一种与辣椒滞绿基因连锁的分子标记及应用的制作方法

本发明属于辣椒育种和分子生物学领域，涉及一种与辣椒(capsicumannuuml)滞绿基因连锁的分子标记及该分子标记在辣椒果实颜色鉴定和育种中的应用。

背景技术：

辣椒，拉丁文名：capsicumannuuml.，茄科、辣椒属一年或有限多年生草本植物。辣椒属主要包括5个栽培品种：c.annuuml、c.frutescensl、c.baccacuml、c.pubescenskeep、c.chinesejacquin。辣椒原产于中拉丁美洲热带地区，原产国是墨西哥。在中国主要分布在四川、贵州、湖南、云南、陕西、河南(淅川县)、河北省鸡泽县和内蒙古托克托县。据农业部大宗蔬菜体系统计，我国辣椒栽培面积不断增加，辣椒产业取得了巨大的进步，近年来我国辣椒年播种面积在150万～200万hm²，目前已经占全国蔬菜总播种面积的8％～10％。在我国的一部分地区，人民日常饮食中已经离不开辣椒。

辣椒作为一种重要的蔬菜，其营养价值丰富，在世界各地广泛种植，且在我国成为种植面积最大的蔬菜。辣椒果实颜色丰富，在青果期，类胡萝卜素含量较低，叶绿素作为主要的色素决定着辣椒果实颜色。辣椒未成熟果有深绿、浅绿、黄绿、乳白色、紫色、黑色等多种颜色。但随着果实的发育，果实中叶绿体和白色体分化为有色体，造成类胡萝卜素的积累果实颜色转变为黄色，橙色或者红色。但是在辣椒中存在一种滞绿突变体，果实成熟期抑制叶绿素的降解，导致成熟果实中仍然包含大量的叶绿素致使果实颜色为棕色或绿色。

根据滞绿突变体叶片发育过程中叶绿素含量和光合速率的变化，将滞绿突变体划分为：非功能性滞绿突变体和功能性滞绿突变体。功能性滞绿突变体相比野生型其衰老起始时间延迟或衰老进程减缓，而在非功能性滞绿突变体其衰老过程中光合能力的下降速率与野生型相同，但叶绿素降解受到显著延缓。

功能型滞绿突变体在功能型滞绿基因的作用下减缓或阻止了茎、叶、果实中叶绿素的降解，致使滞绿型品种在成熟后茎、叶、果实中的叶绿素含量始终保持原水平而不减少，同时也保持了光合作用，这就有可能使滞绿突变体的生物学产量要比非滞绿的同物种高。从另一个角度讲滞绿基因也是与衰老有关的基因，对它的深入研究可能是解决农作物早衰的新途径。相对于功能型滞绿突变体而言，非功能型滞绿突变体很可能是叶绿素降解通路本身的缺陷，造成突变体叶绿素的滞留。通过解析非功能性滞绿突变体有利于从遗传学角度阐明叶绿素降解途径。在植物的生理成熟时期及其后期，有滞绿性状的植株很容易辨识。这一非常直观的外在表型可以作为良种繁育和杂交育种的筛选标记。

滞绿突变体在观赏类的植物选育和栽培中，也有很大的潜力。黑暗处理后叶片仍然保持绿色，其观赏价值不因长时间黑暗储藏和运输而降低。绿色蔬菜在贮存、运输或加工过程中，叶绿素容易降解，叶片发黄变质，难以适应远途运输和较长时间的贮藏，使其食用品质和商品品质下降。因此延缓绿色蔬菜叶片衰老、变质、延长保鲜期、提高其经济价值、成为一个迫切需要解决的难题。在实际生产上，虽然保持蔬菜绿色的方法有很多，但有的方法成本太高，有的方法在加工过程中由于重金属的残留而受到食品卫生法的限制，并且保绿效果不十分理想。滞绿突变体具有在衰老后叶绿素降解不明显和叶片依然保持绿色的先天优势，因而在绿叶蔬菜的育种和栽培上有巨大的应用前景和经济价值。

