本发明属于啤酒酵母选育技术领域，具体涉及一种低产乙醛拉格啤酒酵母的选育方法。
背景技术：
拉格啤酒，源自德文“储存”，是一种桶底酵母发酵，再经过低温储存的啤酒。桶底发酵，就是酵母在发酵时沉在麦汁的下方。发酵温度一般在10~12摄氏度。常见的有pilsner、americanlager、bock等，多数注重清爽和麦芽的香味，一些特别的拉格啤酒也会有水果或坚果的香味。
啤酒在发酵过程中被微生物分解，生成很多产物，其中有多种风味物质，比如醛类、高级醇、高级酯等，它们对啤酒的风味影响差别也很大，尤其是乙醛造成的影响较大。乙醛是啤酒羟基化合物中含量最高的醛类，占啤酒中总醛类物质的60%。啤酒中乙醛含量过高除了会带来不愉快气味外，还会缩短啤酒风味的保鲜期，甚至饮用后对人体健康有副作用。如果我们能够将啤酒中乙醛的含量控制下来，对其的风味和其对人健康的影响的变化都是很大的。比较现有工艺方法可以发现，通过改进生产工艺的方法来降低产生的乙醛含量的方法很多，也有人运用基因工程手段构造重组菌株的方法获得低乙醛啤酒酵母菌株，此外，还有利用超高压进行诱变的方法等。
本发明是在紫外诱变技术的基础上，通过一系列筛选方法确定一种筛选产乙醛低的酵母的方法，以便用于拉格的工业化生产中，做到以此方法筛选的菌株进行发酵生产获得高品质拉格啤酒，同时，产生较大的经济方面的效益。
技术实现要素：
为了解决啤酒中乙醛含量过高带来的不愉快气味外，延长啤酒风味的保鲜期，避免饮用后对人体健康有副作用，本发明在紫外诱变技术的基础上，通过一系列筛选方法确定一种筛选产乙醛低的酵母的方法，筛选的菌株进行发酵生产获得高品质拉格啤酒。
一种低产乙醛拉格啤酒酵母的选育方法依次包括如下步骤：
（1）取大麦混合粉碎，加水后加热至65~68℃，调节ph为4.6~5.5，过滤后添加大豆提取液混合均匀，将混合液煮沸并再次过滤，加水调整糖度至10~12，灭菌；对灭菌后的培养基进行二次过滤灭菌，得到选育培养基；
（2）活化干酵母，并接种至选育培养基中，置于培养箱中培养；并选择培养后长势前10~35%的菌株作为出发菌株，并斜面保藏；
（3）取经斜面保藏的出发菌株将其置于培养箱中培养，并涂布在选育培养基平板上，然后对涂布有出发菌的选育培养基平板分别在200±10nm，295±10nm和330±10nm的紫外光波长条件下照射；紫外照射完成后，诱变菌液在黑暗环境中保存，得到紫外诱变后的菌种；
（4）将经过紫外诱变后的菌种采用希夫试剂染色处理，筛选出品红色的菌落，挑出斜面培养；
（5）取乙醛加入选育培养基中，加水稀释，将经希夫试剂筛选得到的菌株在含有乙醛的乙醛培养基中二次培养、筛选，筛选后对菌株斜面保藏，并扩大培养，得到低产乙醛拉格啤酒酵母。
进一步，所述调节ph控制在4.6~5.5范围内。
进一步，所述首次过滤后添加大豆提取液量为3.2~4.6ml。
进一步，所述紫外诱变处理前设定菌株与紫外灯的垂直距离为23~25cm。
进一步，所述紫外诱变处理照射是将出发菌株1在三段紫外光波长条件下照射：先在紫外光波长200±5nm的紫外灯下照射30~45s时间；间隔5~20min后，在紫外光波长295±5nm的紫外灯下照射20~35s时间；间隔1~8min后，再在紫外光波长330±5nm的紫外灯下照射10~30s时间。
进一步，所述含有乙醛的选育培养基中乙醛浓度为4.8~5.8mg/l。
进一步，所述三角瓶发酵实验中培养箱中培养条件为20~29℃条件下培养12~48h。
