真核细胞中DNA结合蛋白的染色体免疫共沉淀方法及试剂盒与流程

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及dna提取纯化技术领域，具体是指一种真核细胞中dna结合蛋白的染色体免疫共沉淀方法及相关试剂盒。

背景技术：

真核生物的基因组dna以染色质的形式存在，因此研究蛋白质与dna在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。染色质免疫沉淀技术(chromatinimmunoprecipitation，chip)是目前唯一研究体内dna与蛋白质相互作用的方法。它的原理是在活细胞状态下交联蛋白质-dna复合物并将其切断为小片段，然后通过免疫学方法特异性地富集dna片段，从而获得蛋白质与dna相互作用的信息。而且chip与其他方法的结合，扩大了其应用范围：如高通量筛选和rna-chip，是深入分析癌症、心血管疾病以及中央神经系统紊乱等疾病的主要通路的一种非常有效的工具。

chip的原理是在保持组蛋白和dna联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被超声或者酶切成小的片断，并沉淀。chip是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“蛋白a/g”特异性地结合到免疫球蛋白的fc片段的现象活用开发出来的方法。目前大多使用的蛋白a/g预先结合固化在磁性或琼脂糖珠上，使之与含有抗原的溶液及抗体结合后，就能吸附抗原达到精制的目的。

目前，染色体免疫共沉淀的费用较高，并且全部为国外垄断，针对目前国内科研发展和大样本的临床检测，市场上存在的染色体免疫共沉淀试剂盒对进行组蛋白的染色体免疫共沉淀是可以满足的，但针对转录因子等特异性的蛋白因子技术尚未成熟，效果明显不足。而且目前针对转录因子染色体免疫共沉淀试剂盒的价格居高不下，且全部为国外垄断。

中国发明专利申请cn201510073437.2“应用于组织样本中组蛋白修饰染色体免疫共沉淀方法”公开了一种应用于组织样本中组蛋白修饰染色体免疫共沉淀方法，首先进行组织样本前处理；然后在冰浴中研磨后，用无菌纱布过滤，收集滤液中的细胞，悬浮在酶切消化缓冲液中水浴；将加入酶切消化缓冲液的细胞，加入微球菌核酸酶，酶切后，加入与微球菌核酸酶等量的酶切终止液；在冰浴下进行高频超声并离心处理，得到破碎的染色质溶液；取proteina/g，加入含牛血清白蛋白的pbs缓冲液，再加抗体孵育，加入破碎的染色质溶液，过夜孵育；在磁力架上用高盐溶液多次洗涤，洗涤后用te溶液洗脱磁力珠上的dna，用纯化液纯化提取dna，用超纯水溶解dna。但是蛋白a或蛋白g与igg的fc区域特异性结合，如果蛋白a或蛋白g与igg的fc区域的特异性结合影响抗体的抗原结合位点，将大大影响目的dna的富集，从而影响后续分析与检测；而且即便是同样结合igg的fc区域的蛋白a和蛋白g，结合能力也是不一样的，蛋白g的结合能力大于蛋白a的结合能力，因此，富集到的目的dna的量也会不一样。

因此，需要提供一种真核细胞中dna结合蛋白的染色体免疫共沉淀方法，其能大量富集目的dna，片段能很好的控制在100-500bp之间，有利于提高科研和临床样本的检测效果，有利于表观学研究和临床生物医药的开发和结果检测，且提取成本低。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术中的缺点，本发明的一个目的在于提供一种真核细胞中dna结合蛋白的染色体免疫共沉淀方法，其能大量富集目的dna，片段能很好的控制在100-500bp之间，有利于提高科研和临床样本的检测效果，有利于表观学研究和临床生物医药的开发和结果检测，适于大规模推广应用。

本发明的另一目的在于提供一种真核细胞中dna结合蛋白的染色体免疫共沉淀方法，其设计巧妙，操作简便快捷，成本低，适于大规模推广应用。

本发明的另一目的在于提供一种真核细胞中dna结合蛋白的染色体免疫共沉淀试剂盒，采用该试剂盒能大量富集目的dna，片段能很好的控制在100-500bp之间，有利于提高科研和临床样本的检测效果，有利于表观学研究和临床生物医药的开发和结果检测，适于大规模推广应用。

