，施肥时间与施肥量跟对照条件一样。在玉米拔节期对每个小区挂牌编号，田间管理略高于一般大田管理。

2014年4月和2015年4月种植ril家系和亲本的施肥与管理条件与2013年一致。

整个试验田植株开花期结束后以小区为单位进行田间株型农艺性状调查，每小区选中间长势均匀的5株进行调查，果穗成熟后，于每小区中间收取均匀的5个果穗，晾晒至恒重，进行室内考种，考种性状有：行粒数、穗行数、穗长、穗粗、轴粗、穗重、轴重、百粒重，调查统计方法具体见表2。所有的性状调查方法参照石云素等[84]《玉米种质资源描述规范和数据标准》一书。

表2产量性状的调查方法

2012年4-6月，课题组前期在雅安多营农场用219份家系的此ril群体，河沙介质进行低磷和对照的盆栽培养，对照和处理生长时间相同，对照与处理间隔2天，设置两个重复，重复间间隔7天，播种按随机顺序播种，培养至6叶1心时收集材料，每个家系2株，把根系和茎叶分装进两个纸袋中，将纸袋放入烘箱中105℃杀青30min，再转入80℃干燥72h，测定根系干重和茎叶干重之后保存。将群体材料根系干重和茎叶干重用小型粉碎式磨样机依次磨细后，称取(过1mm筛)0.200g，置于50ml消煮管中(勿将样品粘附在瓶颈上)，先滴入少量水湿润样品，加浓硫酸5ml，摇匀(放置过夜)，瓶口盖一弯颈小漏斗，在电炉上先缓缓加热，待浓硫酸分解冒大量白烟时再升高温度至380℃。约1h后消煮至溶液呈均匀棕黑色时，取下消煮管，稍冷后提起弯颈漏斗，滴加30％h2o22ml，并不断摇动消煮管，380℃加热(微沸)30min，取下，稍冷后重复滴加30％h2o21ml，380℃再消煮30min，消煮至溶液呈无色或清亮后，取下消煮管冷却，用少量水冲洗漏斗，洗液流入消煮管中。将消煮液无损地洗入100ml容量瓶中，用水定容，摇匀。过滤后放置澄清后供氮、磷测定。同步消煮空白对照。

注意事项：(1)消煮开始时火要小；(2)加h2o2时要等器皿少冷后，提起小漏斗，直接将h2o2滴入溶液中；(3)消煮要彻底。消煮好的标志是：溶液呈无色或清亮色；(4)消煮液最后要赶尽h2o2否则会影响氮、磷的比色测定。方法是消煮液呈清亮色后再煮5-10分。也可观察液面的波动，赶尽h2o2后液面比较平静。

流动分析仪测氮磷浓度及相关性状计算

使用连续流动分析仪(allianceintegralfutura)，开启仪器及其联用的计算机，并切换到操作系统，先进蒸馏水，待基线平稳后，分别切换成测氮或测磷的反应试剂，待基线再平稳后开始进样分析。分析结束后，进行最终的数据处理及输出，得到氮浓度(mg/l)、磷浓度(mg/l)。由此计算茎叶含氮量(snc)、茎叶吸氮量(snu)、茎叶氮利用率(snue)、茎叶含磷量(spc)、茎叶吸磷量(spu)、茎叶磷利用率(spue)、根含氮量(rnc)、根吸氮量(rnu)、根氮利用率(rnue)、根含磷量(rpc)、根吸磷量(rpu)、根磷利用率(rpue)。

计算方法为：组织含氮量＝测定的氮浓度×消煮后定容体积/称量干重，组织吸氮量＝组织含氮量×组织干重，组织氮利用效率＝组织干重/植株吸氮量，植株吸氮量＝茎叶吸氮量+根系吸氮量；组织含磷量＝测定的磷浓度×消煮后定容体积/称量干重，组织吸磷量＝组织含磷量×组织干重，组织磷利用效率＝组织干重/植株吸磷量，植株吸磷量＝茎叶吸磷量+根系吸磷量。氮、磷利用效率指吸收单位氮、磷含量后，所能生产的生物量，氮、磷利用效率越高，表明吸收单位氮、磷含量所生产的生物质量越多。

在低磷和正常磷条件下，玉米轴粗在除了2015年崇州基地正常磷条件下两种单倍型均值独立样本t-test检验差异不显著，在温江基地、碧峰峡农场和汾江农场差异都显著，并且9782单倍型都显著高于178单倍型。玉米穗长在除了2014年碧峰峡农场低磷条件下两种单倍型均值独立样本t-test检验差异不显著，在温江基地、崇州基地以及汾江农场差异都显著，并且178单倍型都显著高于9782单倍型。而玉米穗粗在低磷条件下所有4个地点中两种单倍型均值独立样本t-test检验差异都显著，并且178单倍型低于9782单倍型，特别是在崇州基地和碧峰峡农场中差异显著只出现在低磷条件下。穗行数也在低磷条件下崇州基地和碧峰峡农场中差异显著，178单倍型低于9782单倍型。最后，茎磷含量、茎吸磷量和茎磷利用率都在正常磷条件下两种单倍型之间的均值独立样本t-test检验中差异显著。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。