一株高效降解氯苯的苍白杆菌ZJUTCB-1及其应用的制作方法

本发明属于环境污染物生物处理技术领域，具体涉及一株具有氯苯高效降解能力的苍白杆菌ochrobacterumsp.zjutcb-1及其在降解氯苯中的应用。

背景技术：

氯苯是最简单的氯代芳烃，不溶于水，物理化学性质稳定，难以自然降解,广泛应用于工农业生产，基础有机溶剂及有机化合物的合成，同时也是医药、染料、农药和工程塑料等领域的重要中间体。氯苯对动物皮肤、结膜和呼吸器官会产生刺激作用，抑制神经中枢，损害肝脏和肾脏。氯苯还具“三致”效应。基于以上危害性，氯苯已被美国环境保护署(epa)列为优先污染物。我国于1989年4月也将氯苯列入了优先污染物“黑名单”。

近年来，国内外研究者针对氯苯的去除做了大量的研究工作，探究出了一些具体的处理方法包括催化氧化、电化学、超声波降解、吸附等物理化学方法，但处理条件苛刻、投资高、很难规模处理，较适用于预处理或后处理。生物处理法因具有处理效果显著，易操作，成本低，无二次污染等优点，近年来被广泛应用。常见的生物处理工艺有生物过滤、生物滴滤、生物洗涤、膜生物反应器。这些生物技术解决了生物反应器的配置问题，但生物法处理氯苯的核心问题——高效氯苯降解微生物的筛选。从上世纪80年代至今，国内外大量学者从污泥、水体、土壤中筛选出一些氯苯降解微生物，包括psudomonassp.strainwr1306、p.putida&bacillussp.、escherichiahermanii、pseudomonassp.strainjs150、ralstoniasp.strainjs705、aeromonassp.、pseudomonassp.strainfy01&fy04、bacillussp.strainfy02&fy03、pseudononassp.nov.lp01等，上述微生物可在好氧或厌氧条件下降解该污染物，但不能同时在好氧和厌氧条件下保持高效性，而且降解率低(好氧和厌氧条件下，18d内对氯苯的降解率分别为50％和37.2％)，不符合工业的高效率生产的要求。而厌氧降解又是氯苯类化合物重要的降解方式。许多在好氧条件下难以降解的化合物在厌氧条件下能变得容易降解。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中的不足而提供一株可在好氧、厌氧及兼性条件下快速、高效、耐受能力强的氯苯降解苍白杆菌(ochrobacterumsp.zjutcb-1)并提供其在实际应用中的最优条件。本发明的苍白杆菌(ochrobacterumsp.zjutcb-1)在好氧条件下对氯苯的平均降解速度高达174.85μmol/(l·h)(19.67mg/(l·h))；在厌氧条件下对氯苯的平均降解速度高达210.38μmol/(l·h)(23.67mg/(l·h))。该细菌生长条件温和，易扩大培养，能在好氧、厌氧及兼性条件下降解氯苯，在含氯苯的工业废水废气的绿色高效净化中具有良好的应用前景。

本发明采用的技术方案：

本发明提供一株具有兼性厌氧降解氯苯等有机污染物能力的苍白杆菌(ochrobacterumsp.)zjutcb-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2018490，保藏日期2018年7月20日，地址：中国-武汉-武汉大学，430072。本发明苍白杆菌zjutcb-1基本特征是：菌落呈淡黄色，边缘整齐，表面光滑湿润，不透光，易挑取。在透射电镜下观察该菌体的形态为具有平行边和圆端的杆菌(约为1.2μm×0.37μm)，无鞭毛，革兰氏染色阴性。

