一种长链非编码RNAlncRNA-6585及其抗体与应用的制作方法

本发明属于肿瘤分子生物学和抗体制备技术领域，具体涉及一种长链非编码rnalncrna-6585及其抗体与应用。

背景技术：

近年来，非编码rna在肿瘤细胞增殖、分化、转移和凋亡等生物学过程中发挥的调节作用是研究者们关心的焦点问题。长链非编码rna（longnoncodingrna，lncrna）是一类转录本长度大于200nt（nucleotide），最初被认为是不翻译成蛋白质的功能性rna分子（science，2005，309(5740)：1559-1563．）。近年来研究表明，lncrna与许多癌症的发生和发展密切相关，如膀胱癌、乳腺癌、肝癌和前列腺癌等（urology，2010，77(2)：510.e1-510.e5．．nature，2010，464(7291)：1071-1076.），也相继鉴定出一些具有编码多肽能力的lncrna（cell.2015feb12;160(4):595-606；molcell.2017oct5;68(1):171-184.e6；nature.2017jan12;541(7636):228-232.）。因此，本发明通过生物信息学在线软件分析，寻找具有编码多肽能力的lncrna并针对其编码的多肽制备抗体，以期为临床肿瘤疾病的诊断、预后判断发掘新的生物标志物，为治疗提供突破点。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种长链非编码rnalncrna-6585及其抗体与应用。本发明的长链非编码rnalncrna-6585与人类肿瘤发生密切相关的长链非编码rna。

一种长链非编码rnalncrna-6585（ensembl数据库登录号enst00000426585，seqidno：1），其核酸序列如seqidno：1所示，编码多肽的核苷酸序列如seqidno：2，且命名为lncrna-6585p。

作为改进的是，所述多肽的氨基酸序列如seqidno：3。

含有权利要求1所述的编码多肽的核苷酸序列lncrna-6585p的重组病毒pcdh-lncrna-6585p的质粒。

一种lncrna-6585p过表达质粒的构建方法，包括如下步骤：步骤1，合成获得seqidno：2序列的目的基因，收尾各添加一个flag标签；步骤2，用限制性内切酶xboi和bamhi对目的基因和pcdh-cmv-mcs-ef1-coprfp载体进行酶切、纯化、连接，转化至大肠杆菌，即得过表达质粒pcdh-lncrna-6585p。

基于所述的lncrna-6585p过表达质粒编码的多肽通过免疫反应产生的抗体。

上述抗体在制备预防或治疗治疗宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌、胶质瘤、肺癌、胰腺癌或胃癌的产品中的应用。

上述的lncrna-6585p在制备预防或治疗宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌、胶质瘤、肺癌、胰腺癌或胃癌的产品中的应用。

有益效果：

本发明提供的长链非编码rnalncrna-6585能够编码表达多肽，且参与调控肿瘤细胞迁移侵袭过程，因此，lncrna-6585及其编码的多肽在肿瘤发病过程中发挥重要作用，可以作为诊疗临床肿瘤疾病的新的分子标记和药物靶点。

附图说明

图1为lncrna芯片结果火山示意图，显示3对宫颈癌及癌旁组织中差异表达达2倍以上的lncrna的分布；

图2为westernblot验证lncrna-6585p编码多肽；（a）内皮细胞系；（b）宫颈癌hela细胞系；

图3为westernblot检测抗lncrna-6585p抗体；（a）e7885抗体检测结果；（b）e7886抗体检测结果；

图4为过表达lncrna-6585p的内皮细胞接种12h后transwell迁移和侵袭实验结果；（a）迁移实验结果统计；（b）侵袭实验结果统计（***p<0.001），其中横线条填充的pcdh组，无填充的为lncrna-6585p组；

图5为过表达lncrna-6585p的hela细胞接种12h后transwell迁移和侵袭实验结果；（a）迁移实验结果统计；（b）侵袭实验结果统计（*p<0.05，***p<0.001），其中横线条填充的pcdh组，无填充的为lncrna-6585p组。

