一种山羊MYLK4基因CNV标记的检测方法及其应用与流程

本发明属于遗传育种领域，具体涉及一种mylk4基因拷贝数变异(cnv)标记的检测方法及其在提高山羊生长性状的分子育种中的应用。

背景技术：

随着基因组学和生物信息学等相关学科的迅猛发展，动物遗传育种的理论和技术也发生了重大的变化，即逐渐由传统的常规表型选育转向分子选育。目前，分子育种的研究主要集中在标记辅助选择(molecularmark-assistselection,mas)，该技术是通过dna分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良。在畜禽育种中，通过对生长性状密切相关，并且与数量性状紧密关联的dna标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。

拷贝数变异(copynumbervariations,cnvs)是指基因组中大于50bp到数mb之间的片段插入、缺失复制和复杂的重组的现象。cnvs作为一种基因组亚显微水平结构变异类型，可以通过剂量效应、位置效应、阻断功能基因、融合基因、暴露隐性等位基因和潜在的跃迁效应来影响基因的功能以及个体的表型。在检测已知cnv的各种方法中，qpcr是使用比较广泛的一种技术。该方法操作简单、敏感性高、速度快。其在pcr中选取单拷贝的基因，作为内参基因，然后利用2-^δδct的方法判定个体的拷贝数变异类型以及相对拷贝数。

mylk4基因作为mylk家族中的重要成员，依赖于ca²⁺/钙调蛋白(cam)的调节，能够有选择性地和非共价地与atp相互作用，发生蛋白质磷酸化，即使肌球蛋白调节性轻链(myosinregulatorylightchain,rlc)磷酸化，rlc的磷酸化可提高肌球蛋白atpase活性，进而调控基于肌动蛋白与肌球蛋白之间的相互作用和细胞骨架活动，引起收缩活性，因此，mylk4在肌肉收缩、细胞运动、损伤修复、细胞凋亡、分泌活动、上皮细胞通透性改变、细胞内信号转递和血小板形态的改变等方面起着重要的作用。目前相关研究表明，mylk4与心力衰竭、小肠蠕动失弛缓症、肉牛的生长发育等病理、生理有着密切的联系。关于mylk4基因的功能，根据在人和小鼠上所做的研究，发现其对细胞生长的调控以及疾病发作上有重要影响，但在山羊上的报道较少。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种山羊mylk4基因cnv标记的检测方法及其应用。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种检测山羊mylk4基因cnv标记的方法，包括以下步骤：以提取自待测山羊(例如，努比亚山羊和黑山羊)的耳组织的全基因组dna为模板，以引物对p1和p2分别通过实时荧光定量pcr(qpcr)技术扩增山羊mylk4基因的拷贝数变异区域和山羊mc1r基因的部分片段，其中基于引物对p2的扩增在定量中起对照作用，然后根据定量结果鉴定山羊mylk4基因的拷贝数变异类型。

优选的，所述的cnv标记位于mylk4基因候选区域chr23：1453501-1455500(参考序列：nc_030830.1)的拷贝数变异区域。

优选的，根据log22^-δδct(即-δδct)将拷贝数变异类型分为：插入型，log22^-δδct>0.5；缺失型，log22^-δδct<-0.5；或正常型，log22^-δδct≤|±0.5|。

优选的，所述的引物对p1为：

上游引物f：5’-cattgaagggggacagccatc-3’；

下游引物r：5’-aggctgttagcacttgcggga-3’。

优选的，所述的引物对p2为：

上游引物f：5’-ctcgttggcctcttcatagc-3’；

下游引物r：5’-gaagttcttgaagatgcagcc-3’。

优选的，所述的实时定量pcr所用的扩增反应体系以12.5μl计，包括：10ng/μl模板dna1μl、10μmol/l的引物对p1或引物对p2所对应的上、下游引物各0.5μl以及premixextaq^tmii6.25μl和ddh2o4.25μl。

优选的，所述的实时定量pcr所用的反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火1min，共40个循环。

