一种乳酸菌分离培养基及其制备方法及乳酸菌筛选方法与流程

本发明涉及白酒酿造技术领域的一种乳酸菌分离培养基，尤其涉及一种酒醅中乳酸菌分离培养基及其制备方法及乳酸菌筛选方法。

背景技术：

白酒生产是开放式固态发酵过程，酒醅微生物群落组成十分复杂。经酿造活动的长期驯化，酒醅中的微生物在酒醅高酸、营养物质多样的环境中得以更好地生长和代谢。

乳酸菌是能够发酵糖类物质产生乳酸的一类微生物的总称，普遍存在于白酒发酵过程中，对白酒品质具有重要的影响，深入研究不同类型乳酸菌的产酸代谢机理对酿酒技术研究具有重要意义。

目前常见的乳酸菌分离方法为mrs基础培养基直接分离，固态发酵过程中的乳酸菌经过长期的驯化，更适宜在酒醅环境中生长，因此对于固态发酵酒醅中乳酸菌的分离而言，普通的mrs分离培养基选择性低，缺乏酒醅乳酸菌生长所需的一些微量物质。因此可分离乳酸菌种类及数量较少，且分离效果易受酵母等微生物的干扰。

由于菌落较小，因采用高通量筛选技术进行乳酸菌分离时还需尽可能消除背景干扰，减少培养基杂质及背景颜色对仪菌落识别的影响。

迄今为止，关于酱香型酒醅中乳酸菌的分离和筛选，尚未有在培养基中添加大曲-酒醅浸提液，且未结合高通量筛选技术对乳酸菌进行分离和筛选的报道。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供一种乳酸菌分离培养基。

本发明的进一步目的在于提供一种能够用于高通量筛选的乳酸菌分离培养基。

本发明的进一步目的在于提供一种上述培养基中所含大曲-酒醅浸提液的制备方法。

本发明的进一步目的在于提供一种上述培养基的制备方法。

在培养基中添加大曲-酒醅浸提液，能更好的模拟酿造微生物生长环境，促进酒醅微生物的分离。据报道，在对浓香型酒醅中细菌进行分离时，研究者曾尝试将出窖酒醅与煮沸过的蒸馏水振荡制备成浸提液，添加在不同的细菌培养基中，但是分离效果不突出。该浸提液未添加生产用大曲，且未进行高温煮沸。

高通量筛选技术是一种通过仪器成像快速识别和挑选微生物单菌落技术。在白酒微生物研究中引入高通量筛选技术，与人工手动挑选相比，能显著提高工作效率。但是，为了保证仪器能有效识别平板中的单菌落，进行高通量筛选的平板应满足培养基背景颜色不能太深、无太多杂质干扰等要求。因大曲-酒醅浸提液成分复杂，色素含量较高，直接添加大曲-酒醅浸提液会加深培养基背景色，且带入较多杂质。因此，为同时满足酒醅中乳酸菌分离及高通量筛选的要求，需对大曲-酒醅浸提液的制备方法及用量进行进一步优化。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案内容具体如下：

一种用于分离酒醅中乳酸菌的培养基，所述培养基的配方包括如下组分：蛋白胨(8-12g/l)、牛肉膏(6.4-9.6g/l)、酵母粉(3.2-4.8g/l)、葡萄糖(16-24g/l)、磷酸氢二钾(1.6-2.4g/l)、柠檬酸氢二铵(1.6-2.4g/l)、乙酸钠(4-6g/l)、硫酸镁(0.16-0.24g/l)、硫酸锰(0.034-0.048g/l)、琼脂(10-20g/l)、吐温(0.8-1.2g/l)、大曲-酒醅浸提液25.0～100.0ml/l，其中溶剂为水；

作为优选的实验方式，所述培养基的配方包括如下组分：蛋白胨(9-11g/l)、牛肉膏(7.2-8.8g/l)、酵母粉(3.6-4.4g/l)、葡萄糖(18-22g/l)、磷酸氢二钾(1.8-2.2g/l)、柠檬酸氢二铵(1.8-2.2g/l)、乙酸钠(4.5-5.5g/l)、硫酸镁(0.18-0.22g/l)、硫酸锰(0.036-0.044g/l)、琼脂(12-16g/l)、吐温(0.9-1.1g/l)、大曲-酒醅浸提液(25～75ml/l)，其中溶剂为水。