具体实施方式

下面结合具体实例对本发明的方法进行详细描述和说明。其内容是对本发明的解释而非限定本发明的保护范围。

实施例1

在宫颈癌中低表达的长链非编码rnalncrna-6585p能够编码多肽

1、材料

1.1组织

本发明的临床组织标本均来自2013年11月至2017年6月于南京医科大学附属南京妇幼保健院妇产科治疗的ib1期宫颈癌患者，每对标本包含手术切除的宫颈癌组织和配对的癌旁组织。所有标本的使用均由患者或其委托人签署知情同意书，得到了南京医科大学医学伦理委员会批准。

1.2材料和细胞

慢病毒三质粒包装系统包括慢病毒表达载体pcdh-cmv-mcs-ef1-coprfp、包膜质粒pmd2.g和包装质粒，均为本实验室保存。实验所需的293t细胞以及人宫颈癌hela细胞均购自中国科学院细胞库，培养于含有10%灭活胎牛血清（fetalbovineserum，fbs）、庆大霉素（100u/ml）、链霉素（100μg/ml）和青霉素（100u/ml）的dmem培养基中。人脐静脉内皮细胞（humanumbilicalveinendothelialcells，huvecs）为本实验室保存，培养于含20%灭活胎牛血清中。细胞培养条件均为37℃、5%co2。

1.3试剂

trizol试剂购自美国thermoscientific公司；荧光实时定量pcr（real-timequantitativepolymerasechainreaction，rt-qpcr）所用2×chamqsybrqpcrmastermix试剂为南京诺唯赞生物有限公司产品；rt-qpcr的引物为苏州金唯智科技有限公司合成；抗flag的单克隆抗体（monoclonalantibody，mab）购自美国thermoscientific公司产品；eliteabc液以及dab显色试剂盒购自vector公司；arraystar公司的基因芯片产品（humanlncrnamicroarrayv3.0service）由上海康成生物工程有限公司代理。pcr所用的高保真酶（phanta酶）购自南京诺唯赞科技有限公司；凝胶纯化试剂盒购自美国omega公司；限制性内切酶为日本takara公司产品；t4dna连接酶、核酸标准分子量marker、质粒转染试剂lipofectamine^tm2000、trizol及蛋白标准分子量marker为美国thermoscientific公司产品；感受态大肠杆菌dh5α购自天根生化科技有限公司；ripa细胞裂解液、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂以及苯甲基磺酰氟化物（phenylmethylsulfonylfluoride，pmsf）为上海康成生物公司产品；抗内参基因α-tubulinmab购自美国santacruz公司；辣根过氧化物酶（hrp）标记的羊抗兔igg与羊抗鼠igg为中国碧云天公司产品。

2.方法

2.1宫颈癌组织及癌旁组织的lncrna芯片技术

以3例不同年龄（39岁、54岁、65岁）的宫颈癌患者的手术切除样本为对象，委托上海康成生物工程有限公司进行“arraystarhumanlncrnamicroarrayv3.0service”服务，进行差异lncrna筛选。

2.2分析差异表达lncrna编码多肽的能力

利用在线软件regrna2.0（http://regrna2.mbc.nctu.edu.tw/detection_output.php）和lncatlas（http://lncatlas.crg.eu/）分析差异表达的lncrna。其中转录区域位于22号染色体，核苷酸序列如seqidno：1所示，全长5725nt的lncrna具有潜在编码多肽的能力，命名为lncrna-6585。预测获得的可能编码多肽区域核苷酸序列如seqidno：2所示，该片段命名为lncrna-6585p。

2.3重组质粒pcdh-lncrna-6585p的构建

在2.2中预测的seqidno：2序列收尾各添加一个flag标签，送公司合成。用限制性内切酶xboi和bamhi对合成基因和pcdh-cmv-mcs-ef1-coprfp载体进行酶切、纯化、连接，转化至大肠杆菌，获得pcdh-lncrna-6585p的质粒。