本发明还提供一种所述苍白杆菌zjutcb-1在降解有机污染物中的应用，所述有机污染物包括甲苯、对二甲苯、氯苯、1,2-二氯苯或正己烷，所述的应用方法为：将苍白杆菌zjutcb-1接种至无机盐培养液中，加入有机污染物，在25-35℃、160rpm、ph＝6-8条件下进行降解反应，实现对有机物的降解；所述无机盐培养液组成：0.66g/l(nh4)2so4，0.11g/lmgso4，0.12g/lk2so4，8.8g/lna2hpo4，4.56g/lnah2po4，1.25ml/l微量元素溶液，0.62ml/l维生素溶液，溶剂为去离子水，ph＝7；所述微量元素溶液配方：1.5g/l氨基三乙酸，3g/lmgso4，0.5g/lmnso4·h2o，1g/lnacl，0.1g/lfeso4·7h2o，0.1g/lcacl2·2h2o，0.1g/lcocl2·6h2o，0.13g/lzncl2，0.01g/lcuso4·5h2o，0.01g/lalk(so4)2·12h2o，0.01g/lh3bo3，0.025g/lna2moo4，0.024g/lnicl2·6h2o，0.025g/lna2wo4·2h2o，溶剂为去离子水；所述维生素溶液配方：0.2g/l生物素，0.2g/l叶酸，1g/l盐酸吡哆辛，0.5g/l核黄素，0.5g/l硫胺，0.5g/l烟酸，0.5g/l泛酸，0.01g/lb-12，0.5g/l对氨基苯甲酸，0.5g/l硫辛酸，溶剂为去离子水。

所述苍白杆菌zjutcb-1接种量以细胞干重计为20-70mg/l(优选24-54mg/l，更优选39-54mg/l)，所述有机污染物终浓度为300-3000μmol/l(优选300-1500μmol/l)。

本发明所述苍白杆菌zjutcb-1在接种至无机盐培养液前先进行扩大培养，然后以种子液的形式接种至无机盐培养液进行驯化培养；将驯化后的菌液再以细胞干重计的接种量接种至无机盐培养液进行降解反应。所述扩大培养方法为：将苍白杆菌zjutcb-1接种至lb培养基，30℃，160rpm培养至对数期，将培养液离心，沉淀用无菌无机盐培养液洗涤3次后重悬，即为种子液；将种子液以细胞干重计39mg/l的接种量接种至含无机盐培养液的血清瓶中，加入终浓度987μmol/l氯苯作为唯一碳源，血清瓶用聚四氟乙烯瓶塞密封后，于30℃，160rpm摇床驯化48h。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明提苍白杆菌zjutcb-1能够降解氯苯及其他工业常见的有机污染物，例如甲苯、对二甲苯、1,2-二氯苯，正己烷等。苍白杆菌zjutcb-1在好氧条件下可降解初始浓度347.31-2604.80μmol/l的氯苯，去除率为100％，平均降解速度高达174.85μmol/(l·h)(19.67mg/(l·h))。厌氧条件下，对初始浓度为347.31-1736.53μmol/l的氯苯，去除率为100％，对初始浓度为2604.80μmol/l的氯苯，去除率为88.24％，平均降解速度高达210.38μmol/(l·h)(23.67mg/(l·h))。本发明苍白杆菌zjutcb-1能实现工业废水废气中氯苯的高效净化，污染低，容易推广，净化成本低。

附图说明

图1为ochrobacterumsp.zjutcb-1在lb培养基上菌落形态照片。

图2为ochrobacterumsp.zjutcb-1的透射电镜图。

图3为ochrobacterumsp.zjutcb-1的系统发育树。

图4为好氧条件下zjutcb-1降解不同浓度氯苯(a)及其生长曲线(b)。

图5为厌氧条件下zjutcb-1降解不同浓度氯苯(a)及其生长曲线(b)。

图6为好氧条件下不同初始浓度zjutcb-1对氯苯的降解(a)及其生长曲线(b)。

图7为厌氧条件下不同初始浓度zjutcb-1对氯苯的降解(a)及其生长曲线(b)。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：ochrobacterumsp.zjutcb-1的分离纯化、鉴定及保藏。

1.ochrobacterumsp.zjutcb-1的筛选

ochrobacterumsp.zjutcb-1是从杭州七格污水处理厂的活性污泥中驯化、分离得到的一株革兰氏阴性菌。具体步骤如下：

在340ml血清瓶中加入200ml无机盐培养液，通入高纯氮气(40ml/min)30min，以去除无机盐培养液中的溶解氧和血清瓶顶部的空气，加入20ml活性污泥和987μmol/l的氯苯，在30℃，160rpm进行富集培养。待氯苯的浓度为初始浓度的50％时，从中取出20ml富集液加至200ml新鲜的无机盐培养液中，再加入987μmol/l氯苯，30℃，160rpm厌氧培养至氯苯的浓度为初始浓度的50％。重复上述富集过程5次后，将最后一次富集液梯度稀释涂布至无机盐固体培养基，加入5μl氯苯作为唯一碳源。选择单菌落在lb固体培养基中划线分离纯化至有明显的单一纯种菌落(图1)。将备选菌株扩大培养后加入无机盐培养基，菌液接种量以细胞干重计39mg/l，并加入终浓度987μmol/l氯苯作为唯一碳源及能源，在30℃，160rpm培养进行验证，得到目的菌株zjutcb-1，通过透射电镜确定其外部形态(图2)。

