一种鉴定杜氏棱鳀和赤鼻棱鳀的方法与流程

本发明属于鱼类鉴定技术领域，具体涉及一种鉴定杜氏棱鳀和赤鼻棱鳀的方法，即一种鉴定赤鼻棱鳀和杜氏棱鳀鱼卵和仔稚鱼来源的分子鉴定方法。

背景技术：

海洋鱼类是人类生活甚至生存所需的重要自然资源，历史记载我们的祖先2000多年前就开始捕捞并不断开发近海的渔业资源。海洋渔业资源中具有多种可开发利用且价值较高的经济动物，这些动物在维持海洋生态系统的平衡中也具有重要作用。另一方面，海洋生态环境的改变也影响了渔业资源的种类和分布变化。例如，我国浙江舟山渔场一直以来盛产带鱼、大黄鱼、小黄鱼和乌贼，即著名的“四大海产”，但近些年来捕捞量逐年减少甚至大黄鱼几乎绝迹。而在渤海海域，赤鼻棱鳀已经成为产量位于第五的重要鱼类。这些海洋渔业资源的变化影响了渔业经济的发展和渔民的收入，还可能影响生态平衡。因此，开展渔业资源调查和鉴定是海洋资源监测、产地溯源保护、生物多样性研究和开发利用以及海洋保护区建设的前提，而鱼卵和仔稚鱼的鉴定是鱼类资源调查鉴定的前提和基础。

鱼卵和仔稚鱼是鱼类繁殖季节产生后代的一种重要方式，其种类、分布区域和数量是海洋环境监测和渔业资源调查以及科学研究的重要指标，它的数量还直接决定了成鱼资源的补充量。鱼卵和仔稚鱼在海洋生态系统浮游生物中，既是能量的消费者又是食物链中的被捕食者，对维持生态平衡具有重要意义。在鱼卵和仔稚鱼的研究中，形态学鉴定是基本手段，主要依据鱼卵和仔稚鱼的形态、大小、卵周隙、脂肪球、内膜、绒毛膜、卵黄间隙和颜色等特征对其进行种类鉴定。但鱼卵早期发育阶段时间短，形态变化复杂，形态差异不明显，有记载可查的资料少，对于技术人员的经验依懒性较大，限制了其在鱼类早期鉴定中的应用。dna条形码技术是近年来发展最快且具有通用性的鱼类鉴定技术，也在鱼卵和仔稚鱼的鉴定中得到了大量的实践应用，但对于一些近缘物种或者对比数据库中缺少数据资料的物种也存在难以鉴定等不足。

棱鳀属鱼类隶属鲱形目、鳀科，是一种分布广泛的近海中上层小型鱼类，在印度洋-太平洋均有分布。棱鳀鱼类为小型鱼类，在我国沿海渔业捕捞中经济价值不高，但由于其生长快、具有较快的资源恢复能力，对生态系统能量流动与转换起到重要作用，已经成为海洋食物网络中关键物种之一，也逐渐成为重要的捕捞对象，赤鼻棱鳀在渤海海域已经成为第五大优势鱼类种群。我国沿海分布的棱鳀有6种，分别是赤鼻棱鳀、中颌棱鳀、杜氏棱鳀、汉氏棱鳀、长颌棱鳀和黄吻棱鳀。由于其经济价值不高，因此对棱鳀的研究较少，对鱼卵的鉴定研究更少，现有报道表明即使应用dna条形码的coi基因和16srrna基因也难以对我国6种棱鳀进行有效的鉴别。因此，建立一种能够鉴别棱鳀种类的方法，对于开展海洋渔业调查中棱鳀属鱼卵和仔稚鱼的判定具有重要意义。

技术实现要素：

本发明提供了一种基于pcr扩增产物大小鉴定赤鼻棱鳀和杜氏棱鳀鱼卵和仔稚鱼的方法，从而解决现有形态学鉴定和dna条形码技术对于相近物种赤鼻棱鳀和杜氏棱鳀鱼卵无法鉴定的问题。

