本发明属于基因工程制药领域，并具体地涉及微生物学、免疫学领域，特别涉及一种多克隆抗体的制备方法。
背景技术：
：：血小板生成素(thrombopoietin,tpo)，又称巨核细胞生长发育因子(megakaryocytegrowthdevelopmentfactor,mgdf)，是kelemen等人于1958年发现的，在人体血液中存在的一种调节血小板生成的激素样物质。人tpo基因位于第3号染色体长臂上(q26-27)，其编码的tpo蛋白由332个氨基酸组成，含有两个功能区域：153个氨基酸组成的n端，以及179个氨基酸组成的c端(林放，2012)。tpo具有促进巨核细胞增殖、分化与成熟，促进血小板生成的作用，是首个被发现的、也是最重要的血小板生成调节因子。1997年，通过噬菌体展示技术，cwirla等人筛选到一种与内源tpo无同源序列的14个氨基酸组成的tpo模拟肽(thrombopoietinmimeticpeptide,tmp)。对于恶性肿瘤放疗和化疗、肝炎、爱滋病、以及骨髓移植等原因引起的血小板减少症，国内目前尚缺乏安全有效的治疗药物。虽然第一代重组促血小板生成素在90年代中期就进入了临床研发，但因其产生中和性抗体未能走出临床。目前，全球范围内仅在我国上市(rhtpo)。促血小板生成素模拟肽(tmp)与人体内源tpo非同源但具有良好的生物活性，美国安进公司将其与免疫球蛋白的fc段融合，该融合蛋白克服了短肽tmp半衰期短的缺点，同时具有tpo活性，也不会产生中和性抗体。该融合蛋白已被美国fda批准上市，用于治疗慢性特发性血小板减少症(itp)。该融合蛋白的缺点是由于fc为非惰性蛋白，它会带来免疫副作用。合理的免疫程序是影响抗体产生的重要因素，现有的tmp抗体的生产成本较高、纯度较低并且特异性和亲和力较低。多克隆抗体(polyclonalantibodies,pcab)是指由多种抗原决定簇刺激产生的混合抗体，具有生产成本低、生产周期短、对抗原亲和力强等优点(沈金儿，2013)。新西兰白兔性情温顺，容易饲养，是一种常用的实验室制备抗体的免疫动物；相对鼠源多克隆抗体，兔源多抗通常具有更高的亲和力和特异性，兔多克隆抗体制备技术也比较成熟。钥孔血蓝蛋白(klh,keyholelimpethemocyanin)是具有高度免疫原性的蛋白大分子，作为载体蛋白用于免疫原的制备，交联于半抗原和其他抗原，可以增强它们的免疫原性。本实验室自2009年开始，就致力于tmp长效融合蛋白的研究。通过人血清白蛋白融合技术，在专利cn201310084212.8中公开了二聚体化促血小板生成素模拟肽tmp二联体一人血清白蛋白融合蛋白的制备及应用。林放，三种血小板生成关键因子共转染人骨髓基质细胞的实验研究[d]，2012，第三军医大学沈金儿，抗gna兔单克隆抗体的制备及其夹心elisa枪测体系的建立[d]，2013，浙江大学技术实现要素：为了获得高效价、高特异性、高亲和力的抗tmp多克隆抗体，本发明采用少量、多次、长周期的免疫方法，并添加佐剂以增强机体产生的免疫应答，以新西兰白兔为免疫动物进行抗体制备。整个免疫过程为期58天，共免疫5次，抗体血清经盐析法纯化后纯度可达85％以上。本发明制备的抗体具有高纯度、高特异性和高亲和力的特点。本发明提供抗tmp兔多克隆抗体血清的制备方法：取促血小板生成素模拟肽tmp与钥孔血蓝蛋白klh偶联，制得klh-tmp作为免疫抗原，加入福氏完全佐剂、乳化后，分批次免疫新西兰白兔，免疫后第58天收集血清，从中分离纯化出抗tmp兔的多克隆抗体，其中促血小板生成素模拟肽tmp的碱基序列如seqidno:1所示，促血小板生成素模拟肽tmp的氨基酸序列如seqidno:2所示。其具体步骤为：(1)取血小板生成素模拟肽tmp与钥孔血蓝蛋白klh偶联，klh-tmp融合蛋白纯度大于95％；(2)取1mg/ml免疫抗原klh-tmp2.5mg，加入2.5ml福氏完全佐剂、乳化。