因此辣椒滞绿突变体作为一种重要的种质资源，将会深受未来育种家们的青睐。通过开发与辣椒滞绿基因连锁的分子标记，采用杂交和回交等技术快速的将滞绿基因与其他优良性状基因导入到植株中，为选育高质量的新品种提供基因资源。开发与滞绿基因连锁的分子标记，有利于辣椒果实颜色的选育，且为克隆滞绿基因，研究叶绿素降解的分子机制奠定了基础。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于针对辣椒果实中出现的滞绿现象，提供一种与辣椒滞绿基因连锁的分子标记sgr。为辣椒滞绿突变体的筛选，鉴定和辅助筛选辣椒果实的颜色，以及辣椒果实颜色的育种等提供新的途径。

一种与辣椒滞绿基因连锁的分子标记，为辣椒loc107866321基因编码区下游342bp处g向a的突变，所述的辣椒loc107866321基因的序列如seqidno.1所示。

进一步的，

所述的分子标记对应的基因型：a:a为具有滞绿表型的基因型、g:g和a:g为不具有滞绿表型的基因型。

进一步的，针对辣椒loc107866321基因突变设计的引物如下：

反向引物sgr-1：gatgaagtggttgcagaatg，序列如seqidno.2所示；

正向引物sgr-2：tgacatcttccctttaactttcttc，序列如seqidno.3所示；

正向引物sgr-3：tgacatcttccctttaactttcttt，序列如seqidno.4所示。

进一步的，

两个正向引物分别连接不同的荧光接头序列。

进一步的：

荧光接头序列为fam或hex(lgc公司合成)，优选：连接了荧光接头序列的正向引物sgr-2：gaaggtgaccaagttcatgctgacatcttccctttaactttcttc，序列如seqidno.5所示；连接了荧光接头序列的正向引物sgr-3：gaaggtcggagtcaacggattgacatcttccctttaactttcttt，序列如seqidno.6所示。

本发明的第二个目的是提供上述分子标记的应用，有利于辣椒果实颜色的选育，且为克隆滞绿基因，研究叶绿素降解的分子机制奠定基础。具体如下：

所述的分子标记用于鉴定和辅助筛选辣椒果实的颜色。

进一步的，

所述的分子标记用于辣椒果实颜色育种。

进一步的，

所述的分子标记应用时，采用pcr反应进行检测。

进一步的，

所述的分子标记应用时，具体包括以下步骤：

(1)以待测样品基因组dna为模板，利用分子标记的扩增引物进行touchdo-wnpcr扩增，获得扩增产物；

(2)对扩增产物进行荧光检测与分析。

进一步的，

对扩增产物进行荧光检测时，如果样品pcr产物只检测到连接了荧光接头序列的引物sgr-3对应的荧光信号，则检测位点为a:a基因型，判定为果实颜色为具有滞绿表型的棕色单株；如果样品pcr产物只检测到连接了荧光接头序列的引物sgr-2对应的荧光信号，则检测位点为g:g基因型，判定为果实颜色为不具有滞绿表型的红色单株；若同时检测到连接了荧光接头序列的引物sgr-2和sgr-3对应的两种荧光信号，则检测位点为a:g基因型，判定为果实颜色为不具有滞绿表型的红色单株。

进一步的，

所述的分子标记应用时，采用touchdownpcr。

进一步的，touchdownpcr扩增程序为：94℃15min；95℃20s；65℃-56℃60s，10个循环，每个循环退火延伸温度降0.8℃；94℃20s；57℃60s，26个循环。

本发明利用bsr定位的方法，定位到一个控制辣椒成熟果实颜色的滞绿蛋白基因(sgr)，并依据该基因的突变位点，开发了与该辣椒滞绿蛋白基因相关联的kasp分子标记。可以直接用于辣椒果实颜色表型和对应基因型的鉴定，进而依赖该分子标记进行辅助育种，能够有效的解决常规育种周期长，易受到环境影响的问题。通过早期利用该分子标记可以快速筛选到满意的植株，有效的减小了种植规模，减少了后期鉴定的工作量。提高了选择的效率和准确性。对研究果实颜色的形成机制具有重大的意义。因此，本发明在辣椒果实颜色育种实践及叶绿素代谢理论研究上均具有重要意义。