本发明首先提供一种用于鉴定来自舟山海域赤鼻棱鳀和杜氏棱鳀的分子标记，所述的分子标记为能够区分核酸序列为seqidno:1的赤鼻棱鳀分子片段和核酸序列为seqidno:2的杜氏棱鳀分子片段之间的碱基序列和大小差异；

seqidno:1片段如下：

aaagaggagagattcaaactcccgccgctaacccccaaagctagcattctgaatttaaactactctttgattctccattataacttaaagacacacgtaataaatttatgtttaatactacagtataaatgtaatcaaaataatatagagtacataactatacacgtcaatgtaactcgcacatcatcataacactaatacatactatgtattatattacatatattatggtattaatacatactatgtattatattacatatattatggtattaatacatactatgtattatattacatatattatggtattaatacatactatgtattatattacatatattatggtattaatacatactatgtattatattacatatattatggtattaatacatactatgtattatattacatatattatggtattaatacatactatgtattatattacatacactatggttttaagatatacctggaggtgtattataatgaatctaaattaaataaaattaagaaaccataagttgatataaaacaaacaggaaagaat

seqidno:2片段如下：

aaagaggagagattcaaactcccgccgctaacccccaaagctagcattctgaatttaaactactctttgattctccattataacttaaagacacacgtaataaatttatgtttaatactacagtataaatgtaatcaaaataatatagagtacataactctacacgtcaatgtaactcgcacatcatcataacactaatacatactatgtattatattacatatattatgatattaatacatactatgtattatattacatatattatgatattaatacatactatgtattatattacatatattatgatattaatacatactatgtattatattacatatattatgatattaatacatactatgtattatattacatatattatgatattaatacatactatgtattatattacatatattatgatattaatacatactatgtattatattacatatattatgatattaatacatactatgtattatattacatacactatggttttaaaatatacctgaaggtgtattataatgaatctaaattaaataaaattaagaaaccataagttgatataaaacaaacaggaaagaat

所述的分子标记，其一种为测序引物，所述的测序引物能够对序列为seqidno:1和核酸序列为seqidno:2的核酸片段进行测序；

所述的分子标记，其另一种为pcr扩增引物，其中一种具体的pcr引物，包括上游引物和下游引物，其序列信息如下：

上游序列fdpf1：5＇-aaagaggagagattcaaact-3＇(seqidno:3)、

下游序列fdpr1：5＇-attctttcctgtttgtttta-3＇(seqidno:4)；

另一种引物对，其序列信息如下：

上游引物：fddf2：5'-taactcgcacatcatcataa-3'(seqidno:5)

下游特异性引物fddtr1：5'-tatcttaaaaccatagtgta-3'(seqidno:6)；

再一种引物对，其序列信息如下：

上游引物fddf3；atcatcataacactaataca(seqidno:7)

下游引物fddr3：tagattcattataatacacc(seqidno:8)

本发明还提供了一种用于鉴定赤鼻棱鳀和杜氏棱鳀鱼卵的pcr方法，是使用上述的引物对进行扩增检测，具体步骤如下：

1)采集待鉴定的鱼卵、仔稚鱼或成体鱼类或部分组织，采集样品均可无水乙醇保存备用。使用动物组织dna提取试剂盒提取待测组织的dna，经质量和浓度检测后备用；或使用直接pcr试剂盒处理等同类技术获得pcr扩增模板即可。

2)配制pcr扩增体系，包含合适浓度的pcr缓冲液、dntp、mgcl2、taqdna聚合酶、不低于总量30ng的样品dna模板，引物fdpf1、fdpr1和双蒸水；引物fdpf1和fdpr1的pcr反应程序为：95℃变性5min；95℃变性30s，54.5℃退火35s，72℃延伸35s为一个循环，共计32个循环；然后72℃保持10min，结束后降温至4℃。

