本发明提供一种排硫硫杆菌的细胞固定化方法，涉及生物化工领域。
背景技术：
排硫硫杆菌(thiobacillusthioparus)，革兰氏阴性菌，细短杆菌，严格自养，靠氧化硫代硫酸盐成硫酸盐取得能量，氮源为硝酸盐和铵盐。发现于泥土壤、运河水和其他淡水来源。目前国内对于脱硫杆菌的研究主要针对于排硫硫杆菌对于环境保护、生物脱硫等领域的研究，因此，对排硫硫杆菌进行细胞固定化，提高其效率和稳定性，实现在更多领域的应用，具有重要意义。
固定化技术是用化学或物理的手段和方法，将游离的细胞或者酶定位至某一特定空间范围内，保留其固有的催化活性，且能够被重复和连续使用的现代生物工程技术。固定化技术克服了生物细胞太小，与水溶液分离较难，易造成随水流失的缺点，并且具有活性高、效率高、耐受性好、抗冲击负荷能力强、稳定性强和保持高效菌种的优点。
微生物的固定化方法主要有：吸附法、共价结合法、包埋法和交联法，其中以包埋法最为常用。包埋法是将生物体截留在水不溶性的多孔隙的网格结构中，通过材料结构和性质的改变使细胞截留。该方法操作简单，固定性好，是目前最常用的固定化方法；但在使用过程中存在机械强度较低、稳定性差等问题，其应用受到一定限制。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种排硫硫杆菌的细胞固定化方法，具有操作程序简单，成本低廉，稳定性高等特点。
本发明技术方案如下：一种排硫硫杆菌的细胞固定化方法，具体包括以下步骤：
(1)将排硫硫杆菌于培养基中在温度28～30℃，转速160～180rpm/min条件下培养48～72h，制备菌体浓度为5～10g/l的菌悬浮液；
(2)在所得菌悬液中加入固定化载体卡拉胶及交联剂，混合均匀后得到混合液；
(3)将步骤(2)中所得到的混合液加入氯化钙溶液中，充分混合后于15～20℃下静置，硬化10～24h，经过滤洗涤后，得到固定化细胞。
优选步骤(1)中排硫硫杆菌，拉丁学名为thiobacillusthioparus，参据的微生物：njyh5327，保藏中心登记入册编号是cgmccno.12756，保藏日期2016年7月11日。
优选步骤(1)中培养基成分为：nh4cl0.4～0.6g/l，mgso40.7～0.9g/l，k2hpo44～6g/l，kh2po44～6g/l，na2s2o39～12g/l，ph6.5～7；最终制得的菌悬液中菌体浓度为5～10g/l。
优选步骤(2)中所述的交联剂为聚乙烯亚胺，其质量浓度为3～7％；步骤(2)中加入的固定化载体卡拉胶在混合液中的质量百分比为3～5％；交联剂于混合液中的体积比为3～4％。
优选步骤(3)中氯化钙溶液的质量百分比浓度为2～7％；混合液与氯化钙溶液按体积比1︰1～3.5加入。
本专利选用的菌株，其分类命名为脱硫硫杆菌(thiobacillusthioparus)，参据的微生物(株)为：njyh5327，该菌株是本课题组自主筛选并包藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)。其简称为cgmcc，登记入册编号cgmccno.12756，保藏日期2016年7月11日。
cgmccno.12756菌株具有以下性质：
1、培养特征：
在固体lb培养基上培养，呈白色或淡黄色、微透明小圆点状，有光泽，边缘光滑整齐。
2、菌体形态特征：
在固体lb培养基上呈白色或淡黄色球形或椭圆型，直径0.5～1.7微米，单细胞外通常有一层荚膜。以极生鞭毛运动。
3、生理生化性质：
表1cgmccno.12756菌株生理生化性质
+：为可利用；-：为不可利用。
有益效果：
本发明在采用包埋法对菌株进行固定化的过程中，通过加入聚乙烯亚胺作为交联剂增强了固定化体系的稳定性，同时固定化效率和效果都得到提高；此外，通过加入氯化钙，加强了固定化细胞颗粒的机械强度，减少菌体损失，防止颗粒的软化；本发明所提供的固定化方法具有操作程序简单，成本低廉，稳定性高等特点。
