用于检测髓过氧化物酶活性荧光探针及其制备方法和应用与流程

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一类可用于检测髓过氧化物酶(mpo)活性的荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术：

髓过氧化物酶(myeloperoxidase，mpo)是一类以亚铁血红素作为辅因子的过氧化物酶，几乎专一性地存在于骨髓细胞、两种血液白细胞(中性粒细胞和单核细胞)以及病理状态下的巨噬细胞中。mpo能够催化过氧化氢(h2o2)和氯离子(cl^-)反应产生hocl，目前mpo是已知唯一能在生理条件下催化生成次氯酸(hocl)的酶。除了hocl，mpo也可以催化产生其他活性氧/活性氮(ros/rns)，如酪氨酰自由基和羟基自由基(^·oh)。mpo异常表达产生过量的ros/rns能够直接氧化dna、蛋白质和脂质等生物大分子引起细胞死亡和组织损伤。许多研究表明这与许多疾病的发病机制有关，如类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、阿尔茨海默病、帕金森病和某些癌症，并且已经确定mpo是预测和诊断心脑血管疾病的生物标志物之一。因此，检测生物体内mpo活性对于理解mpo的病理作用并且对疾病的早期诊断和治疗具有十分重要的意义。

目前，用于直接检测mpo活性的方法不是很多，在临床上常用的是酶联免疫吸附法(elisa)，其测试原理基于抗原与抗体之间的特异性结合反应，对mpo进行定量检测。尽管elisa方法高灵敏度，高选择性和重复性好，但是耗时长、成本高等缺点限制了其广泛应用。由于荧光探针具有选择性和灵敏度高、响应时间快以及检测所需的仪器相对简单等优势已经引起了人们越来越多的关注。基于生物体内mpo是唯一可以催化产生hocl的酶，我们开发了一种基于hocl响应的荧光探针，实现了对活体内mpo活性的检测。与商用elisa试剂盒对比，本方法可以大大节省检测时间并且降低成本，有利于mpo相关疾病的早期诊断，因此开发这类荧光探针具有十分重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种新的用于检测髓过氧化物酶的荧光探针及其制备方法和应用。

本发明提供的用于检测髓过氧化物酶的荧光探针，为具有式ι所示结构的化合物：

。

其中：

（1）z为o或s；

（2）r1、r4、r5、r6、r7和r10可以各自独立地选自氢原子、卤素或烷基；

（3）r2、r3、r8和r9可以各自独立地选自氢原子、未取代的烷基、苯基取代的烷基、烷氧基或羟烷氧基；

（4）本发明中所述的烷基是指饱和的烷烃，包括直链或具有支链的甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、异丙基和叔丁基。

本发明提供的荧光探针的制备方法，其反应路线如下：

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具体步骤如下：

（1）中间体b的制备

将化合物a和碱混合后，滴加还原剂，得到中间体b，不需分离，可直接进入下一步反应；

所述的碱选自各种有机碱和无机碱，优选碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸铯。所述的还原剂选自连二亚硫酸钠、维生素c、硫酸亚铁铵，优选连二亚硫酸钠。溶剂优选二氯甲烷和水的混合体系，反应温度20-80℃，优选40℃；

（2）荧光探针i的制备

向含有化合物b的反应体系中加入三光气，制备中间体c，中间体c可以不经纯化，直接用于下步反应；

将碱、4-二甲氨基吡啶(dmap)和氨水或者取代的氨基衍生物溶于溶剂中，滴加化合物c，反应得到化合物i。

本发明中，所述的碱选自各种有机碱和无机碱，优选碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸铯。溶剂优选二氯甲烷，反应温度-10-20℃，优选0℃。