无机盐培养液配方：(nh4)2so40.66g/l，mgso40.11g/l，k2so40.12g/l，na2hpo48.8g/l，nah2po44.56g/l，微量元素溶液1.25ml/l，维生素溶液0.62ml/l，溶剂为去离子水，ph＝7。

微量元素溶液配方：1.5g/l氨基三乙酸，3g/lmgso4，0.5g/lmnso4·h2o，1g/lnacl，0.1g/lfeso4·7h2o，0.1g/lcacl2·2h2o，0.1g/lcocl2·6h2o，0.13g/lzncl2，0.01g/lcuso4·5h2o，0.01g/lalk(so4)2·12h2o，0.01g/lh3bo3，0.025g/lna2moo4，0.024g/lnicl2·6h2o，0.025g/lna2wo4·2h2o，溶剂为去离子水。

维生素溶液配方：0.2g/lbiotin(生物素)，0.2g/lfolicacid(叶酸)，1g/lpyridoxinehcl(盐酸吡哆辛)，0.5g/lriboflavin(核黄素)，0.5g/lthiamine(硫胺)，0.5g/lnicotinicacid(烟酸)，0.5g/lpanthotenicacid(泛酸)，0.01g/lb-12，0.5g/lp-aminobenzoicacid(对氨基苯甲酸)，0.5g/lthiocticacid(硫辛酸)，溶剂为去离子水。先将无机盐培养液110℃灭菌40min后，在超净台中加入微量元素溶液和维生素溶液，于室温放置2天，确定无杂菌生长。

无机盐固体培养基是在无机盐培养液中添加16～20g/l琼脂。

lb固体培养基配方：5g/l酵母粉，10g/lnacl，10g/l蛋白胨，16～20g/l琼脂，溶剂为去离子水，ph＝7。

上述所有培养液需要经高温高压灭菌后使用，微量元素溶液和维生素溶液使用前经0.22μm滤膜过滤后于超净工作台内转移到无菌无机盐培养液中。

分离纯化并鉴定的菌株zjutcb-1有三种保藏形式(1)4℃lb斜面，每3个月需进行转接；(2)-80℃，30％甘油与lb菌液1:1混合；(3)菌种保藏中心冷冻干燥长期保存。

该菌在应用于氯苯废水/废气处理之前需活化，活化方法为：将低温保存的菌样常温解冻，涂布/划线于lb固态培养基中，挑单菌落转接2-3次。

2.菌株zjutcb-1的鉴定

通过16srrna序列分析和生理生化实验鉴定，确定该菌株zjutcb-1为ochrobacterumsp.，具体步骤如下：

采用ezup柱式细菌基因组dna抽提试剂盒(生工生物工程股份有限公司)提取和纯化菌株的dna，4℃保存。用细菌的通用引物对纯化的dna进行pcr扩增，引物分别为7f(cagagtttgatcctggct)和1540r(aggaggtgatccagccgca)，pcr反应程序设定为94℃预变性4min，然后94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，循环30个周期，最后72℃修复延伸10min。将pcr产物纯化回收后进行测序(上海生物工程股份有限公司)，测序结果(见seqidno.1所示)上传至ncbi，获得登录号mh910616，同时同ncbi中的基因序列进行同源性比较，发现其属于ochrobacterum属，与ochrobacterumanthropiatcc49188的同源性为98％(图3)，将该菌株命名为苍白杆菌(ochrobacterumsp.)zjutcb-1，并于2018年7月20日在中国典型培养物保藏中心(中国-武汉)进行专业保存，保藏号为cctccno：m2018490。

实施例2：ochrobacterumsp.zjutcb-1的活化及好氧条件下对不同浓度氯苯的降解

在最佳环境因子条件(培养液ph＝7，培养温度30℃)下，考察了菌株zjutcb-1在好氧条件下，对初始浓度347.31-2604.80μmol/l氯苯的降解性能和细菌生长情况。结果表明，菌株能完全降解347.31-2604.80μmol/l的氯苯，平均速度为82.27-174.85μmol/(l·h)，氯苯被完全利用后，细菌zjutcb-1的质量也明显增加，具体实施步骤如下：