3)pcr反应程序如步骤2所述，退火温度为42～58℃均可扩增特异性产物，最优退火温度为54.5℃。对pcr产物大小进行检测，依据pcr产物大小判断鉴定结果，扩增所得556bp判定为赤鼻棱鳀，所得pcr产物为595bp时为杜氏棱鳀。

上述的检测方法还可以进一步延伸为pcr-rflp方法，当使用选择的内切酶ahaiii和aeui或同工酶进一步对pcr产物酶切时，ahaiii可以把杜氏棱鳀595bp的扩增产物酶切为57bp、86bp和452bp三个大小不同的片段；而赤鼻棱鳀产生57bp和499bp两个片段。

aeui内切酶在杜氏棱鳀595bp的pcr产物中没有酶切位点，酶切后保持大小不变；但是aeui把赤鼻棱鳀556bp酶切为480bp和76bp的产物。

本发明与现有形态学鉴定方法相比，不受检测人员的经验影响，也不受鱼卵发育阶段和形态大小的影响，在一定程度上拓展了检测的适用范围，使得检测技术更易于推广使用。与现有dna条形码技术相比，所用技术平台完全一致，但更重要的是解决了现有coi条形码无法鉴别两种棱鳀的问题。因此判定本发明所建立的方法是现有dna条形码技术的重要补充，可以用于鉴定两种近缘物种棱鳀的鱼卵。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图和技术信息。

图1：鱼卵的单个照片，其中左侧照片为44号样品，右侧照片为46号样品；

图2：16srrna基因扩增鱼卵pcr产物结果图；

图3：赤鼻棱鳀和杜氏棱鳀的电泳鉴定图，其中泳道1为杜氏棱鳀产物大小595bp，泳道2为赤鼻棱鳀产物大小556bp；

图4：赤鼻棱鳀和杜氏棱鳀的测序图，上下图分别表示赤鼻棱鳀和杜氏棱鳀，上图箭头和下图方框分别表示39bp的缺失位置和插入序列；

图5：drai酶切杜氏棱鳀和赤鼻棱鳀电泳图，其中泳道d1和d2分别是杜氏棱鳀pcr产物和drai酶切产物；泳道c1和c2分别是赤鼻棱鳀pcr产物和drai酶切产物；

图6：mavi酶切杜氏赤鼻棱鳀电泳图，其中泳道d1和d2分别是杜氏棱鳀pcr产物和mavi酶切产物；泳道c1和c2分别是赤鼻棱鳀pcr产物和mavi酶切产物。

具体实施方式

申请人经过对我国舟山海域大量鱼卵的dna鉴定和基于鱼类通用dna条形码coi序列无法鉴定赤鼻棱鳀和杜氏棱鳀鱼卵的问题，对赤鼻棱鳀和杜氏棱鳀的mtdna不同区域序列做了对比分析，经pcr扩增测序对比发现了两个物种中一段具有差异的插入-缺失多样性序列和部分核苷酸差异，并依据两者两端的保守序列设计引物，扩增产物在二者间具有长短差异，因此据此可以判断两种不同的鱼卵。本方法还可以依据两个物种扩增产物序列的不同选择内切酶建立pcr-rflp方法，以便做进一步证明，从而促成了本发明。

以下用具体实施方式对本发明进行具体阐述，下列所述实施例中的过程和操作是对本发明的进一步说明，不应当作对本发明的限制条件。实施例中采用的分子生物学技术或步骤使用市售同类产品或参照《分子克隆》也可以达到同等效果。实施例中所用的鱼卵和仔稚鱼样品均按照《海洋调查规范》(gb/t12763.6—2007)使用大型浮游生物网在浙江舟山海域进行水平拖网，采集到的标本现场进行初步处理，用无水乙醇保存，回实验室后对样品进行拍照、形态鉴定和分子鉴定。

