一种小麦胚乳特异表达的启动子及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域中，一种小麦胚乳特异表达的启动子及其应用。

背景技术：

启动子通过自身顺式作用元件与反式作用因子的互作来调控下游基因的时空表达。根据作用方式及功能的不同，可将启动子分为组成型、组织特异型和诱导型三类。目前，植物基因工程中常用的启动子多为组成型表达启动子，如大多数双子叶转基因植物中使用的花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子，单子叶转基因植物主要使用来自玉米的zmubi1启动子和来自水稻的oscc1、osact1启动子。组成型启动子驱动下的外源基因在植物不同组织部位和全部发育阶段无明显差异，这种持续、高效的表达大量消耗植株的基础物质而造成能量负荷和物质浪费，从而打破代谢平衡，阻碍植株的正常生长并降低产量，甚至导致死亡。为了精准控制外源基因在农作物体内的表达组织，使其发挥积极作用以获得具有理想性状的农作物，需要加大力度开发组织特异性表达启动子。

组织特异性启动子调控下的基因一般只在某些特定的器官或组织中转录。目前，从植物中已经分离得到了不同类型的组织特异性启动子，如拟南芥根特异表达启动子pyk10，百合雄配子特异表达启动子lgc1，番茄果实特异性表达启动子2a11。特异性启动子的应用可以实现外源基因在植物中的组织特异性表达。小麦胚乳特异性启动子属于组织型，在不影响种子发育和萌发的前提下，可以通过其驱动外源基因在胚乳中表达来提高贮藏蛋白的表达量，降低过敏源的表达水平，以及改变支链/直链淀粉比例，最终实现特用小麦培育的目标。因此，利用胚乳特异性启动子控制外源基因在胚乳中特异表达具有重要的实践意义。

小麦(triticumaestivium)属于禾谷类作物，是中国三大粮食作物之一。然而，由于小麦存在基因组庞大、生活周期长和遗传转化困难等问题导致其鉴定到的组织特异启动子数量少，远远不能满足科研和生产需求。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种具有启动子活性的dna分子。

本发明提供的dna分子，为下述a)或b)或c)：

a)3′端至少含有序列表中序列1的第1107-1724位核苷酸序列，并且从序列1的第1107位开始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5′端延长，得到长度为618至1724bp的任意一个dna片段；所述dna分子具有启动子功能；

b)与a)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的dna片段；

c)在严格条件下与a)或b)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的dna片段。

所述严格条件是在2×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次。每次5min0.5×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次。每次15min。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的dna分子核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的dna分子核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要保持了表达靶基因的启动子活性，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的dna分子核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％、95％以上的同一性。

所述dna分子3′端的最后一位核苷酸可为序列1的第1724位。

所述dna分子可为下述1)或2)：

1)序列表中序列1的第1107-1724位所示的dna分子；

2)序列表中序列1所示的dna分子。

本发明还提供了含有所述dna分子的生物材料，为下述b1)至b19)中的任一种：

b1)含有所述dna分子的表达盒；

b2)含有所述dna分子的重组载体；

b3)含有b1)所述表达盒的重组载体；

b4)含有所述dna分子的重组微生物；

b5)含有b1)所述表达盒的重组微生物；

b6)含有b2)所述重组载体的重组微生物；

b7)含有b3)所述重组载体的重组微生物；

b8)含有所述dna分子的转基因植物细胞系；

b9)含有b1)所述表达盒的转基因植物细胞系；

b10)含有b2)所述重组载体的转基因植物细胞系；

b11)含有b3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

b12)含有所述dna分子的转基因植物组织；

b13)含有b1)所述表达盒的转基因植物组织；

b14)含有b2)所述重组载体的转基因植物组织；

b15)含有b3)所述重组载体的转基因植物组织；

b16)含有所述dna分子的转基因植物器官；

b17)含有b1)所述表达盒的转基因植物器官；

b18)含有b2)所述重组载体的转基因植物器官；

b19)含有b3)所述重组载体的转基因植物器官。

上述生物材料中，所述表达盒可由所述dna分子、所述dna分子启动表达的目的基因，以及转录终止序列组成；所述dna分子以功能性方式与所述目的基因连接，且所述目的基因与所述转录终止序列连接。在本发明的一个实施例中，所述目的基因具体为gus基因。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为载体pwmb110。