附图说明

图1为本发明的sgr分子标记在ct2与cs17构建的f2群体中进行基因分型的部分结果；

a处表示：pcr产物为连接了荧光接头序列的引物sgr-3对应的荧光信号，为果实棕色的纯合单株；

b处表示：pcr产物为连接了荧光接头序列的引物sgr-2对应的荧光信号，为果实红色的纯合单株；

c处表示：pcr产物具有连接了荧光接头序列的引物sgr-3和sgr-2两种荧光信号，为果实红色的杂合单株。

图2为bsr群体定位的2个亲本：ct2(左)，cs17(右)。

图3为ct2与cs17构建群体的bsr定位结果；

1-12代表染色体号，成熟果果实颜色主效qtl位于1号染色体，即箭头指示处。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。本发明中所涉及的辣椒种质均由湖南省蔬菜研究所提供。

实施例1辣椒滞绿蛋白基因连锁的分子标记sgr分子标记的获得

bsr定位方法

1.群体的构建

利用经过多代自交选育出的成熟果实颜色为红色的材料‘ct2’(如图2左边所示)，及果实颜色为棕色的材料‘cs17’为亲本(如图2中右边所示)，均为重测序辣椒种质资源，将棕色亲本与红色亲本进行杂交得到f1代，f1代自交后获得f2群体。

2.果实颜色鉴定

待果实成熟后，对果实颜色进行棕/红鉴定。

3.果实颜色主效qtl分析

在ct2×cs17的f2群体中分别选取30个果实颜色为红色的植株和30个果实颜色为棕色植株的成熟果，每个植株果实等量混合构建红果/棕果rna混池。利用ctab法提取4个混池总的rna。利用truseqdnaltsampleprepkit(illumina公司)对4个混池rna建库，通过illuminahiseq2000平台测序，进行转录组测序，获得的数据利用samtools软件以及自主开发的perl脚本提取多态性snp，并且计算隐性池的最大等位基因型频率(snp-index)，以及该基因型在显性池的频率，并且计算每个snp位点的欧几里得距离(ed值)。过滤掉两池测序深度都低于10个reads，以及snp-index都大于0.7的位点，最后对ed值取幂次方后进行线性回归拟合并作图，以所有位点幂次方拟合值的中位值及标准差之和的3倍作为阈值线，高于阈值线的区段作为候选区间，即将控制果实颜色棕色的基因定位在1号染色体上14.6m的区间内，如图3。1-12代表染色体号，成熟果果实颜色主效qtl位于1号染色体(箭头指示处)。

4.果实颜色主效qtl精细定位

通过步骤3获得控制棕色果实颜色qtl的染色体区域。为了进一步缩小控制棕色果实颜色基因的候选区域，分析qtl区段内的dna序列变异，开发indel和caps标记，利用开发的indel和caps分子标记对f2群体的单株进行基因分型，确定交换单株。基于果实颜色表型调查数据和确定的交换单株的基因型，将控制果实颜色棕色的基因定位在223kb区间。

5.滞绿蛋白基因相连锁的分子标记sgr的开发

果实颜色主效qtl精细定位区间内包含15个基因，基于这15个基因的注释信息，将滞绿蛋白基因loc107866321作为控制果实颜色棕色的候选基因。通过测序发现该基因在编码区(atg开始)下游342bp处发生g向a的单碱基突变。基于该单碱基突变开发了sgr分子标记。

实施例2辣椒成熟果果实颜色标记sgr的验证

利用获得的果实颜色的分子标记引物，对ct2与cs17构建的f2群体的90个单株进行果实颜色鉴定，其步骤如下：

(1)以辣椒基因组dna为模板进行touchdownpcr反应；在反应体系中加入sgr标记的3个引物，sgr标记的通用反向引物序列为sgr-1(seqidno.1)，sgr标记的两个正向引物序列为连接了荧光接头序列的sgr-2(seqidno.5)，连接了荧光接头序列的sgr-3(seqidno.6)。touchdownpcr反应体系：总体积为3μl，具体成分如下：ddh2o1.4983μl，2×kaspmastermix1.4792μl，两个连接了荧光接头序列的正向引物sgr-2(seqidno.5)，sgr-3(seqidno.6)各0.005μl(100um)，反向引物sgr-1(seqidno.1)0.0125μl(100um)，以及模板dna20-50ng。

