一种赤霉素类似物及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物化学领域，特别是指一种赤霉素类似物及其制备方法和应用。

背景技术：

赤霉素（gibberellins,gas）作为植物体内广泛存在的一类植物激素，能够作用于高等植物的整个生命周期，例如促进种子的萌发、茎的伸长、花的诱导和种子的成熟等，而且植物也可通过调节内源性赤霉素生物合成而介导其自身对环境因子的应答。因此，赤霉素生物合成的调控对植物的发育及其对环境的适应有着极为重要的作用。截至目前，已发现的赤霉素高达136种之多。更为重要的是，在过去的十年中，人们并没有发现新的赤霉素或者新赤霉素合成途径和制备方法。目前的研究表明，只有其中少数ga具有生物活性，例如ga1、ga3、ga4、ga7，它们在结构上有一些共同点，例如拥有c-3β位的羟基、c-6位的羧基以及在c-4和c-10之间的内酯(yamaguchi,2008)。如果3β位的羟基被c-2和c-3位的其他功能集团所取代就会形成具有生物活性的中间代谢产物ga5或者ga6。其他生物形态的ga只是在赤霉素的合成过程中起着中间产物的作用，其本身并没有生物学功能。目前所有已知的赤霉素均属于双萜类化合物，具有类似的化学结构，都含有赤霉素烷骨架（即含有4个环），由于双键、羟基数目和位置不同，而形成各种赤霉素，部分常见的赤霉素结构如式所示。

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技术实现要素：

本发明研究发现了一种赤霉素类似物及其制备方法和应用，为发现新的赤霉素类植物激素和活性研究提供基础。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种赤霉素类似物，所述赤霉素类似物命名为ga12-x，其分子式为c20h30o5，分子量为350.21，化学结构为：

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所述的赤霉素类似物的制备方法，以赤霉素为母体，以磷酸为催化剂，在70-75℃水浴条件下反应6-8h，即得ga12-x；

化学反应为：。

所述的赤霉素类似物的制备方法，步骤如下：

（1）将ga12溶解于甲醇溶液中，配制一定浓度的ga12标准溶液；

（2）向ga12标准溶液中加入3.5ml去离子水和0.5ml磷酸溶液，得混合溶液；

（3）将步骤（2）中的混合溶液置于70-75℃水浴中，磁力搅拌反应6-8小时，完成ga12-x的制备。

所述步骤（1）中ga12标准溶液的浓度为1-3mg/ml。

所述步骤（2）中磷酸溶液的浓度为0.5-1mol/l。

所述步骤（3）中磁力搅拌的转速为500-800rpm。

所述的赤霉素类似物作为植物激素和研究植物激素活性的应用。

本技术方案能产生的有益效果：

本发明所制备的化合物的分子式为c20h30o5，其原料（即母体）的分子式为c20h28o4，两者相差h2o，这也可以从其质谱图的分子量得到印证，ga12和ga12-x在负离子模式下其m/z分别为331.3和349.3，二者相差18，与h2o的分子量相吻合。在结合ga12在204nm处有紫外吸收，而ga12-x在该波长处无紫外吸收，可能是由于ga12分子中含有的双键消失引起的。综合以上分析，我们推断出ga12-x的分子结构为，在已经发现的136种赤霉素类植物激素中未见该结构，发明人还通过scifinder数据库查询，也未发现该结构，由此可见，该化合物为一种新的化合物。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为制备ga12-x的反应机理图。

图2为实施例1反应产物的lc-esi-ms谱图。

图3为实施例1中6号样品的lc-esi-ms谱图。

图4为实施例1制备的ga12-x样品的高分辨质谱分析图。

图5为实施例1制备的ga12-x样品的高分辨质谱离子碎片图。

图6、7为实施例1制备的ga12-x样品的核磁数据图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

将一定量的ga12标准品溶解到甲醇（色谱纯）溶液中，配置成浓度为1mg/ml的ga12标准溶液，放置于4℃冰箱中待用。将色谱纯的磷酸配置成浓度为1mol/l的磷酸溶液待用。分别将2.0ml去离子水和0.5ml浓度为0.5mol/l的磷酸溶液添加到1mlga12标准溶液中，将最终制好的溶液放置于70℃水浴中，在转速为500rpm磁力搅拌下反应6小时即可得到新化合物ga12-x。

实施例2

将一定量的ga12标准品溶解到甲醇（色谱纯）溶液中，配置成浓度为3mg/ml的ga12标准溶液，放置于6℃冰箱中待用。将色谱纯的磷酸配置成浓度为1mol/l的磷酸溶液待用。分别将3.5ml去离子水和1ml浓度为1mol/l的磷酸溶液添加到3mlga12标准溶液中，将最终制好的溶液放置于75℃水浴中，在转速为800rpm磁力搅拌下反应8小时即可得到新化合物ga12-x。