所述重组载体中，由所述dna分子启动目的基因的表达。在本发明的一个实施例中，所述重组载体具体通过将双元表达载体pwmb110中的ubiquitin启动子替换为所述dna分子，并将gus报告基因插入所述dna分子下游得到。所述目的基因具体为gus基因。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为农杆菌或大肠杆菌。

上述表达盒或重组载体可以通过原核显微注射法、胚胎干细胞介导法、逆转录病毒载体法、精子介导的基因转移、核移植转基因法、体细胞核移植法、线粒体介导法等常规生物学方法转化动物器官或组织或细胞，得到转基因植物物细胞或组织或器官。

上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、所述转基因植物组织和所述转基因植物器官均不包括繁殖材料。

本发明还提供了所述dna分子在作为启动子中的应用。

上述应用中，所述启动子可为植物组织特异性启动子

上述应用中，所述组织可为植物胚乳。

本发明还提供了所述dna分子或所述生物材料在以下(a)至(c)中任一项中的应用：

(a)培育植物品种或品系；

(b)在植物中驱动目的基因的表达；

(c)驱动目的基因在植物胚乳中表达。

上述应用中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可为禾本科植物。所述禾本科植物可为小麦。

本发明还提供了目的基因在植物胚乳中特异性表达的方法，所述方法包括：将含有所述dna分子和目的基因的表达盒导入植物中，实现目的基因在植物胚乳中的特异表达。

上述方法中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可为禾本科植物。所述禾本科植物可为小麦、大麦、水稻、玉米或高梁。

扩增所述dna分子全长或部分片段的引物对，也属于本发明的保护范围。

所述引物对可由序列表中序列2的第10-36位和序列3的第10-32位所示的两条单链dna组成，也可由序列表中序列2和序列3所示的两条单链dna组成；还可由序列表中序列5的第10-33位和序列3的第10-32位所示的两条单链dna组成；还可由序列表中序列5和序列3所示的两条单链dna组成。

实验证明，本发明的dna分子具有启动子功能，且能在胚乳中特异驱动目的基因的表达，可以避免该目的基因在植物其它组织中持续表达所带来的不利影响，实现了外源基因在植物营养器官中表达的精准控制；该dna分子启动的报告基因gus还可直接应用于转基因植株筛选，具有直观、灵敏度高的优点。该dna分子用于将目的基因在植物籽粒中进行特异性的高效表达，这对植物的籽粒品质改良和产量提高具有实践意义。

附图说明

图1为重组菌pcr验证结果。其中，泳道m为dna分子量标准，泳道1、2和3分别为lba4404-pwmb–ptaem2-gus、lba4404-pwmb–ptaem1-gus和lba4404-pwmb–ptaem3-gus的检测结果。

图2为转基因植株pcr产物检测电泳结果。其中，泳道m为dna分子量标准，泳道1～7为阳性植株；a、b和c分别为lba4404-pwmb–ptaem2-gus、lba4404-pwmb–ptaem1-gus和lba4404-pwmb–ptaem3-gus得到的阳性转基因植株的检测结果。

图3为转基因植株不同组织器官的gus组织化学染色结果。其中，a、b和c分别为lba4404-pwmb–ptaem2-gus、lba4404-pwmb–ptaem1-gus和lba4404-pwmb–ptaem3-gus得到的阳性转基因植株的结果；1为幼根，2为幼茎，3为外稃，4为内稃，5为旗叶，6为小花，7为成熟期种子纵切面(白箭头所示为胚)。

图4为转基因植株胚乳不同发育时期的gus组织化学染色结果。其中，a为ptaem2驱动的gus的阳性转基因植株(即lba4404-pwmb–ptaem2-gus得到的阳性转基因植株)，b为ptaem1驱动的gus的阳性转基因植株(即lba4404-pwmb–ptaem1-gus得到的阳性转基因植株)，c为ptaem3驱动的gus的阳性转基因植株(即lba4404-pwmb–ptaem3-gus得到的阳性转基因植株)；(1)为开花后8～23天种子的横切图，(2)为开花后8～23天种子的纵切图。