作为更优选的实施方式，蛋白胨10.0g/l，牛肉膏8.0g/l，酵母粉4.0g/l，葡萄糖20.0g/l，磷酸氢二钾2.0g/l，柠檬酸氢二铵2.0g/l，乙酸钠5.0g/l，硫酸镁0.2g/l，硫酸锰0.04g/l，琼脂14.0g/l，吐温801.0g/l，大曲-酒醅浸提液50-75ml/l，溶剂为水。

作为一种可以选择的实施方式，所述大曲-酒醅浸提液中大曲选自白酒生产过程中使用的由小麦发酵而成的大曲。

作为一种优选的实施方式，所述大曲-酒醅浸提液中大曲选自酱香型白酒生产过程中使用的高温大曲。

作为一种可以选择的实施方式，所述所述大曲-酒醅浸提液中酒醅选自白酒生产过程中经蒸煮后的粮食发酵而成。

作为一种优选的实施方式，所述大曲-酒醅浸提液中酒醅选自酱香型白酒生产过程中经蒸煮后的高粱发酵而成。

作为进一步优选的实施方式，所述大曲-酒醅浸提液中酒醅选自酱香型白酒生产过程中不同轮次的窖内发酵酒醅。

作为进一步优选的实施方式，所述大曲-酒醅浸提液中酒醅选自酱香型白酒生产过程中第1-3轮次的窖内发酵酒醅。

作为一种最为优选的实施方式，所述大曲-酒醅浸提液中酒醅选自酱香型白酒生产过程中第3轮次的窖内发酵酒醅。

作为优选的实验方式，培养基配方中，还含有两性霉素b6-8mg/l。通过向培养基中加入两性霉素b可以抑制样品中真菌的生长，减少杂菌对乳酸菌分离的干扰，提高了乳酸菌分离的效果。

为了进一步优化培养基成分，乳酸菌分离培养基配方中，使用酸溶液调节培养基ph为4.0-5.5。常规mrs培养基ph在6.2左右，此ph是根据酒醅酸度进行了调整后的，利于酒醅乳酸菌的生长。

作为一种优选的实施方式，所述酸溶液为乳酸溶液。

发明人通过实验发现，相对于不添加大曲-酒醅浸提液的乳酸菌分离培养基，含大曲-酒醅浸提液的培养基更适合乳酸菌的生长。

一些实施例中，发明人发现，在制备大曲-酒醅浸提液时，如果大曲：酒醅的质量比过高容易导致浸提物煮糊，并且浸提物颜色深，作为乳酸菌涂板的培养基时，不利于乳酸菌菌落的观察。如果大曲：酒醅的质量比低,则无法提供足够的酒醅中特有的营养物质，不利于酒醅中乳酸菌的生长和分离。

作为优选的方案，上述大曲-酒醅浸提液的制备方法为:

(1)称取酒醅与大曲，混合；

(2)向大曲-酒醅混合物中加入纯水煮沸；

(3)冷却后过滤得滤液备用；

(4)冷冻过夜后取出解冻，离心后取上清液备用。

作为一种优选的实施方式，步骤(2)中，煮沸时间为10-30min。

作为一种更为优选的实施方式，所述的煮沸时间为15min。

作为一种优选的实施方式，步骤(3)中，采用4层纱布进行过滤。

与滤液不经过冷冻过夜相比，滤液经过冷冻过夜处理，能够使得滤液中不易溶解的成分溶解更完全。进行解冻离心，达到更好的除色除杂的作用，从而使得大曲-酒醅浸提液背景色更低。用于制作乳酸菌培养平板，更有利于q-pix高通量筛选系统对菌落进行识别和筛选。

在一些实施例中，添加煮沸处理的大曲-酒醅浸提液的培养基，与加入未煮沸的大曲-酒醅浸提液的培养基相比，更能够促进乳酸菌的生长。

作为优选的实施方式，步骤(1)中，大曲与酒醅的质量比为1:1～1:5；

作为一种更为优选的实施方式，步骤(1)中所述大曲与酒醅的质量比为1:2-1:5。

作为一种更进一步优选的实施方式，所述大曲与酒醅的质量比为1:3-1:5。

作为一种最为优选的实施方式，所述大曲与酒醅的质量比为1:5。

作为优选的实施方式，步骤(2)中，大曲-酒醅固体混合物与纯水的质量比为1:4～1:6。

作为一种更为优选的实施方式，步骤(2)中，所述大曲-酒醅固体混合物与纯水的比例为1:4-1:5。

作为优选的实施方式，步骤(4)中，所述滤液离心条件为4℃下10000-13000rpm离心5-15min。上述乳酸菌分离培养基可通过如下方法制备获得：

(1)将蛋白胨，牛肉膏，酵母粉，葡萄糖，磷酸氢二钾，柠檬酸氢二铵，乙酸钠，硫酸镁，硫酸锰，琼脂，吐温80，大曲-酒醅浸提液加入容器中，加水定容后，使用酸溶液调节ph，灭菌；