实施例3

将一定量的ga12标准品溶解到甲醇（色谱纯）溶液中，配置成浓度为2mg/ml的ga12标准溶液，放置于5℃冰箱中待用。将色谱纯的磷酸配置成浓度为0.8mol/l的磷酸溶液待用。分别将2.8ml去离子水和0.8ml浓度为1mol/l的磷酸溶液添加到2mlga12标准溶液中，将最终制好的溶液放置于73℃水浴中，在转速为750rpm磁力搅拌下反应7小时即可得到新化合物ga12-x。

实施例4

将一定量的ga12标准品溶解到甲醇（色谱纯）溶液中，配置成浓度为1mg/ml的ga12标准溶液，放置于6℃冰箱中待用。将色谱纯的磷酸配置成浓度为0.9mol/l的磷酸溶液待用。分别将3ml去离子水和0.9ml浓度为0.7mol/l的磷酸溶液添加到2.5mlga12标准溶液中，将最终制好的溶液放置于70℃水浴中，在转速为700rpm磁力搅拌下反应6小时即可得到新化合物ga12-x。

应用例

一、实施例1制备产物的lc-esi-ms分析

通过高效液相色谱-电喷雾电离质谱（lc-esi-ms）方法对制备的产物进行分析，所采用的分析色谱及质谱主要参数如下所示：

1.色谱柱：zorbaxeclipsexdb-c18，2.1×150mm，3.5µm

2.流动相：80%甲醇/20%水

3.流速：0.2ml/min

4.进样量：10µl

5.电喷雾电离源（esi）负离子模式

6.毛细管电压：3.5kv

7.雾化气温度：500℃

在上述实验条件下，所得到的色谱-质谱图如图2所示,保留时间4.85min和15.18min所对应峰的质荷比分别为349.3和331.3,通过与ga12标准样品的图谱进行比对，保留时间为15.18min为ga12的样品峰,其主要产物的质荷比为349.3，因为是在负离子模式下进行的测定，所以该反应的主要产物的分子量为350，相对于ga12母体的分子量增加了18。

二、通过制备色谱对实施例1制备的ga12-x进行纯化

以ga12为原料，以磷酸为催化剂，通过加成的方式制备新的化合物ga12-x，ga12很难100%反应完全。因此，在反应产物中除了产物之外，还可能有原料（ga12）及副产物，需要进一步对其进行纯化，本研究通过制备色谱对上述反应液进行纯化，色谱条件如下：

1.色谱柱：zorbaxeclipsexdb-c18,9.4×250mm,5µm

2.流动相：80%甲醇/20%水

3.流速：3ml/min

4.进样量：0.5ml

对制备液相色谱流出物进行分段收集，其收集程序如下：前2.0min之前不进行收集，以此对2.0-3.0min，3.0-4.0min，4.0-5.0min，5.0-6.0min，6.0-7.0min，7.0-8.0min，8.0-9.0min，9.0-10.0min，10-11min，11-12min进行收集，并分别编号为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10号样品。并通过前面所建立的lc-esi-ms对所不同时间段所收集的样品进行检测，试验结果表明，质荷比为349.3的产物在6号样品中，其lc-esi-ms谱图如图3所示。从图中我们不难看出，所收集的样品仅含有质荷比为349.3的一个样品。

三、ga12和ga12-x的hplc-dad和lc-esi-ms分析

在相同实验条件下，采用高效液相色谱紫外（hplc-dad）及液相色谱质谱（lc-esi-ms）联用技术分别对ga12和ga12-x进行分析，实验结果表明，在以上两种分析方法中，均能观察到ga12的样品峰（m/z,331.3）。ga12-x仅能在lc-esi-ms中观察到响应的峰（m/z,349.3），在hplc-dad中ga-12x观察不到相应的色谱峰（结果如图4所示）。

四、ga12-x的高分辨质谱分析及结构预测

对所制备的ga12-x的样品进行了高分辨质谱离子碎片分析（如图5所示）。通过专业生物信息学软件，我们得出化合物的分子式为c20h30o5，其原料（即母体）的分子式为c20h28o4，两者相差h2o，这也可以从其质谱图的分子量得到印证（见图2），ga12和ga12-x在负离子模式下其m/z分别为331.3和349.3，二者相差18，与h2o的分子量相吻合。在结合ga12在204nm处有紫外吸收，而ga12-x在该波长处无紫外吸收，可能是由于ga12分子中含有的双键消失引起的。

五、ga12-x的结构解析

对所制备的ga12-x的样品进行了核磁分析（实验结果如图6、7所示）。通过质谱引导的分析半制备质谱对ga12-x进行了分离和富集，并利用850mhz核磁对ga12-x进行了数据分析。通过一维核磁和二维核磁分析，我们对ga12-x的结果进行了确认，结构为。在已经发现的136种赤霉素类植物激素中未见该结构，我们还通过scifinder数据库查询，也未发现该结构，由此可见，该化合物为一种新的化合物。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。