实施例1：鱼卵dna的提取和质量检测

对于收集的鱼卵，在实验室拍照的同时依据大小和形态学特征进行初步鉴定后进行分类保存，按照种类取5-10枚鱼卵进行dna的分子鉴定。鱼卵的dna提取参照动物组织dna提取试剂盒(杭州新景试剂开发有限公司)说明书进行并做适当修改。鱼卵从保存液(无水乙醇)中取出，室温放在吸水纸上吸干，置入1.5ml离心管并晾干，加入蛋白酶k后参照试剂盒说明书进行dna提取。由于鱼卵组织少，所用试剂材料依据比例降低。dna提取完成后使用试剂盒配备的te对dna溶解，te使用量为50ul，te溶解后的dna置于4℃保存备用。利用核酸定量仪nanodrop2000测定鱼卵dna的浓度和纯度，结果显示其浓度在20～140ng/ul，od260nm/280nm在1.8～2.0之间，适于进行进一步分子鉴定。

实施例2棱鳀鱼卵dna条形码(coi)的鉴定及存在问题

准确的鱼卵鉴定是开展海洋生态研究和资源开发利用的前提与基础。传统的鱼卵分类主要依据其外部形态特征，但是受到其形态变化和保存条件的限制，鉴定准确与否也与研究人员的经验有着密切关系。基于分子生物学发展起来的dna条形码技术是鱼类分子鉴定的首选，其在鱼类鉴定中已显示出简单方便和良好的鉴别力等多方面的优点，是目前使用最为广泛的鱼类分子鉴定方法。线粒体(mtdna)中细胞色素氧化酶i(coⅰ)基因是dna条形码的主要靶标，我们参照文献(ivanovanv,zemlakts,hannerrh,etal.universalprimercocktailsforfishdnabarcoding.molecularecologynotes,2007,7(4):544-548.)、(王萍亚,黄朱梁,金雨婷,汤海凤,孙瑛,赵进,管峰.四组鱼类dna条形码引物的筛选与优化.食品安全质量检测学报,2018,9(16):4387-4392.)选择coi引物和pcr反应条件对鱼卵进行进一步的鉴定。其引物序列见表1，引物由杭州擎科生物技术有限公司合成。

表1：dna条形码所用的引物序列

pcr反应体系20μl，包含(2.0mmmgcl2)10×buffer2μl，4条上下游引物各1μl(10μm)，dntps1.6μl(25mm)，taqpolymerase0.2μl(5u/μl)，dna模板2μl(约40ng)，超纯水补足至20μl。

pcr程序：95℃预变性5min；30个循环，(95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s)；循环反应结束后72℃延伸10min，然后自动降温4℃保存。pcr产物经琼脂糖电泳检测后依据条带亮度，送往杭州擎科生物技术有限公司进行双向直接测序(m13f和m13r为测序引物)。

使用dnastar软件对测序结果进行序列校对，确定上下游测序的准确性和一致性，经拼接后进行物种鉴定，在ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)和bold数据库(http://www.boldsystems.org)同时进行对比，当对比结果的相似性>98％时认为鉴定到种，同时确认与形态学鉴定是否一致。

对选取的200枚鱼卵的pcr测序结果对比鉴定表明，90％(185/195)以上的鱼类能成功鉴定到种，但是部分样品(鱼卵编号44、46、47和58等共9个样品)对比后无法鉴定到种。但是按照测序结果可以分成两种情况。这里以44和46号样品(如图1)为代表说明情况及存在不能鉴定到种的问题。