(2)将两性霉素b溶于二甲基亚砜，过滤灭菌得贮存液；

(3)将步骤(1)灭菌后的混合物冷却至60℃以下，加入步骤(2)的两性霉素b溶液混匀；

作为一种可选的实施方式，步骤(1)中在121℃对培养基进行灭菌15～20min。

还有一方面，本发明提供了所述的培养基结合高通量仪器在分离酒醅中乳酸菌的应用。

其中，所述含乳酸菌的酒醅选自白酒酿造过程中经蒸煮发酵后的酒醅。

作为一种优选的实施方式，所述的酒醅选自酱香型白酒酿造过程中不同轮次的酒醅。

作为一种优选的实施方式，所述酒醅选自酱香型白酒生产过程中经第一～三轮次发酵后的酒醅。

作为一种更为优选的实施方式，所述酒醅选自酱香型白酒生产过程中经第三轮次发酵后的酒醅。

本发明同时还提供了一种分离乳酸菌的方法，其中该方法包括采用平板稀释法将待分离的乳酸菌株置于上述乳酸菌分离培养基中进行培养，从而达到乳酸菌株分离的作用。其余的培养条件和方法，则与现有技术中乳酸菌的培养条件或方法相同。

此外，本发明还提供了一种采用q-pix高通量筛选系统对以上分离的乳酸菌进行筛选的方法。传统单菌落的挑选多为人工手动挑选，不仅费时，而且易受污染，高通量筛选系统通过批量操作，不仅极大地提高了筛选效率，而且能很好地避免杂菌污染，但其成像系统要求培养基颜色不宜太深，且不能有过多的杂质干扰菌落识别。

具体为将培养好的平板及含有培养基的96孔板揭盖置于预先灭菌的筛选仪器中，通过q-pix成像系统识别平板菌落，选取需挑选菌落，确定后由仪器进行自动挑选。

本发明的有益效果：

(1)本发明首次在乳酸菌的分离培养基中添加大曲-酒醅浸提液，该培养基能更好的模拟酿造微生物生长环境，促进酒醅微生物的分离。发明人在实验过程中，在对浓香型酒醅中细菌进行分离时，曾尝试将出窖酒醅,与煮沸过的蒸馏水振荡制备成浸提液，添加在不同的细菌培养基中，用于分离细菌。酒醅中也含有丰富的营养成分，但是分离效果不突出。此外，发明人还尝试了将未经高温煮沸将大曲-酒醅浸提液用于乳酸菌的分离，也很难有效的分离出乳酸菌，因此，在本发明中，高温煮沸以及大曲和酒醅共同的浸提液是必须的。

(2)本发明的培养基与在直接添加大曲-酒醅浸提液的培养基相比，能克服培养基背景色加深，杂质多的缺点，能同时满足酒醅中乳酸菌分离及高通量筛选的要求。制作的培养平板能够用高通量筛选技术进行菌落识别与筛选。与人工手动挑选相比，能显著提高工作效率。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举较佳实施例，详细说明如下。

附图说明

图1.本发明培养基对乳酸菌生长以及筛选效果的影响。

图2浸提液离心处理对乳酸菌筛选的影响。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。

本发明中实施例使用的乳酸菌为经形态学鉴定确认，且在白酒酿造过程可以在酒醅中生长的乳酸菌。

本发明实施例中的乳酸菌来自的酒醅为白酒生产过程中的经蒸煮发酵后的酒醅，具体为酱香型白酒生产过程中经第三轮次发酵后的酒醅。

本发明实施例中大曲-酒醅浸提液中使用的大曲来源于白酒生产过程中使用的由小麦发酵而成的大曲，具体为酱香型白酒生产过程中使用的高温大曲。

本发明中高通量筛选仪器q-pix进行识别和挑选的方法为：将培养好的平板及含有培养基的96孔板揭盖置于预先灭菌的筛选仪器中，通过q-pix成像系统识别平板菌落，选取需挑选菌落，确定后由仪器进行自动挑选。