本发明的另一目的在于提供一种真核细胞中dna结合蛋白的染色体免疫共沉淀试剂盒，其设计巧妙，使用该试剂盒操作简便快捷，该试剂盒的生产成本低，适于大规模推广应用。

为达到以上目的，在本发明的第一方面，提供一种真核细胞中dna结合蛋白的染色体免疫共沉淀方法，其特点是，包括以下步骤：

(1)交联真核细胞悬浮液的真核细胞中的蛋白质与染色质形成交联的蛋白质染色质复合物；

(2)裂解所述真核细胞从而释放所述的交联的蛋白质染色质复合物；

(3)剪切所述的交联的蛋白质染色质复合物；

(4)加入包被有蛋白a的磁珠、包被有蛋白g的磁珠和包被有蛋白l的磁珠或者加入包被有蛋白a、蛋白g和蛋白l的磁珠，并加入期望的dna结合蛋白的抗体，进行孵育；

(5)洗涤所述磁珠；

(6)洗脱所述磁珠吸附的部分所述的交联的蛋白质染色质复合物；

(7)解交联该部分所述的交联的蛋白质染色质复合物；

(8)提取纯化dna。

较佳地，在所述步骤(1)中，采用甲醛进行所述交联，所述甲醛的终浓度为0.1％(v/v)～5％(v/v)，所述交联的时间为5分钟～20分钟。

较佳地，在所述步骤(2)中，采用1％sds裂解液进行所述裂解，所述1％sds裂解液包括：1％重量sds、10mmedta、50mmph8.0的tris-hcl和1mmpmsf，所述真核细胞的数量为5×10⁷个～15×10⁷个，所述1％sds裂解液的加入量为500ul，所述裂解在冰浴下进行，所述裂解的时间为8分钟～15分钟。

较佳地，在所述步骤(3)中，采用超声方法进行所述剪切，所述超声方法为：开启超声20秒～40秒和停止超声30秒～60秒为一个循环，进行8个～15个所述循环，所述超声的频率为20khz～60khz。

较佳地，所述磁珠是经过预处理的磁珠，所述预处理是采用第一清洗液洗涤所述磁珠1小时～2小时，所述第一清洗液包括0.01％sds裂解液、1.2mmedta、16.7mmph8.0的tris-hcl、167mmnacl、1mmpmsf、1.1％(v/v)tritonx-100，所述0.01％sds裂解液包括：0.01％重量sds、0.1mmedta、0.5mmph8.0的tris-hcl和0.01mmpmsf。

较佳地，在所述步骤(4)中，对于每毫升所述的交联的蛋白质染色质复合物，所述磁珠的加入量为15μl～50μl，所述孵育为旋转孵育，所述旋转孵育的转速为10循环/分钟～20循环/分钟，所述孵育在4℃～8℃过夜进行。

较佳地，在所述步骤(4)中，所述的期望的dna结合蛋白是组蛋白或转录因子。

较佳地，在所述步骤(4)中，对于每毫升所述的交联的蛋白质染色质复合物，所述抗体的加入量为2μg～6μg。

较佳地，在所述步骤(5)中，分别用第一洗涤液、第二洗涤液、第三洗涤液、第四洗涤液和第二清洗液在冰上磁吸附条件下颠倒旋转孵育进行所述洗涤，所述颠倒旋转孵育的转速为10循环/分钟～20循环/分钟，所述第一洗涤液、所述第二洗涤液、所述第三洗涤液、所述第四洗涤液和所述第二清洗液的用量为1ml，所述洗涤的时间为3分钟～8分钟，其中，

所述第一洗涤液包括：10mmph8.0的tris-hcl、150mmnacl、1％(v/v)tritonx-100、2mmedta、0.1％sds裂解液；

所述第二洗涤液包括：20mmph8.0的tris-hcl、500mmnacl、1％(v/v)tritonx-100、2mmedta、0.1％sds裂解液；

所述0.1％sds裂解液包括：0.1％重量sds、1mmedta、5mmph8.0的tris-hcl和0.1mmpmsf；所述第三洗涤液包括：10mmph8.0的tris-hcl、250mmlicl、1％np-40、1％(m/v)脱氧胆酸钠、1mmedta；

所述第四洗涤液包括：10mmph7.5的tris-hcl、1mmedta；

所述第二清洗液包括：137mmol/lnacl、2.7mmol/lkcl、10mmol/lna2hpo4、2mmol/lkh2po4，ph7.2～7.4。

较佳地，在所述步骤(6)中，采用洗脱液在冰上磁吸附条件下60℃～70℃旋转孵育进行所述洗脱，所述旋转孵育的转速为10循环/分钟～20循环/分钟，所述洗脱液包括：1％sds裂解液、100mmnahco3、1mmpmsf；所述洗脱液的加入量为250微升～300微升，所述洗脱的时间为10分钟～30分钟，所述1％sds裂解液包括：1％重量sds、10mmedta、50mmph8.0的tris-hcl和1mmpmsf。

较佳地，在所述步骤(7)中，采用5m氯化钠在冰上磁吸附条件下58℃-68℃过夜进行所述解交联，所述5m氯化钠的加入量为25微升～30微升。

较佳地，在所述步骤(8)中，采用酚氯仿抽提所述dna，采用糖原纯化所述dna，采用超纯水溶解所述dna。

在本发明的第二方面，提供了一种真核细胞中dna结合蛋白的染色体免疫共沉淀试剂盒，其特点是，包括包被有蛋白a的磁珠、包被有蛋白g的磁珠和包被有蛋白l的磁珠，或者包括包被有蛋白a、蛋白g和蛋白l的磁珠。