44号鱼卵测序编辑后得到707bp的序列，结果如下：

tcaactaatcacaaagatattggcaccctttacttagtgttcggtgcctgggcagggatagtaggaacagcattaagcctcttgatccgagcggaattaagccaaccaggagcacttctaggggacgatcaaatttataatgtaatcgtgactgctcatgccttcgtaatgattttcttcatagtaatgccaattctaattggcggctttggaaactgactagtgccgcttatattaggggcacctgacatagcattcccacgaataaacaacataagtttctgactccttcccccctcattccttttattacttgcctcatcaggggttgaagcaggggcaggaaccggatggacagtgtacccgcccttagcaggaaatttagcccacgcaggagcatcagtggaccttaccattttttcattacacttggcaggaatctcgtccattctaggggctattaattttattactacaattattaacatgaaaccgcctgcaatctcacaatatcagacacccctattcgtctgagccgtactaatcacagcagtactcttactcctatccctcccagtgctagctgccggaattacaatactttttacagatcggaaccttaacaccaccttctttgacccggcaggggggggtgacccaatcctttaccagcacttgttctgattcttcgggcaccctgaagtcta

46号鱼卵测序编辑后得到707bp的序列，结果如下：

tcaactaatcacaaagatattggcaccctttacttagtgttcggtgcctgggcagggatagtaggaacagcattaagcctcttgatccgagcggaattaagccaaccaggagcacttctaggggacgatcaaatttataatgtaatcgtgactgctcatgccttcgtaatgattttcttcatagtaatgccaattctaattggcggctttggaaactgactagtgccgcttatattaggggcacctgacatagcattcccacgaataaacaacataagtttctgactccttcccccctcattccttttattacttgcctcatcaggggttgaagcaggggcaggaaccggatggacagtgtacccgcccttagcaggaaatttagcccacgcaggagcatcagtggaccttaccattttttcattacacttggcaggaatctcgtccattctaggggctattaattttattactacaattattaacatgaaaccgcctgcaatctcacaatatcagacacccctattcgtctgagccgtgctaatcacagcagtactcttactcctatccctcccagtgctagctgccggaattacaatacttcttacagatcggaaccttaacaccaccttctttgacccggcaggggggggtgacccaatcctttaccagcacttgttctgattcttcgggcaccctgaagtcta

对比上述44和46号两个样品序列，相似性99.7％，几乎完全相同。提交ncbi进行blast对比，最大相似性与ku761588(赤鼻棱鳀mtdna全序列)和ap017953(杜氏棱鳀mtdna全序列)均为99％以上；而在bold数据库对比鉴定结果也未能按照现行分类标准进行种类区分。因此，鱼类dna条形码coi不能鉴别赤鼻棱鳀和杜氏棱鳀。

实施例3:两种棱鯷类鱼卵dna的16srrna基因鉴定及存在问题

鉴于实施例2中dna条形码coi通用引物扩增区对疑似杜氏棱鳀和赤鼻棱鳀鱼卵样品无法鉴别到种的问题，因此需要进一步进行鉴定。物种鉴定中16srrna基因也是常用于dna条形码鉴定的靶标基因之一，常常作为coi基因的重要补充，在多种鱼类和鸟类以及爬行类和昆虫的鉴定中起到了重要作用，参照文献(ivanovanv,zemlakts,hannerrh,etal.universalprimercocktailsforfishdnabarcoding.molecularecologynotes,2007,7(4):544-548.)合成引物对实施例2的鱼卵样品进行进一步的分子鉴定。

上游引物16sarl：5’-cgcctgtttaccaaaaacat-3’，

下游引物16sbrh：5’-ccggtctgaactcagatcacgt-3’。

pcr程序优化后扩增产物经电泳检测，pcr产物直接送往杭州擎科生物技术有限公司进行测序。

上述两种鱼卵经测序后对比编辑，所测得序列完全一致(615bp)，序列如下：

cgcctgtttaccaaaaacaccgcctcttgcaaaacaaagtataagaggtcccacctgccctgtgaccaaaagtttaacggccgcggtatcctaaccgtgcgaaggtagcgcaatcaattgccttttaaatgagggcctgtatgaatggtataacgagggtttaactgtctcttttttccagtcagttaaactgatctgtccgtgcagaagcggacataattttacaagacgagaagaccctatggagctttagatactaaccaaccatgaaaagcaacccaagataaaaataccccacaccccatggatctggaataaaaatcttaggttggggcgaccacgggagaaaagaaagctcccaagcagatcagggcaaccctgaaaccaaggactacaaccctaagtcacaaaaactttgactgacacgatccggcttaacagccgattaacgaacaaagttaccctagggataacagcgcaatcccctcccagagtccatatcgacaagggggtttacgacctcgatgttggatcaggacatcctaatggtgcagccgctattaagggttcgtttgttcaacgattaaagtcctacgtgatctgagttcagaccgg