本发明中，具有式ι结构化合物与次氯酸具有如下所示的响应机理：

。

本发明的荧光探针（既具有式ι结构的化合物）本身没有荧光，与次氯酸响应后会先生成中间体b，然后再进一步被次氯酸氧化生成具有强荧光发射的化合物a。

本发明所述荧光探针，可用于检测mpo活性（在溶液以及动物活体层次）。具体步骤如下：

（1）将荧光探针溶解于有机溶剂中，配制成1mm母液，然后稀释到pbs缓冲溶剂(10mm,ph=7.2)中配制成5μm溶液，与次氯酸响应后，用于检测mpo活性；

（2）将荧光探针溶解于有机溶剂中，配制成1mm母液，然后注射100μl到动物的炎症模型中，用于活体层次检测mpo活性。

这里，有机溶剂为甲醇、乙醇或n,n-二甲基甲酰胺等。

本发明的效果表现在：

（1）荧光探针对次氯酸响应非常迅速（＜10s），且检测mpo活性的检测限低（lod=4.2mu/ml）；

（2）荧光探针对次氯酸有优异的选择性，对其它常见的活性氧/活性氮不响应；

（3）荧光探针可应用在活体层次，基于对次氯酸响应检测老鼠关节炎模型中mpo活性。

附图说明

图1为本发明涉及的实施例1所述的荧光探针fd-301的¹hnmr谱图（400mhz,dmso-d6）。

图2为本发明涉及的实施例1所述的荧光探针fd-301的¹³cnmr谱图（100mhz,dmso-d6）。

图3为本发明涉及的实施例1所述的荧光探针fd-301与次氯酸响应前后的荧光谱图。fd-301的浓度为5μm，次氯酸的浓度为15μm激发波长为620nm。

图4为本发明涉及的荧光探针fd-301与次氯酸响应的时间依赖图。

图5为本发明涉及的实施例1所述的荧光探针fd-301的选择性荧光谱图。fd-301的浓度为5μm，ros/rns和次氯酸采用图中所示的不同浓度。比较的ros/rns从a到j分别为：t-buoo^•,ko2,no,^•oh,onoo^-,roo^•,h2o2,t-buooh,hocl。比较的为686nm发射处的荧光强度，激发波长为620nm。

图6为本发明涉及的荧光探针fd-301与不同浓度mpo（0、1、10、50、100和500mu/ml）响应的荧光谱图。fd-301的浓度为5μm，h2o2的浓度为10μm，激发波长为620nm。

图7为本发明涉及的荧光探针fd-301检测mpo活性的标准曲线。fd-301的浓度为5μm，h2o2的浓度为10μμ，标准曲线mpo浓度分别为10、20、30、40和50mu/ml，激发波长为620nm。

图8为本发明涉及的荧光探针fd-301在小鼠关节炎模型中的荧光成像图。

图9为本发明涉及的实施例2所述的荧光探针fd-302的¹hnmr谱图（400mhz,dmso-d6）。

图10为本发明涉及的实施例2所述的荧光探针fd-302与次氯酸响应前后的荧光谱图。fd-302的浓度为5μm，次氯酸的浓度为15μm激发波长为620nm。

图11为本发明涉及的实施例2所述的荧光探针fd-302与不同浓度mpo（0和50mu/ml）响应的荧光谱图。fd-302的浓度为5μm，h2o2的浓度为10μm，激发波长为620nm。

具体实施方式

实施例1

具有式ι结构的化合物fd-301的制备以及检测mpo活性的性能：

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（1）化合物fd-301的制备

在三颈烧瓶中加入亚甲基蓝（2.0g,6.25mmol）用15ml二氯甲烷和40ml水溶解。向体系中加入碳酸钠（2.65g,25.00mmol）将体系置于40℃下搅拌，氮气保护后向体系中滴加用20ml水溶解的连二亚硫酸钠（3.26g,18.75mmol）。加完后反应20min，此时体系发生明显的分层，下层为黄色溶液。将体系静置，然后向体系中滴加10ml二氯甲烷溶解的三光气（0.93g,3.13mmol），滴完后转移至室温下搅拌反应1h。将体系静置，分层后用注射器吸出下层清夜，滴入混有4-氨基苯甲酸酰肼（181.32mg,1.2mmol）、三乙胺（0.5ml,3.6mmol）以及5ml二氯甲烷的混合体系中，滴加过程中保持体系在冰水浴，滴完后转移至室温下搅拌反应，tlc指示反应直到反应完毕。

过滤，除去体系中的不溶物，将滤液倾入冰水中，用乙酸乙酯（100ml×4）萃取。合并有机相，用200ml×3饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。在旋转蒸发器上除溶剂，剩余物用硅胶柱层析纯化，得到100mg淡绿色固体产物fd-301，收率55%（以4-氨基苯甲酸酰肼为参比计算）。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.75(s,1h),7.92(s,1h),7.58(d,j=7.6hz,2h),7.42(d,j=8.8hz,2h),6.72-6.67(m,4h),6.53(d,j=7.2hz,2h),5.69(s,2h),2.89(s,12h)。见图1。