实施例1乳酸菌分离培养基配方及其制备方法

表1培养基的组分及含量

大曲-酒醅浸提液制备方法为：

(1)按照表1所示大曲-酒醅比例与含量，称取酒醅与大曲，混合；

(2)向大曲-酒醅混合物中加入纯水煮沸10～20min；

(3)冷却后，采用4层纱布进行过滤，得滤液备用；

(4)将上述滤液-20℃冷冻过夜后取出解冻，4℃下12000rpm离心10min后，取上清液备用。

乳酸菌分离培养基制备方法：

(1)按表1配方称取各组分，将将蛋白胨，牛肉膏，酵母粉，葡萄糖，磷酸氢二钾，柠檬酸氢二铵，乙酸钠，硫酸镁，硫酸锰，琼脂，吐温80和大曲-酒醅浸提液加入容器中，加入乳酸溶液，调节ph至5.5，121℃灭菌15-20min；

(2)将两性霉素b溶于二甲基亚砜摇匀，过滤灭菌，制成16g/l母液备用；

(3)将步骤(1)灭菌后的混合物冷却至60℃以下，与步骤(2)的两性霉素b母液混匀。

实施例2本发明培养基对乳酸菌生长以及筛选效果评价

为了评价本发明培养基对酒醅乳酸菌生长情况的影响以及对酒醅乳酸菌筛选效果的评价，本发明采用平板稀释法将酒醅菌液稀释到10^-2～10^-3，涂布于实施例1中的各组培养基上进行厌氧培养，培养时间为5-7天。挑选稀释浓度为10^-2乳酸菌生长平板进行对比，生长情况如表2、图1所示。

将这些接种有乳酸菌培养平板采用高通量筛选仪器q-pix进行识别和挑选。检测结果如表2所示。

其中，用1、2、3、4、5、6、7、8表示背景颜色的深浅级别，其中颜色深度排序为1<2<3<4<5<6<7<8，即1到8代表背景颜色依次升高。

表2本发明培养基对酒醅中乳酸菌生长的影响

实验结果：结果如表2所示，经形态学鉴定，培养基1-4及对照组1(普通mrs培养基)培养基中均有乳酸菌生长。

对比组没加浸提液所以背景颜色是最浅的，但乳酸菌数量最少，无法达到实验要求，且培养基中有少量杂菌生成。

培养基1-4中因为加入了浸提液，培养基数量明显多于对照组1中的培养基。说明浸提液用量在25-100ml/l时，有利于乳酸菌的生长。并且在目前的培养基背景颜色情况下，高通量筛选仪器q-pix也能够识别和挑选菌落。

所以，培养基1-4能够较好地实现乳酸菌的筛选，但数量略有差异。其中，培养基2乳酸菌的生长数量最多，且背景颜色满足仪器识别和筛选要求，效果最好。

实施例3培养基中大曲与酒醅的不同配比对乳酸菌生长以及筛选效果的影响

为了测试大曲与酒醅的不同配比对乳酸菌生长的影响，将酒醅乳酸菌通过平板稀释法涂布在含有表3所示比例的大曲：酒醅浸提物的培养基上进行培养，各组培养基其余组分与含量及其他情况同实施例1中的培养基2。结果如表3所示。其中培养时间和乳酸菌稀释浓度与实施例2相同。

将这些接种有乳酸菌培养平板采用高通量筛选仪器q-pix进行识别和挑选，检测结果如图2所示。

其中，用1、2、3、4、5、6、7、8表示背景颜色的深浅级别，其中颜色深度排序为1<2<3<4<5<6<7<8，即1到8代表背景颜色依次升高。

表3大曲与酒醅的不同配比对酒醅样品乳酸菌生长的影响

实验结果：根据结果可知大曲与酒醅的不同配比对酒醅乳酸菌的生长具有一定的影响作用，当大曲与酒醅比例为1:5时，酒醅乳酸菌生长情况最好，且背景颜色深度能够满足仪器识别和筛选的要求，效果最好。

当比例为1:6时，虽然仪器能够识别菌落，但由于大曲比例减少，提供的营养物质减少，乳酸菌生长数量较少，无法满足实验要求。

以上结果说明，大曲-酒醅浸提液中的大曲与酒醅的配比能够影响乳酸菌的生长，以及背景颜色深度，从而影响乳酸菌的分离效果。

实施例4培养基中大曲-酒醅混合物与水的不同比例对乳酸菌生长的影响

为了测试大曲酒醅浸提液制备方法中，大曲-酒醅混合物与水的不同配比对乳酸菌生长的影响，将酒醅乳酸菌通过平板稀释法涂布在含有表4所示比例的大曲-酒醅浸提物液的培养基上进行培养。除了大曲-酒醅浸提物：水的比例不同以外，各组培养基其余组分与含量同实施例1中的培养基2。其中培养时间和乳酸菌稀释浓度与实施例2相同。结果如表4所示。