有益效果
本发明采用出发菌株先经紫外诱变后，利用希夫试剂初筛，再将筛选的菌株在含有乙醛浓度为4.8~5.8mg/l的乙醛培养基中二次培养、筛选，最后经高效液相色谱进行定量分析的方法，此法得到的乙醛降幅基本保持在16~20%之间，且此方法选育的菌种具有一定的稳定性，可以应用于工业化生产中。
将紫外诱变、希夫试剂初筛与乙醛乙醛培养基二次筛选和高效液相色谱定量测定综合起来，对出发菌株进行多次的连续筛选，能够进一步降低菌株产生乙醛的量，紫外光照的波长和时间对于低产乙醛有显著的影响，如果都使用330nm和200nm的紫外光照射，其乙醛产量会显著提升，可能分段式紫外光照对于低乙醛产品的酵母有一定的刺激作用，使其能够发挥低产乙醛的作用，可能是影响乙醛产生酶的活性有关，具体机理有待进一步深入研究。
本实验中使用的出发菌株是从啤酒生产工厂获得，是对生产菌株的优化，是进一步的改进，有利于降低能源的消耗，增加企业的收益，具有良好的市场前景。
具体实施方式
实施例1
本实施例中，所用原料及麦芽均由为市售，希夫试剂为实验室自制无色品红溶液，酵母为市售s-189啤酒酵母，大豆提取液取自大豆加工厂半成品。
高效液相色谱仪型号为eclassicalw3200(elite)；分析柱c18。
所用化学试剂均为分析纯。
一种低产乙醛拉格啤酒酵母的选育方法，其制备方法如下：
1.选育培养基的制备
取法国大麦30g，国产大麦55g，焦香麦芽15g，混合并用粉碎机粉碎，称取粉碎物100g，以1:4（粉碎物：水）的比例加入400g水，在65~68℃水浴锅中加热2h，取出，加入kh2po4和k2hpo4组成的ph缓冲剂调节ph在4.9~5.2范围内，用生物实验棉纱布进行首次过滤；过滤后，添加大豆提取液3.8~4.2ml，混合均匀后将滤液煮沸15min，进行再次过滤，用糖度计测其糖度，并加水调整糖度值为10后，在0.103mpa，121℃条件下灭菌20min。对灭菌后的培养基进行二次过滤灭菌，得到选育培养基。其中，所述大豆提取液为大豆粉碎后，用水浸提后的混合液，大豆粉含量在3~10%之间。
2.酵母的活化
取200ml无菌水，加入无菌条件下取的10g干的s-189啤酒酵母，置于摇床上进行活化处理。吸取5ml活化后的酵母悬液进行平板涂布，并置于培养箱中在23~26℃条件下培养48~72h。选择培养后长势最好的前10~17%比例的菌株作为出发菌株1，进行斜面保藏。
3.紫外诱变
取经斜面保藏的出发菌株1将其置于培养箱中在30~32℃条件下培养2h，再在选育培养基上涂布，然后对涂布有酵母菌的选育培养基平板进行紫外诱变处理。紫外诱变处理前预先在选育培养基平板放入一无菌磁力搅拌子，然后将选育培养基平板置磁力拌器上，设定菌株与紫外灯的垂直距离为24cm。在正式照射前，先开紫外灯预热10min，然后开启皿盖，在搅拌下照射20s。照射处理开始时，同时打开磁力搅拌器进行搅拌；照射时，先将出发菌株1在紫外光波长200±5nm的紫外灯下照射40s时间；间隔5~10min后，再将出发菌株1在紫外光波长295±5nm的紫外灯下照射30s时间；间隔1~3min后，再将出发菌株1在紫外光波长330±5nm的紫外灯下照射20s时间。照射完成后，诱变菌液在黑暗环境中保存1～2h，得到紫外诱变后的菌种。
4.希夫试剂筛选
将经过紫外诱变后的菌种采用希夫试剂染色处理，筛选出品红色的菌落，挑出斜面培养。
5.乙醛培养基二次筛选