较佳地，所述的真核细胞中dna结合蛋白的染色体免疫共沉淀试剂盒还包括甲醛。

较佳地，所述的真核细胞中dna结合蛋白的染色体免疫共沉淀试剂盒还包括1％sds裂解液，所述1％sds裂解液包括：1％重量sds、10mmedta，50mmph8.0的tris-hcl和1mmpmsf。

较佳地，所述的真核细胞中dna结合蛋白的染色体免疫共沉淀试剂盒还包括第一洗涤液、第二洗涤液、第三洗涤液、第四洗涤液和第二清洗液，其中，

所述第一洗涤液包括：10mmph8.0的tris-hcl、150mmnacl、1％(v/v)tritonx-100、2mmedta、0.1％sds裂解液；

所述第二洗涤液包括：20mmph8.0的tris-hcl、500mmnacl、1％(v/v)tritonx-100、2mmedta、0.1％sds裂解液；

所述0.1％sds裂解液包括：0.1％重量sds、1mmedta、5mmph8.0的tris-hcl和0.1mmpmsf；

所述第三洗涤液包括：10mmph8.0的tris-hcl、250mmlicl、1％np-40、1％(m/v)脱氧胆酸钠、1mmedta；

所述第四洗涤液包括：10mmph7.5的tris-hcl、1mmedta；

所述第二清洗液包括：137mmol/lnacl、2.7mmol/lkcl、10mmol/lna2hpo4、2mmol/lkh2po4，ph7.2～7.4。

较佳地，所述的真核细胞中dna结合蛋白的染色体免疫共沉淀试剂盒还包括洗脱液，所述洗脱液包括1％sds裂解液、100mmnahco3、1mmpmsf，所述1％sds裂解液包括：1％重量sds、10mmedta、50mmph8.0的tris-hcl和1mmpmsf。

较佳地，所述的真核细胞中dna结合蛋白的染色体免疫共沉淀试剂盒还包括氯化钠。

较佳地，所述的真核细胞中dna结合蛋白的染色体免疫共沉淀试剂盒还包括糖原。

较佳地，所述的真核细胞中dna结合蛋白的染色体免疫共沉淀试剂盒还包括甘氨酸、蛋白酶k和rna酶a中的至少一种。

本发明的有益效果主要在于：

1、本发明的真核细胞中dna结合蛋白的染色体免疫共沉淀方法包括：(1)交联真核细胞悬浮液的真核细胞中的蛋白质与染色质形成交联的蛋白质染色质复合物；(2)裂解真核细胞从而释放交联的蛋白质染色质复合物；(3)剪切交联的蛋白质染色质复合物；(4)加入包被有蛋白a的磁珠、包被有蛋白g的磁珠和包被有蛋白l的磁珠或者加入包被有蛋白a、蛋白g和蛋白l的磁珠，并加入期望的dna结合蛋白的抗体，进行孵育；(5)洗涤磁珠；(6)洗脱磁珠吸附的部分的交联的蛋白质染色质复合物；(7)解交联部分的交联的蛋白质染色质复合物；(8)提取纯化dna，获得的dna能很好的控制在100-500bp之间，浓度明显比同类产品良好，能够提高10％(m/v)左右，因此，采用该方法能大量富集目的dna，片段能很好的控制在100-500bp之间，有利于提高科研和临床样本的检测效果，有利于表观学研究和临床生物医药的开发和结果检测，适于大规模推广应用。

2、本发明的真核细胞中dna结合蛋白的染色体免疫共沉淀方法包括：(1)交联真核细胞悬浮液的真核细胞中的蛋白质与染色质形成交联的蛋白质染色质复合物；(2)裂解真核细胞从而释放交联的蛋白质染色质复合物；(3)剪切交联的蛋白质染色质复合物；(4)加入包被有蛋白a的磁珠、包被有蛋白g的磁珠和包被有蛋白l的磁珠或者加入包被有蛋白a、蛋白g和蛋白l的磁珠，并加入期望的dna结合蛋白的抗体，进行孵育；(5)洗涤磁珠；(6)洗脱磁珠吸附的部分的交联的蛋白质染色质复合物；(7)解交联部分的交联的蛋白质染色质复合物；(8)提取纯化dna，获得的dna能很好的控制在100-500bp之间，浓度明显比同类产品良好，能够提高10％(m/v)左右，因此，其设计巧妙，操作简便快捷，成本低，适于大规模推广应用。