(3)取2只新西兰白兔，编号分别为1#和2#，颈背部8点注射，每点0.1-0.2mg抗原(皮内注射两点0.1ml；肌肉注射0.3ml；皮下注射0.2ml)；(4)在免疫后第15、29、43天，分别用4.5mg免疫抗原klh-tmp蛋白(1mg/ml)与4.5ml福氏不完全佐剂乳化，以同样的方式注射；(5)在第四次免疫10天后，进行耳缘静脉或肌肉加强免疫1ml无佐剂抗原；(6)在免疫后第58天，颈动脉取血，将兔子处死；(7)兔血在4℃放置过夜后，4000g离心收集上清，从中分离纯化出抗tmp兔的多克隆抗体。本发明还提供一种抗体血清的盐析法纯化方法：(1)取离心收集的兔血清加入等体积生理盐水，搅拌下逐滴加入与稀释血清等量的饱和(nh4)2so4，于4℃静置沉淀3h以上后，4000g离心20min，弃去上清；(2)以生理盐水溶解沉淀至xml，再逐滴加入饱和硫酸铵x/2ml，于4℃静置沉淀3h以上后，4000g离心20min，弃去上清；(3)重复第二步，将末次离心后的沉淀物以0.02mpbs(ph7.4)溶解至xml，以pbs充分透析，至萘氏试剂测透析外液无黄色。(4)将透析袋内样品稀释后，以紫外分光光度计测蛋白含量。本发明还提供抗体血清sds-page凝胶电泳分析多克隆抗体纯度的分析方法：(1)配置12％的分离胶和5％的浓缩胶；(2)取0.1μl和1μl纯化抗体，分别用去离子水稀释至20μl后加入5μl5×上样缓冲液，于100℃金属浴变性10min；(3)130v，电泳90min(夏季70min)；(4)考马斯亮蓝r250染色液染色4-6h；(5)脱色液脱色2-3h后，进行凝胶成像。本发明还提供多克隆抗体的westernblot鉴定方法：(1)pvdf膜活化：裁剪适合大小的pvdf膜，在甲醇中浸泡5min后使用去离子水洗涤两次，每次3min，洗涤后再将膜置于转膜缓冲液浸泡10min。同时裁剪与膜大小相同的滤纸8张，置于转膜缓冲液浸泡备用；(2)分别取阴性血清(阴性对照)、前期细胞和酵母表达、纯化的dtmp-hsa融合蛋白(阳性对照)进行还原性sds-page凝胶电泳，电泳结束后，从玻璃板中剥离凝胶，切下适合大小的含有目标条带的凝胶；(3)将pvdf膜、凝胶和滤纸按以下顺序叠放：(-)阴极-4张滤纸-凝胶-pvdf膜-4张滤纸-阳极(+)，并根据膜的大小，选择恒压或恒流方式进行转膜；(4)转膜结束后，取出pvdf膜，凝胶接触面向上置于洁净容器中，用洗涤缓冲液洗涤3次，每次5min；(5)将pvdf膜转入封闭液，室温震荡孵育2h；(6)封闭后使用洗涤缓冲液洗涤4次，每次5min。洗涤后，将pvdf膜转入一抗稀释液(使用洗涤缓冲液以1:2000比例稀释纯化后的抗tmp兔多克隆抗体)，室温震荡孵育2h后静置于4℃过夜；(7)使用洗涤缓冲液洗涤4次，每次5min。洗涤后，将pvdf膜转入二抗稀释液(使用洗涤缓冲液以1:5000比例稀释hrp酶标羊抗兔igg)，室温震荡孵育1h；(8)使用洗涤缓冲液洗涤3次，每次10min。洗涤后，将pvdf膜转入dab显色液，于避光环境下逐滴加入30％h2o2，观察显色条带。本发明还提供兔多克隆抗体效价的测定方法：(1)包被：用cbs包被缓冲液将纯化的dtmp-hsa融合蛋白稀释为0.5μg/ml并加入酶标板中，100μl/孔，4℃静置过夜；(2)封闭：pbst洗板三次后，加入封闭液，340μl/孔，于37℃封闭2h；(3)一抗反应：pbst洗板三次后，加入以pbst稀释的不同浓度抗tmp兔多克隆抗体，100μl/孔，每个浓度做3个复孔，并设置对照，于37℃封闭2h；(4)二抗反应：pbst洗板三次后，加入使用pbst以1:5000比例稀释的hrp酶标羊抗兔igg，100μl/孔，于37℃封闭1h；(5)显色：pbst洗板四次后，在避光条件下，依次滴加显色液a和显色液b，每孔50μl，避光显色20min；(6)读数：加入终止液终止反应，50μl/孔，于酶标仪450nm波长处读取od4值并处理数据。说明书附图图1抗tmp兔多克隆抗体的还原sds-page凝胶电泳图2抗tmp多克隆抗体的westernblot鉴定具体实施例实施例1tmp兔多克隆抗体血清的制备方法取促血小板生成素模拟肽tmp与钥孔血蓝蛋白klh偶联，制得klh-tmp作为免疫抗原，加入福氏完全佐剂、乳化后，分批次免疫新西兰白兔，免疫后第58天收集血清，从中分离纯化出抗tmp兔的多克隆抗体，其中促血小板生成素模拟肽tmp的碱基序列如seqidno:1所示，促血小板生成素模拟肽tmp的氨基酸序列如seqidno:2所示。