将乙醛加入选育培养基中，加水稀释，使得乙醛的终浓度为5.2~5.5mg/l。将经希夫试剂筛选得到的菌株在含有乙醛浓度为5.2~5.5mg/l的乙醛培养基中二次筛选，筛选后对菌株斜面保藏。
6.三角瓶发酵
对筛选出的斜面保藏的菌株进行三角瓶发酵实验。从装有100ml无菌水的三角瓶中取10mll水加入到试管斜面，用接种环将斜面上的酵母菌刮下来后，然后将其加入到前面装有无菌水的三角瓶中，再向装有100ml麦芽汁的三角瓶中加入1ml此菌液，将三角瓶放于23~26℃条件下培养箱中培养24~32h，得到选育后的菌株。
7.发酵液中的乙醛含量的测定方法
取上述经过处理的发酵液用于液相色谱测定。高效液相色谱测定中，流动相中乙腈与水的体积比为3:1，流速为1.0ml/min，对所进样品的分析运行时间为5min，每次所进样的量为10.0μl，柱温为30℃，检测器为二极管阵列检测器，检测波长为360nm。
将经过孔径为0.45μm的水系微孔滤膜过滤的发酵液，与经过孔径为0.45μm的有机系微孔滤膜过滤的2,4-二硝基苯肼，按照体积比为2:1的比例加入反应管，静置30min后再进行测定。
根据标准曲线方程，由峰面积计算出样品中反应产物乙醛-2,4-二硝基苯腙的浓度，从而计算出发酵液中乙醛含量。根据所有发酵液测出来的值，经过换算后得出各菌株发酵液中乙醛含量。
诱变方法稳定性实验
重新选取一株酵母菌作为出发菌株2，通过前面的方法对其进行处理后筛选的菌株作为原代，同时进行传代实验，连续培养至第5代，对每代菌都进行发酵实验，按照同样的液相色谱条件进行测量分析，验证筛选方法的稳定性，得出如下数据：
出发菌2乙醛浓度（mg/l）:1.588
出发菌2原代乙醛浓度（mg/l）:1.333
出发菌2第1代乙醛浓度（mg/l）:1.343
出发菌2第2代乙醛浓度（mg/l）:1.327
出发菌2第3代乙醛浓度（mg/l）:1.318
出发菌2第4代乙醛浓度（mg/l）:1.332
出发菌2第5代乙醛浓度（mg/l）:1.339
从结果中可以发现，各代菌株产生的乙醛含量都低于原菌发酵液中的乙醛量，相对于出发菌2，出发菌株2原代至第5代产生的乙醛降幅为16.06%、15.43%、16.44%、17.00%、16.12%、15.68%。虽然随着代数的增加产生的乙醛含量呈现出较小的增加的现象，但是乙醛降幅基本保持在16~17%。从实验结果来看，不仅此筛选方法筛选出的菌株能够使乙醛含量显著下降，而且具有很高的稳定性。
实施例2
本实施例中，所用原料及麦芽均由实验室提供，希夫试剂为实验室自制无色品红溶液，酵母为安琪干酵母，大豆提取液取自大豆加工厂半成品。
所述高效液相色谱仪型号为eclassicalw3200(elite)；分析柱c18。
所用化学试剂均为分析纯。
一种低产乙醛拉格啤酒酵母的选育方法，其制备方法如下：
1.选育培养基的制备
取法国大麦35g，国产大麦55g，焦香麦芽10g，混合并用粉碎机粉碎，称取粉碎物100g，以1:5（粉碎物：水）的比例加入500g水，在65~68℃水浴锅中加热1h，取出，加入kh2po4和k2hpo4组成的ph缓冲剂调节ph在4.6~4.8范围内，用生物实验棉纱布进行首次过滤；过滤后，添加大豆提取液3.2~3.7ml，混合均匀后将滤液煮沸10min，进行再次过滤，用糖度计测其糖度，并加水调整糖度值为11后，在0.103mpa，121℃条件下灭菌20min。对灭菌后的培养基进行二次过滤灭菌，得到选育培养基。其中，所述大豆提取液为大豆粉碎后，用水浸提后的混合液，大豆粉含量在3~10%之间。