优选的，基于引物对p1扩增的pcr产物片段大小为129bp，基于引物对p2扩增的pcr产物片段大小为267bp。

上述检测山羊mylk4基因cnv标记的方法在山羊分子标记辅助选择育种中的应用。

优选的，所述拷贝数变异类型中，具有缺失型的个体在生长性状上较优。

优选的，所述生长性状为体重、体高、体长或胸围。

本发明的有益效果体现在：

本发明提出了一种检测山羊mylk4基因拷贝数变异的方法，该方法利用基因组dna实时定量pcr，以mc1r基因为参照，根据2^-δδct值即可确定个体mylk4基因拷贝数变异的类型。与现有技术相比，本发明有以下优点：

(1)本发明提供的山羊mylk4基因拷贝数变异检测方法，不受年龄的限制，可用于早期选育，甚至在刚出生时就可进行选择；

(2)检测山羊mylk4基因拷贝数变异的方法准确可靠、操作简便；

(3)山羊mylk4基因拷贝数变异位点的拷贝数变异类型的检出，为山羊生长发育的分子标记辅助选择提供科学依据。

本发明根据山羊mylk4基因候选区域chr23:1453501-1455500内的拷贝数变异，以待测山羊的基因组dna为模板，利用实时荧光定量pcr检测基因组中所新发现的cnv，根据log22-δδct将定量结果分为三类：即拷贝数变异类型分别为插入型、缺失型和正常型。根据山羊基因组cnv的检测结果，在山羊mylk4基因具有缺失型拷贝数变异类型的个体在生长性状上较优。根据本发明的实施例，以山羊mylk4基因候选区域chr23:1453501-1455500为候选位点，通过实时荧光定量pcr技术检测该位点在努比亚山羊和黑山羊群体中的拷贝数变异情况，并与体重、体高、体长和胸围等重要经济性状进行关联分析；如果检测山羊个体mylk4基因候选位点的cnv类型为缺失型，则山羊个体体高和体长显著优于其他类型的个体。

附图说明

图1为利用普通pcr扩增验证引物对p1扩增产物的特异性的电泳图谱：泳道1为marker，泳道2为引物对p1扩增的目标序列。

图2为本发明中进行qpcr绘制的扩增曲线。

图3是本发明中进行qpcr绘制的溶解曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

本发明利用实时荧光定量pcr对山羊mylk4基因的拷贝数变异进行检测并用于分子育种，包括以下步骤：

(1)利用ncbi数据库找到mylk4基因序列，再用primer5软件进行引物设计，并用普通pcr检测引物；

(2)采用实时荧光定量pcr(qpcr)技术检测候选位点在群体中的拷贝数变异情况，筛选到与山羊生长性状相关的cnv标记；

(3)利用spss23.0软件将拷贝数变异类型与山羊生长性状等进行关联分析；

(4)根据拷贝数变异类型进行生长性状优异的山羊选育。

1、山羊样本采集

本发明具体以努比亚山羊和黑山羊共226头作为检测对象，2个品种耳组织均采集自贵州省毕节市(2017年7月采集)，并记录他们的生长性状数据，如体重、体高、体长、胸围等，以用于后续的关联分析。

2、耳组织基因组dna的提取

(1)取30mg组织样品放入2.0ml离心管，用手术剪将组织样剪碎呈粉末状。

(2)每只离心管内加入600μlse缓冲液和20μl的蛋白酶k(20mg/ml)，经37℃水浴过夜消化12～16h。

(3)加入200μl的6mol/lnacl充分混匀后，加入1ml的tris饱和酚，温和摇动20min，使其充分混匀，4℃，12000r/min离心10min，将上层水相转入另一灭菌的2.0ml离心管。