3、本发明的真核细胞中dna结合蛋白的染色体免疫共沉淀试剂盒包括包被有蛋白a的磁珠、包被有蛋白g的磁珠和包被有蛋白l的磁珠，或者包括包被有蛋白a、蛋白g和蛋白l的磁珠，通过(1)交联真核细胞悬浮液的真核细胞中的蛋白质与染色质形成交联的蛋白质染色质复合物；(2)裂解真核细胞从而释放交联的蛋白质染色质复合物；(3)剪切交联的蛋白质染色质复合物；(4)加入上述磁珠，并加入期望的dna结合蛋白的抗体，进行孵育；(5)洗涤磁珠；(6)洗脱磁珠吸附的部分的交联的蛋白质染色质复合物；(7)解交联部分的交联的蛋白质染色质复合物；(8)提取纯化dna，获得的dna能很好的控制在100-500bp之间，浓度明显比同类产品良好，能够提高10％(m/v)左右，因此，采用该试剂盒能大量富集目的dna，片段能很好的控制在100-500bp之间，有利于提高科研和临床样本的检测效果，有利于表观学研究和临床生物医药的开发和结果检测，适于大规模推广应用。

4、本发明的真核细胞中dna结合蛋白的染色体免疫共沉淀试剂盒包括包被有蛋白a的磁珠、包被有蛋白g的磁珠和包被有蛋白l的磁珠，或者包括包被有蛋白a、蛋白g和蛋白l的磁珠，通过(1)交联真核细胞悬浮液的真核细胞中的蛋白质与染色质形成交联的蛋白质染色质复合物；(2)裂解真核细胞从而释放交联的蛋白质染色质复合物；(3)剪切交联的蛋白质染色质复合物；(4)加入上述磁珠，并加入期望的dna结合蛋白的抗体，进行孵育；(5)洗涤磁珠；(6)洗脱磁珠吸附的部分的交联的蛋白质染色质复合物；(7)解交联部分的交联的蛋白质染色质复合物；(8)提取纯化dna，获得的dna能很好的控制在100-500bp之间，浓度明显比同类产品良好，能够提高10％(m/v)左右，因此，其设计巧妙，使用该试剂盒操作简便快捷，该试剂盒的生产成本低，适于大规模推广应用。

本发明的这些和其它目的、特点和优势，通过下述的详细说明、附图和权利要求得以充分体现，并可通过所附权利要求中特地指出的手段、装置和它们的组合得以实现。

附图说明

图1是采用本发明的真核细胞中dna结合蛋白的染色体免疫共沉淀方法获得的dna的电泳示意图，其中泳道1为dnamarker(dl5000marker，从上而下依次为5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp以及100bp)，泳道2为实施例1获得的dna，泳道3为实施例2获得的dna，泳道4为实施例3获得的dna，泳道5为对比例1获得的dna，泳道6为对比例2获得的dna，泳道7为对比例3获得的dna。

具体实施方式

本发明人经过对真核细胞中dna结合蛋白的染色体免疫共沉淀方法进行深入的研究，通过涵盖多种结合蛋白以及优化提取体系，提出一种真核细胞中dna结合蛋白的染色体免疫共沉淀方法，包括以下步骤：

(1)交联真核细胞悬浮液的真核细胞中的蛋白质与染色质形成交联的蛋白质染色质复合物；

(2)裂解所述真核细胞从而释放所述的交联的蛋白质染色质复合物；

(3)剪切所述的交联的蛋白质染色质复合物；

(4)加入包被有蛋白a的磁珠、包被有蛋白g的磁珠和包被有蛋白l的磁珠或者加入包被有蛋白a、蛋白g和蛋白l的磁珠，并加入期望的dna结合蛋白的抗体，进行孵育；

(5)洗涤所述磁珠；

(6)洗脱所述磁珠吸附的部分所述的交联的蛋白质染色质复合物；

(7)解交联该部分所述的交联的蛋白质染色质复合物；

(8)提取纯化dna。

所述真核细胞悬浮液可以通过任何合适的方法获得，例如，取真核生物的组织或细胞，用pbs(137mmnacl；2.7mmkcl；10mmna2hpo4·12h2o；2mmkh2po4；0.1％重量pmsf)吹打洗涤分散，获得细胞悬浮液。

在所述步骤(1)中，可以采用任何合适的方式对真核细胞中的蛋白质与染色质进行交联，较佳地，采用甲醛进行所述交联，所述甲醛的终浓度为0.1％(v/v)～5％(v/v)，真核细胞建议1％(v/v)甲醛，所述交联的时间为5分钟～20分钟。例如，在990ml真核细胞悬浮液中可以加入10ml甲醛，甲醛终浓度为1％(v/v)，进行交联，可以用甘氨酸中和交联作用，例如上述1000ml交联溶液中可以加入1毫升2m甘氨酸中和交联作用；交联结束，离心弃上清，为了去除细胞上粘附的甲醛、甘氨酸等物质，pbs洗涤，再离心弃上清。

在所述步骤(2)中，可以采用任何合适的方式对所述真核细胞进行裂解，较佳地，采用1％sds裂解液进行所述裂解，所述1％sds裂解液包括：1％重量sds、10mmedta、50mmph8.0的tris-hcl和1mmpmsf，所述真核细胞的数量为5×10⁷个～15×10⁷个，所述1％sds裂解液的加入量为500ul，所述裂解在冰浴下进行，所述裂解的时间为8分钟～15分钟。