2.酵母的活化
取200ml无菌水，加入无菌条件下取的10g干的s-189啤酒酵母，置于摇床上进行活化处理。吸取5ml活化后的酵母悬液进行平板涂布，并置于培养箱中在27~28℃条件下培养36~48h。选择培养后长势最好的前18~26%比例的菌株作为出发菌株1，进行斜面保藏。
3.紫外诱变
取经斜面保藏的出发菌株1将其置于培养箱中在27~29℃条件下培养3h，再在选育培养基上涂布，然后对涂布有酵母菌的选育培养基平板进行紫外诱变处理。紫外诱变处理前预先在选育培养基平板放入一无菌磁力搅拌子，然后将选育培养基平板置磁力拌器上，设定菌株与紫外灯的垂直距离为23cm。在正式照射前，先开紫外灯预热12min，然后开启皿盖，在搅拌下照射15s。照射处理开始时，同时打开磁力搅拌器进行搅拌；照射时，先将出发菌株1在紫外光波长200±5nm的紫外灯下照射45s时间；间隔11~15min后，再将出发菌株1在紫外光波长295±5nm的紫外灯下照射35s时间；间隔4~5min后，再将出发菌株1在紫外光波长330±5nm的紫外灯下照射10s时间。照射完成后，诱变菌液在黑暗环境中保存1～2h，得到紫外诱变后的菌种。
4.希夫试剂筛选
将经过紫外诱变后的菌种采用希夫试剂染色处理，筛选出品红色的菌落，挑出斜面培养。
5.乙醛培养基二次筛选
将乙醛加入选育培养基中，加水稀释，使得乙醛的终浓度为4.8~5.1mg/l。将经希夫试剂筛选得到的菌株在含有乙醛浓度为4.8~5.1mg/l的乙醛培养基中二次培养、筛选，筛选后对菌株斜面保藏。
6.三角瓶发酵
对筛选出的斜面保藏的菌株进行三角瓶发酵实验。从装有100ml无菌水的三角瓶中取10mll水加入到试管斜面，用接种环将斜面上的酵母菌刮下来后，然后将其加入到前面装有无菌水的三角瓶中，再向装有100ml麦芽汁的三角瓶中加入1ml此菌液，将三角瓶放于20~22℃条件下培养箱中培养32~48h，得到选育后的菌株。
7.发酵液中的乙醛含量的测定方法
取上述经过处理的发酵液用于液相色谱测定。高效液相色谱测定中，流动相中乙腈与水的体积比为3:1，流速为1.0ml/min，对所进样品的分析运行时间为5min，每次所进样的量为10.0μl，柱温为30℃，检测器为二极管阵列检测器，检测波长为360nm。
将经过孔径为0.45μm的水系微孔滤膜过滤的发酵液，与经过孔径为0.45μm的有机系微孔滤膜过滤的2,4-二硝基苯肼，按照体积比为2:1的比例加入反应管，静置30min后再进行测定。
根据标准曲线方程，由峰面积计算出样品中反应产物乙醛-2,4-二硝基苯腙的浓度，从而计算出发酵液中乙醛含量。根据所有发酵液测出来的值，经过换算后得出各菌株发酵液中乙醛含量。
经过本实施例选育过的拉格啤酒酵母的乙醛含量由1.361±0.073mg/l降低到1.108±0.142mg/l。
实施例3
本实施例中，所用原料及麦芽均由实验室提供，希夫试剂为实验室自制无色品红溶液，酵母为安琪干酵母，大豆提取液取自大豆加工厂半成品。
所述高效液相色谱仪型号为eclassicalw3200(elite)；分析柱c18。
所用化学试剂均为分析纯。
一种低产乙醛拉格啤酒酵母的选育方法，其制备方法如下：
1.选育培养基的制备