图5为转基因植株胚乳特异表达的gus组织化学染色结果。其中：a为ptaem2驱动的gus的阳性转基因植株结果；b为ptaem1驱动的gus的阳性转基因植株结果；c为ptaem3驱动的gus的阳性转基因植株结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应dna的5′末端核苷酸，末位均为相应dna的3′末端核苷酸。

下述实施例中的小麦l03-227(zhujt,haopc,chengx,hancx,lixh,zellerfj,hsamslk,huyk,yuemingyan(2014)molecularcloning,phylogeneticanalysis,andexpressionprofilingofendoplasmicreticulummolecularchaperonebipgenesfrombreadwheat(triticumaestivuml.).bmcplantbiology,14:260)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的pwmb110载体(cuixy,duyt,fujd,yutf,wangct,chenm,chenj,mayz,xuzs(2018)wheatcbl-interactingproteinkinase23positivelyregulatesdroughtstressandabaresponses.bmcplantbiology.18:93)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的载体pwmb002(张立，王建峰，王晓杰，康振生，韩德俊(2012)alfafp和spcema融合基因表达载体的构建及其对小麦的遗传转化.中国农业大学学报,17(5)：15-20)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的农杆菌菌株lba4404和辅菌菌株hb101(大肠杆菌)均记载在文献(白雪梅，陶柏秋，张岩(2013)紫花苜蓿抗旱相关促分裂原活化蛋白激酶植物表达载体的构建.内蒙古石油化工，1:30-32)中，公众可从申请人处获得这些生物材料，这些生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、ptaem1启动子具有胚乳表达特异性

本实施例提供了一个来源于小麦l03-227的具有启动子功能的dna片段，将其命名为ptaem1启动子，其序列为序列表中序列1的第1107-1724位。

一、重组载体与重组菌的构建

1、pwmb–ptaem1的构建

以小麦l03-227基因组dna为模板，利用引物1和引物2组成的引物对进行pcr扩增，得到扩增产物；引物序列如下：

引物1(上游引物)：5’-aaaaagcttcgcgtcatagcatagatagatgttgtg-3’(序列2，下划线为hindiii的识别序列)；

引物2(下游引物)：5’-aaaggatccctcggtggactgtcggtgaattg-3’(序列3，下划线为bamhi的识别序列)。

将扩增产物利用hindiii与bamhi酶切，得到酶切产物；将酶切产物与pwmb110载体经hindiii与bamhi酶切得到的骨架载体相连，得到重组载体，将得到的序列正确的重组载体命名为pwmb–ptaem1，pwmb–ptaem1含有序列表中序列1的第1107-1724位所示的ptaem1启动子。

将ptaem1启动子缩短，得到其截短dna片段，将该dna片段记为ptaem2，ptaem2的序列为序列表中序列1的第1428-1724位；将ptaem1启动子的5’端向其上游延长，得到dna片段，将该dna片段记为ptaem3，ptaem3的序列为序列表中序列1。构建分别含有ptaem2和ptaem3的重组载体，验证这两个dna片段是否具有启动子功能。重组载体的构建如下：

以小麦l03-227基因组dna为模板，利用引物3和引物2组成的引物对进行pcr扩增，得到扩增产物；引物3(上游引物)：5’-aaaaagcttgaactaggattaagccgattacgtg-3’(序列4，下划线为hindiii的识别序列)。

将扩增产物利用hindiii与bamhi酶切，得到酶切产物；将酶切产物与pwmb110载体经hindiii与bamhi酶切得到的骨架载体相连，得到重组载体，将得到的序列正确的重组载体命名为pwmb–ptaem2，pwmb–ptaem2含有序列表中序列1的第1428-1724位所示的ptaem2。