在所述步骤(3)中，可以采用任何合适的方式对所述的交联的蛋白质染色质复合物进行剪切，较佳地，采用超声方法进行所述剪切，所述超声方法为：开启超声20秒～40秒和停止超声30秒～60秒为一个循环，进行8个～15个所述循环，所述超声的频率为20khz～60khz。超声结束，为了去除杂质，可以离心取上清，弃沉淀。

在所述步骤(4)中，所述磁珠可以是任何合适的磁珠，例如磁力珠或琼脂糖珠，较佳地，所述磁珠是琼脂糖珠。

在所述步骤(4)中，所述磁珠可以不经过预处理，直接使用，但是为了获得更佳的提取效果，较佳地，所述磁珠是经过预处理的磁珠，所述预处理是采用第一清洗液洗涤所述磁珠1小时～2小时，所述第一清洗液包括0.01％sds裂解液、1.2mmedta、16.7mmph8.0的tris-hcl、167mmnacl、1mmpmsf、1.1％(v/v)tritonx-100，所述0.01％sds裂解液包括：0.01％重量sds、0.1mmedta、0.5mmph8.0的tris-hcl和0.01mmpmsf。

在所述步骤(4)中，所述孵育的条件可以通过试验确定，较佳地，对于每毫升所述的交联的蛋白质染色质复合物，所述磁珠的加入量为15μl～50μl，所述孵育为旋转孵育，所述旋转孵育的转速为10循环/分钟～20循环/分钟，所述孵育在4℃～8℃过夜进行。

在所述步骤(4)中，所述的期望的dna结合蛋白可以根据所要研究的dna结合蛋白确定，较佳地，所述的期望的dna结合蛋白是组蛋白或转录因子。

在所述步骤(4)中，所述抗体的加入量可以根据估算确定，通常加入远多于可能结合抗原需要的用量，较佳地，对于每毫升所述的交联的蛋白质染色质复合物，所述抗体的加入量为2μg～6μg。

在所述步骤(5)中，可以采用任何合适的洗涤方法进行洗涤，较佳地，分别用第一洗涤液、第二洗涤液、第三洗涤液、第四洗涤液和第二清洗液在冰上磁吸附条件下颠倒旋转孵育进行所述洗涤，所述颠倒旋转孵育的转速为10循环/分钟～20循环/分钟，所述第一洗涤液、所述第二洗涤液、所述第三洗涤液、所述第四洗涤液和所述第二清洗液的用量为1ml，所述洗涤的时间为3分钟～8分钟，其中，

所述第一洗涤液包括：10mmph8.0的tris-hcl、150mmnacl、1％(v/v)tritonx-100、2mmedta、0.1％sds裂解液；

所述第二洗涤液包括：20mmph8.0的tris-hcl、500mmnacl、1％(v/v)tritonx-100、2mmedta、0.1％sds裂解液；

所述0.1％sds裂解液包括：0.1％重量sds、1mmedta、5mmph8.0的tris-hcl和0.1mmpmsf；

所述第三洗涤液包括：10mmph8.0的tris-hcl、250mmlicl、1％np-40、1％(m/v)脱氧胆酸钠、1mmedta；

所述第四洗涤液包括：10mmph7.5的tris-hcl、1mmedta；

所述第二清洗液包括：137mmol/lnacl，2.7mmol/lkcl，10mmol/lna2hpo4，2mmol/lkh2po4，ph7.2～7.4。

在所述步骤(6)中，可以采用任何合适的洗脱方法进行洗脱，较佳地，采用洗脱液在冰上磁吸附条件下60℃～70℃旋转孵育进行所述洗脱，所述旋转孵育的转速为10循环/分钟～20循环/分钟，所述洗脱液包括：1％sds裂解液、100mmnahco3、1mmpmsf；所述洗脱液的加入量为250微升～300微升，所述洗脱的时间为10分钟～30分钟，所述1％sds裂解液包括：1％重量sds、10mmedta、50mmph8.0的tris-hcl和1mmpmsf。

在所述步骤(7)中，可以采用任何合适的解交联方法进行解交联，较佳地，采用5m氯化钠在冰上磁吸附条件下58℃-68℃过夜进行所述解交联，所述5m氯化钠的加入量为25微升～30微升。

在所述步骤(8)中，可以采用任何合适的dna提取纯化方法进行提取纯化dna，较佳地，采用酚氯仿抽提所述dna，采用糖原纯化所述dna，采用超纯水溶解所述dna。此外，也可以采用离心柱纯化。

本发明还提供了一种真核细胞中dna结合蛋白的染色体免疫共沉淀试剂盒，包括包被有蛋白a的磁珠、包被有蛋白g的磁珠和包被有蛋白l的磁珠，或者包括包被有蛋白a、蛋白g和蛋白l的磁珠。