表4大曲-酒醅混合物：水的不同比例对酒醅样品乳酸菌生长的影响

实验结果：如表4所示，大曲-酒醅混合物与水的比例分别为1:4、1:5、1:6时，系统均能识别菌落，但乳酸菌数量各不相同，且随着水的比例增加，乳酸菌数量减少。而当大曲-酒醅混合物与水的比例为1:3时，由于酒醅和大曲的吸水作用，浸提液呈粘稠状，导致过滤困难，无法获取浸提液，因此大曲-酒醅混合物与水的最佳比例确定为1:4。

实施例5浸提液的制备方法对乳酸菌生长以及筛选的影响

一、培养基中的浸提液煮沸处理对乳酸菌生长的影响

试验1大曲-酒醅浸提液制备方法

(1)按照实施例1中的培养基1所示，大曲:酒醅质量比5:1，称取酒醅与大曲，混合；

(2)向大曲-酒醅混合物中加入纯水200ml，混匀，煮沸20min；

(3)冷却后，采用4层纱布进行过滤，得滤液备用；

(4)将上述滤液冷冻过夜后取出解冻，4℃下12000rpm离心10min后，取上清液备用。

对比例1大曲-酒醅浸提液制备方法

(1)称取与试验1相同质量的酒醅与大曲，混合；

(2)向大曲-酒醅混合物中加入纯水200ml，混匀；

(3)冷却后采用4层纱布进行过滤，过滤得滤液备用；

(4)将上述滤液冷冻过夜后取出解冻，4℃下12000rpm离心10min后，取上清液备用。

为了测试大曲-酒醅浸提液煮沸后使用对乳酸菌生长的影响，本发明分别使用试验1和对比例1的制备方法得到的浸提液来配制乳酸菌培养基，两组培养基其余组分、含量以及制备方法与实施例1中的培养基4相同，配制得到的培养基分别为培养基5和培养基6。通过平板稀释法将酒醅样品中的乳酸菌涂布在三种培养基上。乳酸菌生长情况结果如表5所示。其中培养时间和乳酸菌稀释浓度与实施例2相同。

表5大曲-酒醅浸提液煮沸处理对乳酸菌生长的影响

实验结果：由表5可知，经煮沸的浸提液能分离出更多的酒醅乳酸菌，且无杂菌干扰，仪器能够正确识别乳酸菌，因此，大曲-酒醅浸提液煮沸有利于本发明酵母菌的分离与筛选。

二、培养基中的浸提液离心处理对乳酸菌筛选的影响

试验2大曲-酒醅浸提液制备方法

(1)按照实施例1中的培养基4所示，大曲:酒醅质量比5:1，称取大曲与酒醅，混合；

(2)向大曲-酒醅混合物中加入纯水200ml，混匀，煮沸20min；

(3)冷却后，采用4层纱布进行过滤，得滤液备用；

(4)将上述滤液冷冻过夜后取出解冻，4℃下12000rpm离心10min后，取上清液备用。

对比例3大曲-酒醅浸提液制备方法

(1)称取与试验2相同质量的大曲与酒醅，混合；

(2)向大曲-酒醅混合物中加入与试验2相同体积的纯水200ml，混匀，煮沸20min；

(3)冷却后，采用4层纱布进行过滤，得滤液备用。

为了测试大曲-酒醅浸提液离心后使用对乳酸菌生长的影响，本发明分别使用试验2和对比例2的制备方法得到的浸提液来配制乳酸菌培养基，两组培养基其余组分、含量以及制备方法与实施例1中的培养基3相同，配制得到的培养基分别为培养基7和培养基8。通过平板稀释法将酒醅样品中的乳酸菌涂布在两种培养基上。分离获得的菌株培养平板采用高通量筛选仪器q-pix进行挑选。具体为：将培养好的平板及含有培养基的96孔板揭盖置于预先灭菌的筛选仪器中，通过q-pix成像系统识别平板菌落，选取需挑选菌落，确定后由仪器进行自动挑选。

酒醅中乳酸菌筛选结果如表6所示。其中培养时间和乳酸菌稀释浓度与实施例2相同。

表6大曲-酒醅浸提液离心处理对乳酸菌筛选的影响

实验结果：如表6及图2所示，经冷冻离心后，酒醅乳酸菌数量无显著差异。但未离心的培养基，背景颜色较深，且有杂质干扰，不能满足仪器识别以及筛选的要求；而离心后培养基背景无显著杂质，高通量筛选仪器的成像系统能有效识别菌落。因此，确认浸提液冷冻离心处理利于系统的成像识别。上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。