以小麦l03-227基因组dna为模板，利用引物4和引物2组成的引物对进行pcr扩增，得到扩增产物；引物4(上游引物)：5’-aaaaagcttaccccaacaacaccaacaaagcag-3’(序列5，下划线为hindiii的识别序列)。

将扩增产物利用hindiii与bamhi酶切，得到酶切产物；将酶切产物与pwmb110载体经hindiii与bamhi酶切得到的骨架载体相连，得到重组载体，将得到的序列正确的重组载体命名为pwmb–ptaem3，pwmb–ptaem3含有序列表中序列1所示的ptaem3。

2、pwmb–ptaem1-gus的构建

以载体pwmb002为模板，利用引物5和引物6组成的引物对进行pcr扩增，得到扩增产物；引物序列如下：

引物5(上游引物)：5’-aaaggatccatgttacgtcctgtagaaaccccaac-3’(序列6，下划线为bamhi的识别序列)；

引物6(下游引物)：5’-aaagagctctcattgtttgcctccctgctg-3’(序列7，下划线为saci的识别序列)。

将扩增产物利用bamhi和saci酶切，得到gus基因片段；将步骤1得到的pwmb–ptaem1利用bamhi和saci酶切，回收骨架载体；连接gus基因片段与骨架载体，得到重组载体，将序列正确的重组载体命名为pwmb–ptaem1-gus。pwmb–ptaem1-gus含有序列表中序列1的第1107-1724位所示的ptaem1启动子和序列8所示的gus基因，ptaem1启动子位于gus基因上游。

将扩增产物利用bamhi和saci酶切，得到gus基因片段；将步骤1得到的pwmb–ptaem2利用bamhi和saci酶切，回收骨架载体；连接gus基因片段与骨架载体，得到重组载体，将序列正确的重组载体命名为pwmb–ptaem2-gus。pwmb–ptaem2-gus含有序列表中序列1的第1428-1724位所示的ptaem2和序列8所示的gus基因，ptaem2位于gus基因上游。

将扩增产物利用bamhi和saci酶切，得到gus基因片段；将步骤1得到的pwmb–ptaem3利用bamhi和saci酶切，回收骨架载体；连接gus基因片段与骨架载体，得到重组载体，将序列正确的重组载体命名为pwmb–ptaem3-gus。pwmb–ptaem3-gus含有序列表中序列1所示的ptaem3和序列8所示的gus基因，ptaem3位于gus基因上游。

3、重组菌的构建

将pwmb–ptaem1-gus导入大肠杆菌trans5α中，得到重组菌trans5α-pwmb–ptaem1-gus。

将农杆菌菌株lba4404于28℃培养36～40h，将辅菌菌株hb101于37℃培养12～16h，将trans5α-pwmb–ptaem1-gus于37℃培养12～16h；将三种培养结束的菌各取100μl菌液加入1.5ml的离心管中，混匀，4000rpm，离心3min收集菌体，同时以只有农杆菌菌株lba4404和辅菌菌株hb101的混合菌液为对照；向菌体中加入50μl不含抗生素的lb液体培养基，重悬菌体，得到菌体悬液；将菌体悬液滴到不含抗生素的lb固体培养基上，使菌体成团，待平板干后，28℃倒置培养16～24h；挑取少量菌体，在含利福平、庆大霉素和卡那霉素的lb固体培养基上划线，28℃培养36～40h，利用引物7和引物8组成的引物对鉴定阳性克隆。引物序列如下：

引物7(上游引物)：5’-agccgattacgtggctttagcag-3’(序列9)，

引物8(下游引物)：5’-gcatcggcgaactgatcgttaaaac-3’(序列10)。

能扩增得到目的条带的克隆为阳性克隆(泳道2，图1)，对照无目的条带，将含有正确目的条带(测序显示目的条带的序列为序列11)的重组菌命名为lba4404-pwmb–ptaem1-gus。

按照上述方法，将pwmb–ptaem1-gus分别替换为pwmb–ptaem2-gus和pwmb–ptaem3-gus，将得到的阳性克隆分别记为lba4404-pwmb–ptaem2-gus(泳道1，图1)和lba4404-pwmb–ptaem3-gus(泳道3，图1)。