配制无机盐培养液(同实施例1)，用氢氧化钠或稀盐酸溶液调试ph至7，分装于平均体积为340ml的血清瓶中，每瓶50ml。

将菌株zjutcb-1接种至lb培养基，30℃，160rpm培养至对数期，将培养液离心，沉淀用无菌无机盐培养液洗涤3次后重悬，即为种子液。

取种子液接种至含无机盐培养液的血清瓶中，种子液接种量以细胞干重计39mg/l，加入987μmol/l氯苯作为唯一碳源，血清瓶用聚四氟乙烯瓶塞密封后，于30℃，160rpm摇床驯化48h。取驯化后的菌液分装于含有50ml无机盐培养液的340ml血清瓶中，菌液接种量以细胞干重计39mg/l，加入氯苯作为唯一碳源，并使其浓度分别达到347.31，520.96，868.27，1215.57，1736.53，2604.80μmol/l，血清瓶用聚四氟乙烯瓶塞密封后置于30℃，160rpm摇床培养，以相同条件下不加菌株zjutcb-1为对照。定时测定血清瓶中氯苯浓度及生物量，绘制降解曲线，并计算相应的平均降解速度，结果见图4中a、b。

图4中(a)、(b)为好氧条件下，菌株对不同初始浓度氯苯的降解和菌体的自身生长情况。结果表明，当氯苯浓度低于(包括)1736.53μmol/l时，zjutcb-1可以在14h内快速降解完添加的底物，同时细菌质量也明显增加，底物的浓度逐渐降低和细菌的大量繁殖，使得平均降解速度高达109.59，82.27，120.09，170.92，174.85μmol/(l·h)，随着底物浓度的增加，完全降解底物所需要的时间越长；当氯苯的浓度增高至2604.80μmol/l时，该菌初始16h对底物的降解较慢，这是因为高浓度的底物抑制了微生物的生长，使其生长受到限制，zjutcb-1不能在这段时间内大量繁殖，随后底物对细菌的抑制作用逐渐解除，菌快速降解氯苯。氯苯降解过程中大部分底物被用于微生物自身生长。

实施例3：ochrobacterumsp.zjutcb-1的活化及厌氧条件下对不同浓度氯苯的降解

在最佳环境因子条件(培养液ph＝7，培养温度30℃)下，考察了菌株zjutcb-1在厌氧条件下，对初始浓度347.31-2604.80μmol/l氯苯的降解性能和细菌生长情况。结果表明，菌株能完全降解347.31-1736.53μmol/l氯苯，平均速度为97.39-210.38μmol/(l·h)，当氯苯浓度高达2604.80μmol/l时，该菌也可以在32h内完成88.24％的去除，平均去除速度为102.47μmol/(l·h)。氯苯被完全利用后，细菌zjutcb-1的质量也明显增加，具体实施步骤如下：

种子液的制备同实施例2。在50ml无机盐培养液中通入氮气30min以确保厌氧环境。取种子液接种至厌氧无机盐培养液中，种子液接种量以细胞干重计39mg/l，加入987μmol/l氯苯作为唯一碳源，血清瓶用聚四氟乙烯瓶塞密封后，于30℃，160rpm摇床驯化48h。取驯化后的菌液分装于含有50ml厌氧无机盐培养液的340ml的血清瓶中，使得菌浓度达到39mg/l(以细胞干重记)，加入氯苯作为唯一碳源，并使其浓度分别达到347.31，520.96，868.27，1215.57，1736.53，2604.80μmol/l，置于30℃，160rpm摇床培养，并做不加细菌的空白对照。定时测定血清瓶中的氯苯浓度及生物量，绘制菌株对于不同初始浓度氯苯的降解曲线，并计算相应的平均降解速度，结果见图5所示。

图5中(a)、(b)为厌氧条件下，菌株对不同初始浓度氯苯的降解和菌体的自身生长情况。结果表明，当氯苯浓度低于(包括)1215.57μmol/l时，zjutcb-1可以在8h内快速降解所添加的底物，同时细菌的质量也明显增加。底物的逐渐减少和细菌的大量繁殖，使得平均降解速度高达97.39，102.69，157.51，210.38μmol/(l·h)，随着底物浓度的增加，完全降解底物所需要的时间越长；当氯苯的浓度增高至1736.53μmol/l时，该菌初始9h对底物的降解较慢，这是因为高浓度的底物抑制了微生物的生长，zjutcb-1不能在这段时间内大量繁殖，但随着菌体质量增加，底物对细菌的抑制作用逐渐解除，开始快速降解氯苯。由于大部分底物被用于微生物自身生长，因此随着底物量增加，最终所得微生物质量也增加。