其具体步骤为：(1)取血小板生成素模拟肽tmp与钥孔血蓝蛋白klh偶联，klh-tmp融合蛋白纯度大于95％；(2)取1mg/ml免疫抗原klh-tmp2.5mg，加入2.5ml福氏完全佐剂、乳化。(3)取2只新西兰白兔，编号分别为1#和2#，颈背部8点注射，每点0.1-0.2mg抗原(皮内注射两点0.1ml；肌肉注射0.3ml；皮下注射0.2ml)；(4)在免疫后第15、29、43天，分别用4.5mg免疫抗原klh-tmp蛋白(1mg/ml)与4.5ml福氏不完全佐剂乳化，以同样的方式注射；(5)在第四次免疫10天后，进行耳缘静脉或肌肉加强免疫1ml无佐剂抗原；(6)在免疫后第58天，颈动脉取血，将兔子处死；(7)兔血在4℃放置过夜后，4000g离心收集上清，从中分离纯化出抗tmp兔的多克隆抗体。实施例2抗体血清的纯化方法①抗体纯化相关试剂饱和硫酸铵溶液的配制：以500ml50～80℃的去离子水溶解400g(nh4)2so4，完全溶解后搅拌20分钟，以滤纸过滤。冷却后以15nnh4oh调ph至7.4。萘氏试剂配制：称取11.5克hgi2，8克ki，以去离子水定容至50ml，搅拌溶解充分后，再加入50m20％naoh溶液。②盐析法纯化方法(1)取离心收集的兔血清加入等体积生理盐水，搅拌下逐滴加入与稀释血清等量的饱和(nh4)2so4，于4℃静置沉淀3h以上后，4000g离心20min，弃去上清；(2)以生理盐水溶解沉淀至xml，再逐滴加入饱和硫酸铵x/2ml，于4℃静置沉淀3h以上后，4000g离心20min，弃去上清；(3)重复第二步，将末次离心后的沉淀物以0.02mpbs(ph7.4)溶解至xml，以pbs充分透析，至萘氏试剂测透析外液无黄色。(4)将透析袋内样品稀释后，以紫外分光光度计测蛋白含量。实施例3抗体血清sds-page凝胶电泳分析多克隆抗体纯度的分析方法①sds-page相关试剂1.0mtris(ph6.8)：溶解12.114gtris于80ml去离子水中，用浓盐酸调ph至6.8，定容至100ml；1.5mtris(ph8.8)：溶解18.171gtris于80ml去离子水中，用浓盐酸调ph至8.8，定容至100ml；10％sds：溶解10gsds于100ml去离子水中,常温保存10％过硫酸铵(aps)：溶解1g过硫酸铵于10ml去离子水中，4℃保存②抗体血清sds-page凝胶电泳分析方法(1)配置12％的分离胶和5％的浓缩胶；(2)取0.1μl和1μl纯化抗体，分别用去离子水稀释至20μl后加入5μl5×上样缓冲液，于100℃金属浴变性10min；(3)130v，电泳90min(夏季70min)；(4)考马斯亮蓝r250染色液染色4-6h；(5)脱色液脱色2-3h后，进行凝胶成像。在获取两只兔子的全血血清后，我们使用盐析法对抗tmp多克隆抗体进行纯化，并通过sds-page凝胶电泳对获得的抗体进行纯度分析，结果如图1所示：两只兔子体内都产生了抗tmp的抗体，55kda处为抗体重链条带，25kda下方为抗体轻链条带；盐析纯化去除了抗体血清中绝大多数杂蛋白，经sds-page凝胶电泳分析，纯化后的2#抗tmp兔多克隆抗体纯度>85％，3#抗tmp兔多克隆抗体纯度>80％。实施例4多克隆抗体westernblot鉴定①westernblotting相关试剂显色buffer(ph7.4)：溶解0.605gtris于90ml去离子水，用hcl调ph至7.4后，使用去离子水定容至100ml。(1)洗涤缓冲液(ph7.5)tris2.42gnacl5.8gtween-201ml使用800ml去离子水充分溶解后，hcl调ph至7.5，再用去离子水定容至1l。(2)转膜缓冲液tris3.03ggly14.4g使用去离子水定容至800ml，临用前加入200ml甲醇。(3)封闭液(5％脱脂奶粉)脱脂奶粉1g洗涤缓冲液20ml(4)dab显色液(4℃避光保存)：dab6mg显色buffer10ml临用前在避光条件下加入2-5滴30％h2o2。(5)dtmp-hsa融合蛋白通过专利cn201310084212.8中公开的二聚体化促血小板生成素模拟肽tmp二联体一人血清白蛋白融合蛋白的制备方法制得。