上述测序结果提交ncbi进行对比，结果与ku761588(赤鼻棱鳀mtdna全序列)和ap017953(杜氏棱鳀mtdna全序列)均为100％。因此，16srrna基因无法对疑似杜氏棱鳀和赤鼻棱鳀鱼卵进行鉴定。

实施例4：杜氏棱鳀和赤鼻棱鳀鉴定引物设计及pcr-rflp鉴定方法建立

鉴于上述两种dna条形码标记未能区分鉴定杜氏棱鳀和赤鼻棱鳀两种相似鱼卵，申请人为了寻找用于鉴定二者的dna差异序列片段，设计引物并扩增了线粒体dna(mtdna)的d-loop区，测序后用dnastar软件进行对比，结果表明在二者相似性90％以上，但是在赤鼻棱鳀的序列中有一段缺失，杜氏棱鳀相对于赤鼻棱鳀的插入长度为39bp。赤鼻棱鳀和杜氏棱鳀的mtdna片段的核苷酸序列分别为seqidno:1和seqidno:2。而这段片段的缺失可用于鉴别杜氏棱鳀和赤鼻棱鳀。

对seqidno:1和seqidno:2的保守区域设计引物，来检测缺失的片段。

其中一种具体的引物序列如下：

上游引物fdpf1：5'-aaagaggagagattcaaact-3'(seqidno:3)、

下游引物fdpr1：5'-attctttcctgtttgtttta-3'(seqidno:4)。上述引物扩增的赤鼻棱鳀产物大小556bp，杜氏棱鳀产物大小595bp。上述引物对常见鱼类如大黄鱼、小黄鱼和带鱼及乌贼的dna扩增中，在上述pcr程序和最优退火温度54.5℃时均无pcr产物。两种棱鳀pcr产物电泳如图3，电泳与预期结果大小一致。

对两个差异pcr产物进行测序，验证结果与两个物种一致，对比结果如图4所示。

为了进一步提高鉴定的准确性，使用dnastar对比赤鼻棱鳀和杜氏棱鳀扩增产物，利用primer5.0寻找差异酶切位点，最后选取内切酶ahaiii和aeui作为进一步鉴定二者的内切酶。ahaiii在杜氏棱鳀595bp的扩增产物中具有两个酶切位点，分别位于57和509位，完全酶切后产生57bp、86bp和452bp三个大小不同的片段；而ahaiii在赤鼻棱鳀只有57位的切点，酶切后产生57bp和499bp两个片段。aeui酶在杜氏棱鳀595bp的pcr产物中没有酶切位点，但是在赤鼻棱鳀556bp中480位有一个酶切位点，使之产生480bp和76bp的产物。选取了ahaiii的同工酶drai(还有如srui)和aeui的同工酶mvai(还有如ssii，snil，msp671，mspr91，bstni)进行酶切，结果与预期完全一致(如图5和6)，证明本发明所设计的rflp方法正确。对成体赤鼻棱鳀和杜氏棱鳀肌肉组织使用动物组织dna提取试剂盒进行dna提取后使用上述方法进行鉴定，结果与此结果一致，因此判定本发明所建立的方法可以用于鉴定两种棱鳀的鱼卵。

实施例5：杜氏棱鳀和赤鼻棱鳀鉴定优化引物设计

为了提高对长期保存鱼卵和深加工鱼类样品的鉴定准确性，防止dna降解造成的判读错误，我们在实施例4的基础上对检测引物进行了优化设计，可以作为鉴定两种棱鳀的备选引物。引物组序列如下：