2.4重组病毒的包装

取对数生长期的293t细胞，按1.5×10⁶个/板细胞数接种在直径10cm细胞培养板内，加入10ml不含抗生素的dmem培养基，于37℃、5%co2培养箱内培养。次日当细胞汇合度达70%～80%时，利用脂质体lipofectamine^tm2000将携带lncrna-6585编码区域的质粒pcdh-lncrna-6585p、包装质粒pspax2、包膜质粒pmd2.g按照4：3：1的比例共转染293t细胞，同时以pcdh-cmv-mcs-ef1-coprfp、pspax2、pmd2.g质粒共转染293t细胞作为空载体对照。于转染后10h更换新鲜的含抗生素的完全培养基。转染48h后利用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，gfp）的表达情况。转染48h和72h后分别收集细胞培养上清，将两次收集的上清混合后加入pb至终浓度为8μg/ml，然后经0.45μm滤器过滤后分装，于-70℃保存备用。将所获得的慢病毒分别命名为pcdh（慢病毒空载体）和lncrna-6585p（表达lncrna-6585p的重组慢病毒）。

2.5lncrna-6585p在huvecs和hela细胞中的表达

分别将huvecs和hela细胞以0.5×10⁶/孔接种于6孔板中，用无血清dmem培养基培养。当细胞汇合度达到70%~80%时去除培养基，用pcdh或lncrna-6585分别感染huvecs和hela细胞，8h后吸弃上清加入新鲜的完全培养基。于48h后经荧光显微镜观察gfp的表达情况；当rfp达90%以上时，说明稳定表达pcdh-lncrna-6585p及对照细胞构建成功。

2.6westernblot验证蛋白表达

2.6.1提取细胞总蛋白

配置细胞裂解液每100μlripa加入1μl蛋白酶抑制剂、1μl磷酸酶抑制剂、1μlpmsf、25μl4×十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsμlphate，sds）缓冲液。按每1×10⁴个细胞加入100μl细胞裂解液裂解细胞，涡旋震荡15s，冰浴8min，重复震荡三次。然后100°c沸水浴5min，再次冰浴5min，即为细胞总蛋白，蛋白分装后置于-70°c冰柜保存备用。

2.6.2westernblot

配置10%sds-page电泳凝胶，将2.5.1制备的蛋白样品以每孔20μl加入泳道。恒压60v电泳，待条带置于分离胶后，调整电压110v继续电泳至结束。后用恒流100ma100min将蛋白转移至聚偏（二）氟乙烯（polyvinylidenedifluoride，pvdf）膜，转膜结束后将膜置于5%脱脂牛奶中37°c封闭1h。分别加入抗flagpab、抗gapdhmab在4°c摇床孵育过夜。次日回收一抗，并用tbs-t洗涤条带（10min×3次）；然后分别加入辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase，hrp）标记的羊抗兔和羊抗鼠二抗，于37°c恒温箱中作用1h，tbs-t洗涤条带（10min×3次）；最后利用化学发光法检测。

3、结果

3.1基因芯片结果

通过arraystarhumanlncrnaexpressionmicroarrayv3.0技术，获得3例不同年龄的宫颈癌患者的肿瘤组织和癌旁组织中差异表达的基因（图1）。

3.2lncrna-6585具有编码多肽能力

westernblot结果如图2所示，从图中可以看出，lncrna-6585能够编码表达多肽。

实施例2

人长链非编码rnalncrna-6585编码多肽的抗体制备

1.抗体制备具体实施方式

1.1多肽序列的分析和设计

利用dnastar软件对lncrna-6585p编码多肽的氨基酸序列进行抗原表位分析，主要按照常规方法评估亲水性，抗原性，表面可能性，柔性区等指数，再结合过去制备抗体的实际经验，考虑氨基酸结构复杂程度，易氧化程度，合成难度，氨基酸类别和分布等，最终确定选择56-70aa合成多肽c-tdsklyipseyrsis（19mg，seqidno：4）。