取法国大麦25g，国产大麦60g，焦香麦芽15g，混合并用粉碎机粉碎，称取粉碎物100g，以1:6（粉碎物：水）的比例加入600g水，在65~68℃水浴锅中加热3h，取出，加入kh2po4和k2hpo4组成的ph缓冲剂调节ph在5.3-5.5范围内，用生物实验棉纱布进行首次过滤；过滤后，添加大豆提取液4.3~4.6ml，混合均匀后将滤液煮沸20min，进行再次过滤，用糖度计测其糖度，并加水调整糖度值为12后，在0.103mpa，121℃条件下灭菌20min。对灭菌后的培养基进行二次过滤灭菌，得到选育培养基。其中，所述大豆提取液为大豆粉碎后，用水浸提后的混合液，大豆粉含量在3~10%之间。
2.酵母的活化
取200ml无菌水，加入无菌条件下取的10g干的s-189啤酒酵母，置于摇床上进行活化处理。吸取5ml活化后的酵母悬液进行平板涂布，并置于培养箱中在29~32℃条件下培养24~36h。选择培养后长势最好的前27~35%比例的菌株作为出发菌株1，进行斜面保藏。
3.紫外诱变
取经斜面保藏的出发菌株1将其置于培养箱中在33~35℃条件下培养1h，再在选育培养基上涂布，然后对涂布有酵母菌的选育培养基平板进行紫外诱变处理。紫外诱变处理前预先在选育培养基平板放入一无菌磁力搅拌子，然后将选育培养基平板置磁力拌器上，设定菌株与紫外灯的垂直距离为25cm。在正式照射前，先开紫外灯预热8min，然后开启皿盖，在搅拌下照射25s。照射处理开始时，同时打开磁力搅拌器进行搅拌；照射时，先将出发菌株1在紫外光波长200±5nm的紫外灯下照射30s时间；间隔16~20min后，再将出发菌株1在紫外光波长295±5nm的紫外灯下照射20s时间；间隔6~8min后，再将出发菌株1在紫外光波长330±5nm的紫外灯下照射30s时间。照射完成后，诱变菌液在黑暗环境中保存1～2h，得到紫外诱变后的菌种。
4.希夫试剂筛选
将经过紫外诱变后的菌种采用希夫试剂染色处理，筛选出品红色的菌落，挑出斜面培养。
5.乙醛培养基二次筛选
将乙醛加入选育培养基中，加水稀释，使得乙醛在选育培养基的终浓度为5.6~5.8mg/l。将经希夫试剂筛选得到的菌株在含有乙醛浓度为5.6~5.8mg/l的乙醛培养基中二次培养、筛选，筛选后对菌株斜面保藏。
6.三角瓶发酵
对筛选出的斜面保藏的菌株进行三角瓶发酵实验。从装有100ml无菌水的三角瓶中取10mll水加入到试管斜面，用接种环将斜面上的酵母菌刮下来后，然后将其加入到前面装有无菌水的三角瓶中，再向装有100ml麦芽汁的三角瓶中加入1ml此菌液，将三角瓶放于27~29℃条件下培养箱中培养12~24h，得到选育后的菌株。
7.发酵液中的乙醛含量的测定方法
取上述经过处理的发酵液用于液相色谱测定。高效液相色谱测定中，流动相中乙腈与水的体积比为3:1，流速为1.0ml/min，对所进样品的分析运行时间为5min，每次所进样的量为10.0μl，柱温为30℃，检测器为二极管阵列检测器，检测波长为360nm。
将经过孔径为0.45μm的水系微孔滤膜过滤的发酵液，与经过孔径为0.45μm的有机系微孔滤膜过滤的2,4-二硝基苯肼，按照体积比为2:1的比例加入反应管，静置30min后再进行测定。
根据标准曲线方程，由峰面积计算出样品中反应产物乙醛-2,4-二硝基苯腙的浓度，从而计算出发酵液中乙醛含量。根据所有发酵液测出来的值，经过换算后得出各菌株发酵液中乙醛含量。
经过本实施例选育过的拉格啤酒酵母的乙醛含量由1.457±0.026mg/l降低到1.181±0.081mg/l。