所述的真核细胞中dna结合蛋白的染色体免疫共沉淀试剂盒还可以包括其它任何合适的试剂，较佳地，所述的真核细胞中dna结合蛋白的染色体免疫共沉淀试剂盒还包括甲醛。

所述的真核细胞中dna结合蛋白的染色体免疫共沉淀试剂盒还可以包括其它任何合适的试剂，较佳地，所述的真核细胞中dna结合蛋白的染色体免疫共沉淀试剂盒还包括1％sds裂解液，所述1％sds裂解液包括：1％重量sds、10mmedta、50mmph8.0的tris-hcl和1mmpmsf。

所述的真核细胞中dna结合蛋白的染色体免疫共沉淀试剂盒还可以包括其它任何合适的试剂，较佳地，所述的真核细胞中dna结合蛋白的染色体免疫共沉淀试剂盒还包括第一洗涤液、第二洗涤液、第三洗涤液、第四洗涤液和第二清洗液，其中，

所述第一洗涤液包括：10mmph8.0的tris-hcl、150mmnacl、1％(v/v)tritonx-100、2mmedta、0.1％sds裂解液；

所述第二洗涤液包括：20mmph8.0的tris-hcl、500mmnacl、1％(v/v)tritonx-100、2mmedta、0.1％sds裂解液；

所述0.1％sds裂解液包括：0.1％重量sds、1mmedta、5mmph8.0的tris-hcl和0.1mmpmsf；

所述第三洗涤液包括：10mmph8.0的tris-hcl、250mmlicl、1％np-40、1％(m/v)脱氧胆酸钠、1mmedta；

所述第四洗涤液包括：10mmph7.5的tris-hcl、1mmedta；

所述第二清洗液包括：137mmol/lnacl，2.7mmol/lkcl，10mmol/lna2hpo4，2mmol/lkh2po4，ph7.2～7.4。

所述的真核细胞中dna结合蛋白的染色体免疫共沉淀试剂盒还可以包括其它任何合适的试剂，较佳地，所述的真核细胞中dna结合蛋白的染色体免疫共沉淀试剂盒还包括洗脱液，所述洗脱液包括：1％sds裂解液、100mmnahco3、1mmpmsf，所述1％sds裂解液包括：1％重量sds、10mmedta、50mmph8.0的tris-hcl和1mmpmsf。

所述的真核细胞中dna结合蛋白的染色体免疫共沉淀试剂盒还可以包括其它任何合适的试剂，较佳地，所述的真核细胞中dna结合蛋白的染色体免疫共沉淀试剂盒还包括氯化钠。

所述的真核细胞中dna结合蛋白的染色体免疫共沉淀试剂盒还可以包括其它任何合适的试剂，较佳地，所述的真核细胞中dna结合蛋白的染色体免疫共沉淀试剂盒还包括糖原。

所述的真核细胞中dna结合蛋白的染色体免疫共沉淀试剂盒还可以包括其它任何合适的试剂，较佳地，所述的真核细胞中dna结合蛋白的染色体免疫共沉淀试剂盒还包括甘氨酸、蛋白酶k和rna酶a中的至少一种。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。为有效避免其他未知因素影响，本发明的实施例所用试剂全部采用分子级。

包被蛋白a、蛋白g和蛋白l的琼脂糖珠(proteina/g/l，上海普欣生物科技有限公司，cat#1006)

1％sds裂解液包括：1％重量sds、10mmedta、50mmph8.0的tris-hcl和1mmpmsf；

蛋白酶抑制剂pmsf(sigma；78830)；

第一洗涤液包括：10mmph8.0的tris-hcl、150mmnacl、1％(v/v)tritonx-100、2mmedta、0.1％sds裂解液；

第二洗涤液包括：20mmph8.0的tris-hcl、500mmnacl、1％(v/v)tritonx-100、2mmedta、0.1％sds裂解液；

0.1％sds裂解液包括：0.1％重量sds、1mmedta、5mmph8.0的tris-hcl和0.1mmpmsf；

第三洗涤液包括：10mmph8.0的tris-hcl、250mmlicl、1％np-40(乙基苯基聚乙二醇)(solarbio,cas:9016-45-9)、1％(m/v)脱氧胆酸钠(solarbio,cas:302-95-4)、1mmedta；

第四洗涤液包括：10mmph7.5的tris-hcl、1mmedta；

第二清洗液包括：137mmol/lnacl，2.7mmol/lkcl，10mmol/lna2hpo4，2mmol/lkh2po4，ph7.2～7.4；

洗脱液包括：1％sds裂解液、100mmnahco3、1mmpmsf。

实施例1

1、取8只小鼠的神经脑组织，共10克，用pbs(137mmnacl；2.7mmkcl；10mmna2hpo4·12h2o；2mmkh2po4；0.1％重量pmsf)吹打洗涤分散成990ml细胞悬浮液。