1.2抗原制备

多肽c-tdsklyipseyrsis，溶解于pbs缓冲溶液中，巯基偶联到klh上，免疫2只兔子，于2018年05月22日转交免疫。

1.3免疫流程

1.4抗血清纯化

抗血清用c-tdsklyipseyrsis作抗原亲和纯化后，得到浓缩后的抗体。获得抗体e7885（浓度2.71mg/ml）和e7886（浓度2.31mg/ml）。

1.5westernblot检测抗原

westernblot检测条件：抗原包被量为100ng,抗体稀释比例为1:1000，1:5000，1:10000，1:50000，1:100000，1:200000。

1.6免疫印迹分析

通过实例1中的2.6所述方法以westernblot鉴定抗lncrna-6585p抗体。

2.结果

westernblot结果如图3所示，从图中可以看出制备获得的抗体可用于检测lncrna-6585p编码多肽的表达。

实施例3

长链非编码rnalncrna-6585p在抗肿瘤中的应用

1、材料

1.1细胞

实验所用到的huvecs和hela细胞培养方法同实施例2。

1.2试剂

慢病毒pcdh和lncrna-6585p包装同实施例2。transwell小室（8μm）购于millipore公司。

2、方法

2.1transwell迁移实验

向24孔板每孔中加入500μl含10%灭活胎牛血清的dmem培养基，将transwell小室置于孔内，放入细胞培养箱平衡30min。将phagehuvec、lncrna-6585phuvec、phagehela、lncrna-6585phelaa四组细胞分别消化计数，并用纯dmem培养基将细胞密度调整为5×10⁴个/ml。每个小室加入200μl细胞悬液，即每孔为1×10⁴个细胞，每组设置3个复孔。置于培养箱中继续培养，并于培养12h后取出小室，甲醛固定15min，结晶紫染色15min。晾干后在显微镜下拍照，对穿过小室的细胞数量进行计数分析。

2.2matrigel侵袭实验

将基质胶和dmem培养基按体积1：7配成基质胶-dmem混合液，置于冰上备用。将transwell小室置于24孔板中，下室加入500μldmem培养基，每个小室加入60μl基质胶-dmem混合液，于37°c、5%co2细胞培养箱中凝胶1h。分别消化phagehuvec、lncrna-6585phuvec、phagehela、lncrna-6585phelaa四组细胞，计数后用dmem培养基配制成5×105个/ml的细胞悬液。向每个小室加入200μl细胞悬液，即每孔1×105个细胞，每组设置3个复孔。将24孔板放入细胞培养箱，于12h取出小室染色固定，显微镜下拍照计数，观察进入下室的细胞数量以判断细胞侵袭情况。

3、结果

lncrna-6585p抑制内皮细胞和宫颈癌细胞的迁移和侵袭

通过transwell小室迁移和matrigel侵袭实验验证lncrna-6585p在内皮细胞和宫颈癌细胞迁移中的作用，统计结果表明，在细胞铺板12h后，lncrna-6585p组穿入小室底部的细胞数量均少于pcdh组。以上结果提示，过表达lncrna-6585p可抑制内皮细胞（图4a和图4b）和宫颈癌细胞（图5a和图5b）的迁移和侵袭。

上述结果表明，lncrna-6585p的过表达能够明显抑制内皮细胞和宫颈癌细胞的迁移和侵袭能力，说明宫颈癌中低水平表达的lncrna-6585及其编码表达的多肽参与调控肿瘤发生，而且具有抗宫颈癌变的潜能，为宫颈癌及其他肿瘤的诊断和治疗提供了新的分子标记和药物靶标。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

序列表

<110>南京医科大学

<120>一种长链非编码rnalncrna-6585及其抗体与应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>5725

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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<210>2

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

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<213>多肽(polypeptide)

<400>3

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151015

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<213>多肽(polypeptide)

<400>4

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151015