实施例4：不同浓度ochrobacterumsp.zjutcb-1在好氧条件下对氯苯的降解

在最佳环境因子条件(培养液ph＝7，培养温度30℃)下，考察了不同初始浓度zjutcb-1在好氧条件下对868.27μmol/l氯苯的降解性能和细菌增长情况。结果表明，在50ml反应系统，初始菌体浓度维持在54mg/l较为合理，具体实施如下：

种子液的制备和驯化过程同实施例2，将驯化后的菌液在无菌条件下加入到无机盐培养液中使其初始浓度(以细胞干重计)分别达到24，39，54，62，70mg/l，随后加入868.27μmol/l氯苯作为唯一碳源，按实施例2密封、培养、定时检测细菌对氯苯的降解情况及细菌生长情况，结果见图6所示。

结果如图6中(a)、(b)所示，好氧条件下，868.27μmol/l氯苯可以在5-14h内被完全降解，初始加入的细菌的量对降解速度有明显的影响，初始菌体浓度为24，39，54mg/l时，平均降解速度为96.36，120.09，194.67μmol/(l·h)，当菌体浓度增加至62，70mg/l时，降解速度也有所提升，但提升量减小，这是因为菌体浓度过大时，环境中除了碳源外，其他因子也成为限制因素(无机元素、微量元素、溶解氧等)。(b)显示若底物被完全降解则生物量不再增加，而且会在短时间减少，可能是因为此时细胞开始死亡、裂解。

实施例5：不同浓度ochrobacterumsp.zjutcb-1在厌氧条件下对氯苯的降解

在最佳环境因子条件(培养液ph＝7，培养温度30℃)下，考察了不同初始浓度zjutcb-1在厌氧条件下对868.27μmol/l氯苯的降解和细菌增长情况。结果表明，在50ml反应系统，初始菌体浓度维持在39mg/l较为合理。具体实施如下：

种子液的制备和驯化过程同实施例3，将种子液在无菌条件下加入到厌氧的无机盐培养液中使其初始浓度达到24，39，54，62，70mg/l，随后加入868.27μmol/l氯苯作为唯一碳源，按实施例3密封、培养、定时检测细菌对氯苯的降解情况及细菌生长情况，结果见图7所示。

结果如图7中(a)、(b)所示，厌氧条件下，868.27μmol/l氯苯可以在5-13h内被完全降解，初始加入的细菌的量对降解速度有明显的影响，初始菌体浓度为24，39mg/l时，平均降解速度为94.29，157.51μmol/(l·h)，虽然菌体浓度增加至54，62，70mg/l时，降解速度也有所提升，但是促进作用减小，这是因为菌体浓度过大时，环境中除了碳源外，其他因子也成为限制因素(无机元素、微量元素等)。

实施例6：ochrobacterumsp.zjutcb-1对工业常见有机污染物降解性能探究

分别以甲苯、对二甲苯、1,2-二氯苯，正己烷这些工业中常见的有机污染物作为唯一碳源，考察该菌株zjutcb-1对这些有机物是否有降解能力。结果表明，菌株能降解这些有机污染物。具体实施方案如下：

按实施例2的方法制备并驯化种子液，取驯化后的菌液接种至含无机盐培养液的血清瓶中，种子液接种量以细胞干重计39mg/l，加入表1底物作为唯一碳源，血清瓶用聚四氟乙烯瓶塞密封后，于30℃，160rpm摇床驯化48h。以相同条件下不加菌株zjutcb-1为对照。定时测定血清瓶中菌体浓度，结果见表1所示。

表1ochrobacterumsp.zjutcb-1对其他vocs的去除情况

虽然本发明已以实施例公开如上，但其并非用以限定本发明的保护范围，任何熟悉该项技术的技术人员，在不脱离本发明的构思和范围内所作的更动与润饰，均应属于本发明的保护范围。

序列表

<110>浙江工业大学

<120>一株高效降解氯苯的苍白杆菌zjutcb-1及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1425

<212>dna

<213>苍白杆菌(ochrobactrumsp.)

<400>1

ctggctcagaacgaacgctggcggcaggcttaacacatgcaagtcgagcgccccgcaagg60

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