2、加入10ml甲醛至终浓度1％(v/v)，5分钟后加入1毫升2m甘氨酸中和交联作用，离心弃上清，pbs洗涤，离心弃上清，真核细胞的数量约为10⁸个。

3、加入500μl1％sds裂解液冰上放置10分钟。

4、超声破碎细胞，超声程序如下：开30s，关30s，超声循环9个，超声频率为60khz。超声结束，离心取上清，弃沉淀。

5、对包被蛋白a、蛋白g和蛋白l的琼脂糖珠进行预处理(采用第一清洗液洗涤琼脂糖珠2小时，第一清洗液包括0.01％sds裂解液、1.2mmedta、16.7mmph8.0的tris-hcl、167mmnacl、1mmpmsf、1.1％(v/v)tritonx-100，0.01％sds裂解液包括：0.01％重量sds、0.1mmedta、0.5mmph8.0的tris-hcl和0.01mmpmsf，然后每毫升交联的蛋白质染色质复合物加入30ul的琼脂糖珠，加入2μg的抗体(millpore，rnapolymeraseii，cat#17-620)，在旋转仪上以10循环/分钟的速度4℃旋转孵育过夜。

6、依次用1ml的第一洗涤液、第二洗涤液、第三洗涤液、第四洗涤液和第二清洗液，冰上磁吸附，在旋转仪上以10循环/分钟的速度颠倒旋转孵育洗涤4分钟。

7、加入300微升洗脱液，在旋转仪上以10循环/分钟的速度65℃旋转孵育15min。

8、冰上磁吸附重复一次，加入30μl5m氯化钠，65℃过夜解交联。

9、加入1mtris，0.5medta，rnaasea，37℃30分钟，2μl蛋白酶k，42℃1h。

10、酚氯仿抽提dna，糖原纯化dna，加入31μl超纯水溶解dna。

实施例2

1、取2只小鼠的肝脏组织，共10克，用pbs(137mmnacl；2.7mmkcl；10mmna2hpo4·12h2o；2mmkh2po4；0.1％重量pmsf吹打洗涤分散成999ml细胞悬浮液。

2、加入1ml甲醛至终浓度0.1％(v/v)，10分钟后加入1毫升2m甘氨酸中和交联作用，离心弃上清，pbs洗涤，离心弃上清，真核细胞的数量约为5×10⁷个。

3、加入500μl1％sds裂解液冰上放置15分钟。

4、超声破碎细胞，超声程序如下：开20s，关45s，超声循环8个，超声频率为40khz。超声结束，离心取上清，弃沉淀。

5、对包被蛋白a、蛋白g和蛋白l的琼脂糖珠进行预处理(采用第一清洗液洗涤琼脂糖珠1小时，第一清洗液包括0.01％sds裂解液、1.2mmedta、16.7mmph8.0的tris-hcl、167mmnacl、1mmpmsf、1.1％(v/v)tritonx-100，所述0.01％sds裂解液包括：0.01％重量sds、0.1mmedta、0.5mmph8.0的tris-hcl和0.01mmpmsf，然后每毫升交联的蛋白质染色质复合物加入50ul的琼脂糖珠，加入4μg的抗体(millpore，rnapolymeraseii，cat#17-620)，在旋转仪上以15循环/分钟的速度6℃旋转孵育过夜。

6、依次用1ml的第一洗涤液、第二洗涤液、第三洗涤液、第四洗涤液和第二清洗液，冰上磁吸附，在旋转仪上以15循环/分钟的速度颠倒旋转孵育洗涤3分钟。

7、加入280微升洗脱液，在旋转仪上以15循环/分钟的速度70℃旋转孵育10min。

8、冰上磁吸附重复一次，加入25μl5m氯化钠，68℃过夜解交联。

9、加入1mtris，0.5medta，rnaasea,37℃30分钟，2μl蛋白酶k，42℃1h。

10、酚氯仿抽提dna，糖原纯化dna，加入31μl超纯水溶解dna。

实施例3

1、取30只小鼠的脾脏组织，共10克)，用pbs(137mmnacl；2.7mmkcl；10mmna2hpo4·12h2o；2mmkh2po4；0.1％重量pmsf)吹打洗涤分散成950ml细胞悬浮液。

2、加入50ml甲醛至终浓度5％(v/v)，20分钟后加入1毫升2m甘氨酸中和交联作用，离心弃上清，pbs洗涤，离心弃上清，真核细胞的数量约为15×10⁷个。

3、加入500μl1％sds裂解液冰上放置8分钟。

4、超声破碎细胞，超声程序如下：开40s，关60s，超声循环15个，超声频率为20khz。超声结束，离心取上清，弃沉淀。

5、对包被蛋白a、蛋白g和蛋白l的琼脂糖珠进行预处理(采用第一清洗液洗涤琼脂糖珠1.5小时，第一清洗液包括0.01％sds裂解液、1.2mmedta、16.7mmph8.0的tris-hcl、167mmnacl、1mmpmsf、1.1％(v/v)tritonx-100，所述0.01％sds裂解液包括：0.01％重量sds、0.1mmedta、0.5mmph8.0的tris-hcl和0.01mmpmsf，然后每毫升交联的蛋白质染色质复合物加入15ul的琼脂糖珠，加入6μg的抗体(millpore，rnapolymeraseii，cat#17-620)，在旋转仪上以20循环/分钟的速度8℃旋转孵育过夜。