(2)pcr反应及荧光检测在华智生物技术有限公司lgcsnplinesnp基因分型平台(均购于英国lgc公司)上进行。touchdownpcr扩增程序为：94℃15min；95℃20s；65℃-56℃60s，10个循环，每个循环退火延伸温度降0.8℃；94℃20s；57℃60s，26个循环。pcr扩增产物进行荧光分析：如果样品pcr产物只检测到连接了荧光接头序列的引物sgr-3对应的荧光信号，则检测位点为a:a基因型，判定为果实颜色为具有滞绿表型的纯合棕色单株；如果样品pcr产物只检测到连接了荧光接头序列的引物sgr-2对应的荧光信号，则检测位点为g:g基因型，判定为果实颜色为不具有滞绿表型的纯合红色单株；若同时检测到连接了荧光接头序列的引物sgr-2和sgr-3两种荧光信号，则检测位点为a:g基因型，判定为果实颜色为不具有滞绿表型的杂合红色单株。

结果为：利用sgr标记对ct2与cs17构建的f2群体90个单株进行基因分型。出现了连接荧光接头序列的引物sgr-3对应的荧光信号有28个单株，这28个单株的成熟果果实颜色都为棕色。出现了连接荧光接头序列的引物sgr-2对应的荧光信号有17个单株，这17个单株成熟果果实颜色都为红色，同时检测到连接了荧光接头序列的引物sgr-2和sgr-3两种荧光信号有45个单株，这45个单株成熟果果实颜色都为红色。结合表型调查数据发现基因型与果实颜色表型高度一致，符合率达到了100％。以上结果充分说明，sgr标记具有通用性和准确性，可以应用于辣椒成熟果果实颜色的预测、鉴定和筛选。

表1为sgr标记在ct2与cs17构建的f2群体中90个单株果实颜色及基因型。

上述鉴定结果表明，在育种中通过分子标记鉴定筛选，保留检测到引物连接了荧光接头序列的引物sgr-3对应的荧光信号的材料，就能够选育出成熟果果实颜色为棕色的纯合材料。保留检测到连接了荧光接头序列的引物sgr-2对应的荧光信号的材料，就能够选育出成熟果果实颜色为红色的纯合材料。保留检测到连接了荧光接头序列的引物sgr-2和sgr-3两种荧光信号的材料，就能够选育出成熟果果实颜色为红色的杂合材料。通过前期分子标记的筛选可以减少后期筛选鉴定的工作量，加速育种进程。

序列表

<110>湖南省蔬菜研究所

<120>一种与辣椒滞绿基因连锁的分子标记及应用

<130>无

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>801

<212>dna

<213>capsicumannuuml.

<220>

<221>gene

<222>(342)..(342)

<223>g向a的突变

<400>1

atggggactttgactgcttctctagtagctccatctaagctcaaccctgaaaagcatagc60

tctctttttgtatacaaaactagaagaaagtcccacaagaatcaatccatagtccctgtg120

gcaaggctatttggaccagctatatttgaagcatcaaagttgaaggtacttttcttggga180

gttgatgagaaaaagcacccaggaaagttgccaagaacatatacactgactcatagtgat240

attacttctaaactcactttggcaatctctcaaaccatcaataactctcagttgcaaggt300

tggtataatagacttcaaagggatgaagtggttgcagaatggaagaaagttaaagggaag360

atgtcactccatgtacattgccacattagtggaggccattttatgttagacttatttgct420

agactcagatactatatcttctgcaaagaactccctgtggttctgaaggcttttgttcat480

ggagatgagaatttactaaagaattatccagagttgcaacaagctttagtttgggtatat540

tttcactcaaacattcaagaattcaacaaagtagaatgttggggcccactcaaagatgca600

gcctccccctcatcaagtggggtaggtgggggtatgaatacaagttttacaagcaatagc660

aacatcaagtggaatttaccaaagccttgtgaagagacttgtacatgttgctttccccca720

atgagtgttatcccttggccttctactactaatgtggaaaatgggaccatacaacaaggc780

ttgcaagagcagcaaagctga801

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>未知(unknown)

<400>2

gatgaagtggttgcagaatg20

<210>3

<211>25

<212>dna

<213>未知(unknown)

<400>3

tgacatcttccctttaactttcttc25

<210>4

<211>25

<212>dna

<213>未知(unknown)

<400>4

tgacatcttccctttaactttcttt25

<210>5

<211>45

<212>dna

<213>未知(unknown)

<400>5

gaaggtgaccaagttcatgctgacatcttccctttaactttcttc45

<210>6

<211>45

<212>dna

<213>未知(unknown)

<400>6

gaaggtcggagtcaacggattgacatcttccctttaactttcttt45