上游引物：fddf2：5'-taactcgcacatcatcataa-3'(seqidno:5)

下游特异性引物fddtr1：5'-tatcttaaaaccatagtgta-3'(seqidno:6)

上述引物seqidno:5和seqidno:6组合预期产物在赤鼻棱鳀和杜氏棱鳀分别为303bp和342bp。鉴定pcr反应体系20μl，包含(2.0mmmgcl2)10×buffer2μl，上下游引物各1μl(10μm)，dntps1.6μl(25mm)，taqpolymerase0.2μl(5u/μl)，dna模板2μl(约40ng)，超纯水补足至20μl。

pcr程序：95℃预变性5min；35个循环，(95℃变性30s，47℃退火30s，72℃延伸30s)；循环反应结束后72℃延伸10min，然后自动降温4℃保存。pcr产物经电泳鉴定后与预期结果大小一致。这一优化的pcr反应体系在于使用含有kcl的buffer的pcr成功率和扩增效果均优于含有(nh4)2so4的buffer；而退火温度的范围可以置于44-57℃之间，最优温度为47.6℃。

作为鉴定的备选，还可以使用如下的鉴定引物：

上游引物fddf3；atcatcataacactaataca(seqidno:7)

下游引物fddr3：tagattcattataatacacc(seqidno:8)

上述引物seqidno:7和seqidno:8组合预期产物在赤鼻棱鳀和杜氏棱鳀分别为321bp和360bp。相比于上述鉴定和备选两组引物组合，本引物组的优点在于使用多种商业化的buffer均能很好的扩增到预期大小的产物，在较宽泛的退火温度(44-63℃)内可以获得良好的鉴定效果。pcr产物的缩短在一定程度上克服了存放样品dna降解带来的鉴定困难。

序列表

<110>中国计量学院

<120>一种鉴定杜氏棱鳀和赤鼻棱鳀的方法

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>556

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

aaagaggagagattcaaactcccgccgctaacccccaaagctagcattctgaatttaaac60

tactctttgattctccattataacttaaagacacacgtaataaatttatgtttaatacta120

cagtataaatgtaatcaaaataatatagagtacataactatacacgtcaatgtaactcgc180

acatcatcataacactaatacatactatgtattatattacatatattatggtattaatac240

atactatgtattatattacatatattatggtattaatacatactatgtattatattacat300

atattatggtattaatacatactatgtattatattacatatattatggtattaatacata360

ctatgtattatattacatatattatggtattaatacatactatgtattatattacatata420

ttatggtattaatacatactatgtattatattacatacactatggttttaagatatacct480

ggaggtgtattataatgaatctaaattaaataaaattaagaaaccataagttgatataaa540

acaaacaggaaagaat556

<210>2

<211>595

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

aaagaggagagattcaaactcccgccgctaacccccaaagctagcattctgaatttaaac60

tactctttgattctccattataacttaaagacacacgtaataaatttatgtttaatacta120

cagtataaatgtaatcaaaataatatagagtacataactctacacgtcaatgtaactcgc180

acatcatcataacactaatacatactatgtattatattacatatattatgatattaatac240

atactatgtattatattacatatattatgatattaatacatactatgtattatattacat300

atattatgatattaatacatactatgtattatattacatatattatgatattaatacata360

ctatgtattatattacatatattatgatattaatacatactatgtattatattacatata420

ttatgatattaatacatactatgtattatattacatatattatgatattaatacatacta480

tgtattatattacatacactatggttttaaaatatacctgaaggtgtattataatgaatc540

taaattaaataaaattaagaaaccataagttgatataaaacaaacaggaaagaat595

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

aaagaggagagattcaaact20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

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<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

taactcgcacatcatcataa20

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

tatcttaaaaccatagtgta20

<210>7

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

atcatcataacactaataca20

<210>8

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

tagattcattataatacacc20