6、依次用1ml的第一洗涤液、第二洗涤液、第三洗涤液、第四洗涤液和第二清洗液，冰上磁吸附，在旋转仪上以20循环/分钟的速度颠倒旋转孵育洗涤8分钟。

7、加入250微升洗脱液，在旋转仪上以20循环/分钟的速度60℃旋转孵育30min。

8、冰上磁吸附重复一次，加入28μl5m氯化钠，58℃过夜解交联。

9、加入1mtris，0.5medta，rnaasea,37℃30分钟，2μl蛋白酶k，42℃1h。

10、酚氯仿抽提dna，糖原纯化dna，加入31μl超纯水溶解dna。

对比例1

采用与实施例1基本相同的步骤，不同之处在于：在步骤5中采用包被蛋白a和蛋白g的琼脂糖珠(美国，millipore#17-295)替换包被蛋白a、蛋白g和蛋白l的琼脂糖珠。

对比例2

采用与实施例2基本相同的步骤，不同之处在于：在步骤5中采用包被蛋白a和蛋白g的琼脂糖珠(美国，millipore#17-295)替换包被蛋白a、蛋白g和蛋白l的琼脂糖珠。

对比例3

采用与实施例3基本相同的步骤，不同之处在于：在步骤5中采用包被蛋白a和蛋白g的琼脂糖珠(美国，millipore#17-295)替换包被蛋白a、蛋白g和蛋白l的琼脂糖珠。

实施例4

将实施例1-3和对比例1-3获得的dna样品，各取1微升进行0.8％(m/v)琼脂糖凝胶电泳，结果请见图1，可以明显看出，使用本发明的真核细胞中dna结合蛋白的染色体免疫共沉淀方法获得的dna片段能很好的控制在100-500bp之间，dna浓度测定使用nanodrop微量分光光度计，dna浓度明显比同类产品良好，实施例1-3相比对比例1-3分别提高10％(m/v)左右。究其原因，可能在于常规的纯化介质是以基因工程方法重组的proteina/g包含proteina的5个免疫球蛋白结合区域和proteing的2个结合区域，结合能力较单一的proteina和proteing有很大提高。更强的fc段结合能力使之成为免疫球蛋白纯化更受青睐的工具。proteina/g结合人的所有igg亚型和iga、ige、igm及少量的igd。proteinl包含5个kappa结合区域，可在不影响抗原结合的情况下与免疫球蛋白κ轻链结合，相较于其它抗体结合蛋白，proteinl具有更广的ig和ig亚型结合范围。proteina/g/l包含proteinl的5个抗体结合区域，proteina的5个抗体结合区域和proteing的2个抗体结合区域。可结合人所有igg亚型和iga、ige、igm及igd。

因此，本发明提供了一种优质高效的真核细胞中dna结合蛋白的染色体免疫共沉淀方法及其试剂盒，其具有高结合力，低脱落率的优点，同时大幅降低试剂成本。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1)本发明的试剂盒采用可以优化抗体相互作用的蛋白珠，能有效避免非特异性结合；

2)本发明的试剂盒使用含有强活性剂的缓冲液(洗涤液)，避免了用弱界面活性剂溶解细胞不能充分溶解细胞蛋白的缺陷；

3)为防止蛋白的分解等因素，本发明的试剂盒的缓冲液均添加蛋白酶抑制剂，只需低温下进行实验即可；

4)本发明的试剂盒涵盖了多种结合蛋白，而且，优化的体系可以更好的获得目的dna；具体而言，本发明优化了染色体免疫共沉淀条件，针对真核细胞中的转录因子进行染色体免疫共沉淀具有良好的作用，使用本试剂盒获得的dna片段能很好的控制在100-500bp之间，dna浓度明显比同类产品良好，三批次分别提高10％(m/v)左右；

5)通过本发明的试剂盒的优化条件可以显著降低提取工艺的成本；此外，通过将本产品实业化可有效降低目前市场上的试剂盒价格；

6)本发明的染色体免疫共沉淀试剂盒能够在高通量水平上更加精准定位转录因子或组蛋白以及其它能与dna结合的修饰位点，提高了科研和临床样本的检测效果；有利于表观学研究和临床生物医药的开发和结果检测。

综上，本发明的真核细胞中dna结合蛋白的染色体免疫共沉淀方法和试剂盒能大量富集目的dna，片段能很好的控制在100-500bp之间，有利于提高科研和临床样本的检测效果，有利于表观学研究和临床生物医药的开发和结果检测，设计巧妙，操作简便快捷，成本低，适于大规模推广应用。

由此可见，本发明的目的已经完整并有效的予以实现。本发明的功能及结构原理已在实施例中予以展示和说明，在不背离所述原理下，实施方式可作任意修改。所以，本发明包括了基于权利要求精神及权利要求范围的所有变形实施方式。