二、转基因小麦的构建与鉴定

通过农杆菌介导法利用步骤一的lba4404-pwmb–ptaem1-gus将pwmb–ptaem1-gus转化小麦fielder(ishiday,tsunashimam,hieiy,komarit.(2015)wheat(triticumaestivuml.)transformationusingimmatureembryos.in:wangk(eds)agrobacteriumprotocols.methodsinmolecularbiology,vol1223.springer,newyork,ny)中，得到转基因小麦。小麦转化利用purewheat小麦转化方法实现(ishiday,tsunashimam,hieiy,komarit.(2015)wheat(triticumaestivuml.)transformationusingimmatureembryos.in:wangk(eds)agrobacteriumprotocols.methodsinmolecularbiology,vol1223.springer,newyork,ny)。

按照上述方法，将lba4404-pwmb–ptaem1-gus分别替换为lba4404-pwmb–ptaem2-gus和lba4404-pwmb–ptaem3-gus进行转基因实验，得到两种转基因小麦。

转基因小麦的鉴定：

以提取的转基因小麦叶片dna为模板，用引物7和引物8进行pcr扩增，能扩增到目的片段的植株即为阳性转基因植株。图2为3种转基因小麦各7棵阳性转基因植株的pcr检测结果。

三、gus基因表达检测

取步骤二检测的阳性转基因植株的不同时期与不同组织进行gus组织化学染色。具体操作步骤如下：

步骤1：将组织材料放入试管中，加入适量的gus固定液，室温下温和摇动30min，用50nmol/l的磷酸钠缓冲液(ph7.0)洗10～15min，重复3次，除去组织中残留的固定液；

步骤2：对染色液进行1min抽真空处理，将各组织置于gus染色液中6h；再将染色组织先置于75％乙醇漂洗脱色，再用50％和20％乙醇依次侵泡20min；解剖镜下拍照，组织上显示蓝色即为gus表达部位。

转基因植株不同组织gus基因的组织化学染色结果如图3所示，其中：1为幼根，2为幼茎，3为外稃，4为内稃，5为旗叶，6为小花，7为成熟期种子纵切面(白箭头所示为胚)。结果显示：ptaem1启动子与ptaem3均能驱动gus基因在胚乳中表达，在其它组织中(幼根、幼茎、外稃、内稃、小花、旗叶、胚)中均不能驱动gus基因的表达，而任何组织中ptaem2均不能驱动gus基因的表达。

转基因植株胚乳不同发育时期的gus组织化学染色如图4所示，其中：(1)为开花后8～23天种子的横切图，(2)为开花后8～23天种子的纵切图。结果显示：与ptaem3在开花后8～23天一直能驱动gus基因的表达，ptaem1启动子能驱动gus基因在开花后14天的胚乳中表达，直到种子成熟；而ptaem2一直不能gus基因表达。

转基因植株胚乳特异表达的gus组织化学染色如图5所示，其中：a为ptaem2驱动的gus的阳性转基因植株；b为ptaem1驱动的gus的阳性转基因植株；c为ptaem3驱动的gus的阳性转基因植株。结果显示：ptaem2驱动的gus的阳性转基因植株中gus基因在内胚乳(星号所示)和糊粉层(箭头所示)中都不表达；ptaem1启动子和ptaem3均能驱动gus基因在内胚乳(星号所示)和糊粉层(箭头所示)中表达，证实ptaem1启动子和ptaem3可以特异在小麦的胚乳细胞中驱动目的基因表达。

<110>首都师范大学

<120>一种小麦胚乳特异表达的启动子及其应用

<160>11

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1724

<212>dna

<213>小麦（triticumaestivuml.）

<400>1

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cctccactaacacatttctctcgacatgcaagcatgtcacataagaaaatgcccacctca120

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<210>2

<211>36

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

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<210>3

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

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<212>dna

<213>人工序列

<400>4

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<213>人工序列

<400>5

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<210>6

<211>35

<212>dna

<213>人工序列

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<213>人工序列

<400>7

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<211>1812

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

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