②多克隆抗体westernblot鉴定方法(1)pvdf膜活化：裁剪适合大小的pvdf膜，在甲醇中浸泡5min后使用去离子水洗涤两次，每次3min，洗涤后再将膜置于转膜缓冲液浸泡10min。同时裁剪与膜大小相同的滤纸8张，置于转膜缓冲液浸泡备用；(2)分别取阴性血清(阴性对照)、dtmp-hsa融合蛋白(阳性对照)进行还原性sds-page凝胶电泳，电泳结束后，从玻璃板中剥离凝胶，切下适合大小的含有目标条带的凝胶；(3)将pvdf膜、凝胶和滤纸按以下顺序叠放：(-)阴极-4张滤纸-凝胶-pvdf膜-4张滤纸-阳极(+)，并根据膜的大小，选择恒压或恒流方式进行转膜；(4)转膜结束后，取出pvdf膜，凝胶接触面向上置于洁净容器中，用洗涤缓冲液洗涤3次，每次5min；(5)将pvdf膜转入封闭液，室温震荡孵育2h；(6)封闭后使用洗涤缓冲液洗涤4次，每次5min。洗涤后，将pvdf膜转入一抗稀释液(使用洗涤缓冲液以1:2000比例稀释纯化后的抗tmp兔多克隆抗体)，室温震荡孵育2h后静置于4℃过夜；(7)使用洗涤缓冲液洗涤4次，每次5min。洗涤后，将pvdf膜转入二抗稀释液(使用洗涤缓冲液以1:5000比例稀释hrp酶标羊抗兔igg)，室温震荡孵育1h；(8)使用洗涤缓冲液洗涤3次，每次10min。洗涤后，将pvdf膜转入dab显色液，于避光环境下逐滴加入30％h2o2，观察显色条带。纯化抗体的westernblot鉴定结果如图2所示：细胞和酵母的表达产物在预期大小处，均可见明显特异性条带，阴性对照未发现特异性条带，证明dtmp-hsa融合蛋白能够与抗tmp兔多克隆抗体发生免疫反应，本发明的抗tmp兔多克隆抗体具有高的免疫源性。实施例5兔多克隆抗体效价的测定(1)包被：用cbs包被缓冲液将纯化的dtmp-hsa融合蛋白稀释为0.5μg/ml并加入酶标板中，100μl/孔，4℃静置过夜；(2)封闭：pbst洗板三次后，加入封闭液，340μl/孔，于37℃封闭2h；(3)一抗反应：pbst洗板三次后，加入以pbst稀释的不同浓度抗tmp兔多克隆抗体(表2-1)，100μl/孔，每个浓度做3个复孔，并设置对照，于37℃封闭2h；(4)二抗反应：pbst洗板三次后，加入使用pbst以1:5000比例稀释的hrp酶标羊抗兔igg，100μl/孔，于37℃封闭1h；(5)显色：pbst洗板四次后，在避光条件下，依次滴加显色液a和显色液b，每孔50μl，避光显色20min；(6)读数：加入终止液终止反应，50μl/孔，于酶标仪450nm波长处读取od4值并处理数据。表1兔klh-tmp多抗效价测定table2-1determinethetiterofanti-klh-tmp间接elisa检测抗tmp兔多克隆抗体效价的结果如表2：当抗体稀释倍数在8000～32000之间时，od450检测值在1.0左右，说明本方法生产的抗tmp兔多克隆抗体具有高效价。表2anti-tmp多克隆抗体效价合理的免疫程序是影响抗体产生的重要因素，为了获得高效价、高特异性和高亲和力的抗tmp多克隆抗体，我们采用少量、多次、长周期的免疫方法，并添加佐剂以增强机体产生的免疫应答，以新西兰白兔为免疫动物进行抗体制备。整个免疫过程为期58天，共免疫5次，抗体血清经盐析法纯化后纯度可达85％以上，间接法elisa测得抗体效价为8000-32000，说明本发明的制备方法生产的抗tmp多克隆抗体具有高效价、高特异性和高亲和力。序列表<110>兰州大学<120>一种抗兔tmp多克隆抗体的制备方法<141>2018-11-12<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>3<211>14<212>prt<213>促血小板生成素模拟肽(tmp)<400>3ileglyglyprothrleualaglythrleualaalaalaala1510<210>4<211>42<212>dna<213>促血小板生成素模拟肽(tmp)<400>4atcgagggacccaccctgaggcagtggctggccgccagagcc42当前第1页12当前第1页12