保藏信息
上述脱硫硫杆菌thiobacillusthioparuscgmccno.12756，是由本实验室选育并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，其简称为cgmcc，登记入册的编号是cgmccno.12756，保藏日期2016年7月11日。
具体实施方式
以下结合实例来进一步解释本发明，但实施案例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1
将排硫硫杆菌cgmccno.12756于培养基(成分为：nh4cl0.4g/l，mgso40.7g/l，k2hpo44g/l，kh2po44g/l，na2s2o39g/l，ph6.5)，温度28℃，转速160rpm/min下培养48h后，制备菌体浓度为5g/l的菌悬液；然后加入一定量载体卡拉胶，使得加入后卡拉胶在混合液中的质量百分比为3％，同时按混合液与聚乙烯亚胺溶液的体积比3％加入质量浓度3％的交联剂聚乙烯亚胺，混合均匀后得到混合液；将所得混合液加入质量百分比浓度为7％的氯化钙溶液，其中混合液与氯化钙溶液按体积比1︰1，充分混合于20℃下静置，硬化24h，经过滤洗涤后，得到固定化细胞。取1g所得的固定化细胞，加入10ml5mol/lna2s的溶液中，于28℃、ph7.0下反应40h，取1ml反应液测定酶活；定义一个酶活单位为：在上述条件下，每小时催化na2s生成1μmol单质硫所需的酶量。
经测定，固定化后细胞活性相对游离细胞的活性为82.7％。
实施例2
将排硫硫杆菌cgmccno.12756于培养基(成分为：nh4cl0.5g/l，mgso40.8g/l，k2hpo45g/l，kh2po45g/l，na2s2o310g/l，ph6.8)温度29℃，转速170rpm/min下培养60h后，制备菌体浓度为8g/l的菌悬液；然后加入一定量载体卡拉胶，使得加入后卡拉胶在混合液中的质量百分比为4％，同时按混合液与聚乙烯亚胺溶液的体积比3.5％加入质量浓度5％的交联剂聚乙烯亚胺，混合均匀后得到混合液；将所得混合液加入质量百分比浓度为5％的氯化钙溶液，其中混合液与氯化钙溶液按体积比1︰2，充分混合于18℃下静置，硬化20h，经过滤洗涤后，得到固定化细胞。取1g所得的固定化细胞，加入10ml5mol/lna2s的溶液中，于28℃、ph7.0下反应40h，取1ml反应液测定酶活；定义一个酶活单位为：在上述条件下，每小时催化na2s生成1μmol单质硫所需的酶量。
经测定，固定化后细胞活性相对游离细胞的活性为89.6％。
实施例3
将排硫硫杆菌cgmccno.12756于培养基(成分为：nh4cl0.6g/l，mgso40.9g/l，k2hpo46g/l，kh2po46g/l，na2s2o312g/l，ph7)温度30℃，转速180rpm/min下培养72h后，制备菌体浓度为10g/l的菌悬液；然后加入一定量载体卡拉胶，使得加入后卡拉胶在混合液中的质量百分比为5％，同时按混合液与聚乙烯亚胺溶液的体积比4％加入质量浓度7％的交联剂聚乙烯亚胺，混合均匀后得到混合液；将所得混合液加入质量百分比浓度为2％的氯化钙溶液，其中混合液与氯化钙溶液按体积比1︰3.5，充分混合于15℃下静置，硬化10h，经过滤洗涤后，得到固定化细胞。取1g所得的固定化细胞，加入10ml5mol/lna2s的溶液中，于28℃、ph7.0下反应40h，取1ml反应液测定酶活；定义一个酶活单位为：在上述条件下，每小时催化na2s生成1μmol单质硫所需的酶量。
经测定，固定化后细胞活性相对游离细胞的活性为85.8％。