¹³cnmr(100mhz,dmso-d6)δ166.04,155.21,152.07,148.61,132.85,129.03,128.01,126.95,119.1,112.53,111.29,110.31,40.25。见图2。

（2）荧光探针fd-301的性能实验

a、fd-301对次氯酸的响应

如图3所示，5μm的fd-301缓冲溶液（10mmpbs，ph=7.2,1%乙醇）体系是没有荧光的。但在加入15μm次氯酸后混合体系有强烈的荧光响应，在686nm处的荧光强度增加了126倍。

如图4所示，fd-301的浓度为5μm，次氯酸的的浓度为15μm激发波长为620nm。可以观测到激发波长为620nm时，当体系中加入次氯酸在686nm处的荧光强度随着时间的推移迅速增强，并在＜10s内达到平衡，表明该探针能与次氯酸迅速响应。

b、fd-301的选择性

如图5所示，即使体系中的次氯酸浓度只有5μm也能引起fd-301强烈的荧光响应，而其它的ros/rns即使在浓度20μm时均不能引起fd-301荧光强度的变化，例如t-buoo^•,ko2,no,^•oh,onoo^-,roo^•,h2o2,t-buooh，结果表明fd-301具备优良的选择性。

c、fd-301检测mpo活性

如图6所示，当fd-301的浓度为5μm，h2o2的浓度为10μm，荧光探针fd-301与随着mpo浓度增加，当mpo浓度为100mu/ml时达到平衡。激发波长为620nm。

如图7所示，根据mpo标准曲线得到检测限lod(3σ/k)=4.2mu/ml。

d、fd-301在小鼠炎症模型中的应用

如图8所示，使用角叉菜胶在小鼠的右侧脚踝处构建炎症反应模型，两侧同时注射100μl，1mm的fd-301后，荧光成像可以检测到炎症部位相比于正常的脚踝处荧光增强~4倍。表明探针在识别前后发生明显的荧光变化可以在活体中应用。

实施例2

具有式ι结构的化合物fd-302的制备以及与次氯酸响应性能：

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（1）化合物fd-302的制备

在三口烧瓶中加入碱性蓝3（2.0g,5.56mmol）用15ml二氯甲烷和40ml水溶解。向体系中加入碳酸钠（2.65g,25.00mmol）将体系置于40℃下搅拌，氮气保护后向体系中滴加用20ml水溶解的连二亚硫酸钠（3.26g,18.75mmol）。加完后反应20min，此时体系发生明显的分层，下层为黄色溶液。将体系静置，然后向体系中滴加10ml二氯甲烷溶解的三光气（0.93g,3.13mmol），滴完后转移至室温下搅拌反应1h。将体系静置，分层后用注射器吸出下层清夜，滴入混有4-氨基苯甲酸酰肼（162.3mg,1.07mmol）、三乙胺（0.5ml,3.6mmol）以及5ml二氯甲烷的混合体系中，滴加过程中保持体系在冰水浴，滴完后转移至室温下搅拌反应，tlc指示反应直到反应完毕。

过滤，除去体系中的不溶物，将滤液倾入冰水中，用乙酸乙酯（100ml×4）萃取。合并有机相，用200ml×3饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。在旋转蒸发器上除去溶剂，剩余物用硅胶柱层析纯化，得到100mg淡绿色固体产物fd-302，收率60%（以4-氨基苯甲酸酰肼为参比计算）。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.37(dd,j=8.0,9.2hz,4h),6.62(d,j=8.0hz,2h),6.37-6.43(m,4h),6.06(s,2h),3.29-3.33(m,8h),1.07(t,j=6.6hz,12h)。见图9。

（2）荧光探针fd-302的性能实验

a、fd-302对次氯酸的响应

如图10所示，5μm的fd-302缓冲溶液（10mmpbs，ph=7.2,1%乙醇）体系只有非常弱的荧光。但在加入15μm次氯酸后混合体系有明显的荧光增强，在686nm处的荧光强度增加了6倍。

b、fd-302检测mpo活性

如图11所示，当fd-301的浓度为5μm，h2o2的浓度为10μm，荧光探针fd-302与50mu/mlmpo响应后强度与空白对照组相比明显增加。激发波长为620nm。