(4)加入0.5ml的tris饱和酚和0.5ml的氯仿，充分混合20min，4℃，12000r/min离心10min，将上层水相转入另一灭菌的2.0ml离心管。

(5)加入1ml氯仿，充分混合20min，4℃，12000r/min离心10min，将上层水相转入另一灭菌的1.5ml离心管。

(6)加入1ml预冷无水乙醇(–20℃)，充分混匀至絮状沉淀析出，放置–20℃下30min。

(7)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％的冰冷乙醇漂洗dna沉淀2次。

(8)4℃，12000r/min离心10min，弃上清液，室温下使乙醇挥发干净。

(9)干燥后的dna溶液中加入80～100μl的te溶解，4℃保存直至dna完全溶解，利用紫外分光光度仪泳检测其质量，-80℃保存，作为模板dna。

3、目的基因及内参基因的扩增用特异性引物的设计

以ncbi数据库公布的山羊mylk4基因(目的基因)序列(nc_030830.1)为参考序列，根据参考序列，测序中筛选出的存在拷贝数变异区域即mylk4基因序列的1453501bp-1455500bp区域，利用primer5.0设计扩增目的基因中一段129bp的序列的qpcr引物(引物对p1)，设计完成时间为2018年1月，根据实时荧光定量pcr引物对(引物对p1)扩增结果检测mylk4基因拷贝数变异，同时，以ncbi所公布的山羊mc1r基因序列(nc_030825.1)为参考序列，采用相同的方法设计扩增内参基因(山羊mc1r基因)中一段267bp的序列的qpcr引物(引物对p2)，设计完成时间为2018年1月。引物对序列信息如表1所示。

表1.实时荧光定量pcr的引物信息

注：f表示上游引物，r表示下游引物。

参见图1，利用普通pcr扩增和1％的琼脂糖电泳验证了引物对p1扩增产物的特异性。通过绘制扩增曲线(图2)和溶解峰(图3)确定引物适用于qpcr分析。

4、实时定量pcr

实时定量pcr所用的扩增体系以12.5μl计为：10ng/μl模板dna1μl、10μmol/l的引物对p1或引物对p2所对应的上、下游引物各0.5μl以及premixextaqtmii6.25μl和ddh2o4.25μl。

引物对p1、引物对p2所对对应的实时定量pcr的反应程序均为：(1)95℃预变性10min；(2)95℃变性15s，60℃退火1min，共40个循环。定量结果如图2、图3所示。

5、个体拷贝数变异类型判定

每个样品分别用目标序列和内参序列的引物进行扩增，并且每对引物设定3个重复。根据2^-δδct方法进行拷贝数的分析。其中δδct＝(ct实验组目的基因-ct实验组内参基因)-(ct对照组目的基因-ct对照组内参基因)。实验组即为待检测有无cnvs的样本，对照组即为已知无拷贝数变异的样本。2^-δδct表示的是实验组目标序列的拷贝数相对与对照组的倍数。

根据公式计算得出每个待测个体的-δδct，并根据cnv类型的判定标准：-δδct>0.5为gain类型(插入型)；-0.5≤-δδct≤0.5为normal类型(正常型)，-δδct<-0.5为loss类型(缺失型)，判定检测的山羊个体的cnv类型。

6、关联分析

关联分析模型：在数据处理中，根据影响体尺性状指标的因素的不同，考虑到环境效应、年龄、品种、遗传效应及其互作效应，采用固定模型进行分析，同时根据实际情况进行简化；根据数据特征，应用spss23.0软件分析各基因型间的生产性状效应。固定模型为：

yijk＝μ+ai+gj+eijk

其中：yijk为性状观察值，μ为总体均值，ai为第i头个体的年龄，gj为第j个拷贝数变异类型的固定效应，eijk为随机误差。各组数据间的差异性采用lsd多重比较进行检验，试验结果以mean±se形式表示。数据处理的结果如表2所示。

表2.山羊mylk4基因拷贝数变异与生长性状的关联性分析

注：平均值肩标上具有相同字母表示差异不显著(p>0.05)，平均值肩标上字母不同表示差异显著(p<0.05)。*p<0.05。括号里面的数值表示拷贝数类型的频率。

关联分析结果表明(见表2)：在mylk4具有缺失型(loss)拷贝数变异类型的山羊个体在生长性状上较优，并且拷贝数变异位点与体高、体长这两个生长性状具有显著的相关性。因此，mylk4基因的loss类型可以作为一个提高山羊生长性状的候选分子遗传标记(cnv标记)，加快山羊优良品种的选育进程。

<110>西北农林科技大学

<120>一种山羊mylk4基因cnv标记的检测方法及其应用

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<213>人工合成

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